專利名稱：一種雙鏈rna的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種雙鏈RNA的制備方法，具體是利用大腸桿菌發(fā)酵制備雙鏈RNA樣品，該雙鏈樣品可用作甲殼動物的RNA干擾。
背景技術：
RNA干擾(RNAi)是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發(fā)的序列特異性基因沉默現(xiàn)象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達。當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默，是研究多種生物基因功能的有效手段。RNAi技術作為新興的基因阻抑方法，在功能基因組學、微生物學、基因表達 調(diào)控機理研究等領域得到了廣泛應用。目前，主要利用小干擾RNA(SiRNA)進行基因干擾，已在擬南芥、秀麗新小桿線蟲、黑腹果蠅、斑馬魚和小鼠等生物中應用。現(xiàn)階段，體外制備siRNA的方法各有優(yōu)缺點化學合成方法能制備高質(zhì)量的siRNA，但價格高，定制周期長；體外轉錄方法合成siRNA，成本相對較低，但實驗的規(guī)模和量受到限制。甲殼動物的免疫系統(tǒng)是開放式循環(huán)系統(tǒng)，不存在免疫球蛋白，缺乏抗體介導的免疫反應，其免疫機制以非特異性免疫為主。因此，體外人工合成的長鏈雙鏈RNA可以進入動物體內(nèi)，沉默目的基因，下調(diào)相應蛋白表達水平，快速而經(jīng)濟地開展某個基因功能缺失的表型研究。利用大腸桿菌發(fā)酵制備雙鏈RNA樣品，可在短時間內(nèi)高效快捷的生產(chǎn)大量長鏈雙鏈RNA，既縮短了化學合成所需的制備周期，降低了高額的費用，又突破了體外轉錄的規(guī)模限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種雙鏈RNA的制備方法，該方法適于甲殼動物RNA干擾時使用。本發(fā)明為解決上述技術問題所采取的技術方案步驟如下
步驟(I).基因克隆利用PCR擴增的方法克隆目的基因分子。根據(jù)目的基因分子的cDNA序列設計帶有酶切位點的正向引物和反向引物。以目的基因分子的cDNA序列為模板，進行PCR擴增，克隆目的基因分子，得到PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，得到純化后的PCR產(chǎn)物。步驟⑵.載體構建利用pET-T7質(zhì)粒構建含有目的基因片段的表達載體。純化后的PCR產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，得到目的基因的酶切產(chǎn)物和PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。目的基因的酶切產(chǎn)物和PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒純化，得到純化后目的基因的酶切產(chǎn)物和純化后PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。利用DNA連接試劑盒連接純化后目的基因的酶切產(chǎn)物和純化后PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。將連接后的產(chǎn)物轉入感受態(tài)細胞疋coli DH5a中，涂板，30 37°C培養(yǎng)12 24小時。挑選陽性單菌落進行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳分析。選取含有目的基因片段的陽性單菌落，測序分析插入基因片段序列的正確性，得到含有正確基因片段插入的單菌落。步驟(3).載體轉化
挑取經(jīng)鑒定含有正確基因片段插入的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 37°C條件下培養(yǎng)12 24小時，離心得到沉淀。利用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提沉淀菌體中的PET-T7表達載體，凝膠電泳檢測抽提產(chǎn)物。將含有基因片段插入的PET-T7表達載體轉化到表達型菌株疋coli HT115中，涂板培養(yǎng)，挑選陽性菌落進行PCR檢測，凝膠電泳分析，選取含有目的載體的陽性菌落，保存待用。此處的含有目的載體的陽性菌落為攜帶PET-T7載體的
B.coli HTl 15 單菌落。 步驟⑷.雙鏈RNA的誘導表達
將攜帶PET-T7載體的疋coli HTl 15單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 37°C條件下培養(yǎng)12 24小時。以1:20 1:50的比例擴大培養(yǎng)至OD600=O. 4 I. O。在LB液體培養(yǎng)基中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2 I. 0mmol/L,30 37°C誘導培養(yǎng)2 8小時。離心收集細菌沉淀，磷酸緩沖液漂洗，得到漂洗后的細菌沉淀，保存待用。所述的LB液體培養(yǎng)基為含有10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/l氯化鈉和50 μ g/ml氨芐青霉素的水溶液，pH為7. 4 ;
所述的酵母提取物采用常規(guī)現(xiàn)有產(chǎn)品，可經(jīng)市場購買取得；
所述的磷酸緩沖液為含有8g/l氯化鈉NaCl、0. 2g/l氯化鉀KC1、1. 38g/l磷酸氫二鈉Na2HP04、0. 24g/l 磷酸二氫鉀 KH2PO4 的水溶液，pH 為 7. 4。步驟(5).雙鏈RNA的純化
總RNA抽提取漂洗后的細菌沉淀，利用Trizol試劑盒提取漂洗后的細菌沉淀中的總
RNA ；
變性將提取的總RNA溶解于核糖核酸酶A (RNase A)緩沖液中，80 90°C變性5 15分鐘，得到變性溶液；
復性將變性溶液置于水浴中冷卻至常溫，使得變性溶液復性，得到復性后的溶液；酶切在復性后的溶液中加入RNase A進行酶切，加至RNase A在復性后的溶液中的終濃度為10 50 μ g/ml，在35 37°C條件下反應10 60分鐘，去除單鏈RNA，得到酶切后產(chǎn)物，電泳檢測酶切效果；
純化在酶切后產(chǎn)物中加入與酶切產(chǎn)物等量體積的酚氯仿溶液，充分混勻，離心取上清液。在上清液中加入2 3倍上清液體積的無水乙醇，充分混勻，靜置，沉淀雙鏈RNA，離心收集沉淀物；用70 75 %乙醇充分洗滌，離心收集沉淀，自然干燥；
溶解加入滅菌水溶解沉淀，所得溶液即為純化后的雙鏈RNA樣品。凝膠電泳檢測雙鏈RNA樣品，分光廣度計法測定核酸樣品濃度，-30 -20°C保存待用。所述的核糖核酸酶A緩沖液為含300 mmol/L的醋酸鈉NaAc、10 mmol/L的三輕甲基氨基甲烷鹽酸Tris-HCl的水溶液，pH為8. O。所述的酚氯仿溶液為pH 4. O 6. O的酸性飽和酚與氯仿按體積比O. 8:1 I. 2:1混合而成的混合液。
本發(fā)明所具有的有益效果
本發(fā)明利用大腸桿菌發(fā)酵制備雙鏈RNA樣品，可在短時間內(nèi)高效快捷的生產(chǎn)大量雙鏈RNA樣品，既能縮短制備周期，又降低高額費用，而且突破了體外轉錄時的規(guī)模限制。該發(fā)明適用范圍廣泛，可以合成不同長短片段的雙鏈RNA。同時，該發(fā)明制備方法簡單，實施步驟快捷，操作重復性強，樣品合成量不受限制。
具體實施例方式下面對本發(fā)明做進一步的分析。綠色熒光蛋白GFP是一種常用的生物學標記物。RNA干擾實驗時，GFP基因的干擾通常被用作對照實驗組數(shù)據(jù)。本實施例中將以綠色熒光蛋白基因為例，詳細闡述雙鏈RNA的合成和制備方法。
實施例I
步驟(I).基因克隆利用PCR擴增的方法克隆GFP基因分子。 根據(jù)基因庫中已報道的GFP基因的cDNA序列設計帶有酶切位點的正向引物GFP-F和反向引物GFP-R。以GFP基因分子的cDNA為模板，進行PCR擴增，克隆目的基因分子，得到PCR產(chǎn)物。PCR反應體系為
10XPCR buffer2. 5 μ I
25mM Mg2+I. 5μ I
5mM dNTPsI μ I
10 μ M GFP-PFI μ I
10 μ M GFP-PRI μ I
GFP cDNAI μ I
Taq DNA 聚合酶O. 25 μ I
加水至終體積為25 μ I。PCR擴增反應條件為先94°C變性5分鐘，然后進行30個擴增循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；其中擴增循環(huán)為94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸I分鐘。PCR產(chǎn)物用I. O %瓊脂糖凝膠電泳分析。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，得到純化后的GFP基因的PCR產(chǎn)物。步驟(2).載體構建利用PET-T7質(zhì)粒構建含有GFP基因片段的表達載體。本實施例中以限制性內(nèi)切酶ZhI和&0RI為例，詳細闡述PET-T7載體的構建過程。純化后的PCR產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒均用限制性內(nèi)切油a I和feoRI進行雙酶切，得到GFP基因的酶切產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。雙酶切反應體系如下
PET-T7質(zhì)粒雙酶切反應體系
PET-T7 質(zhì)粒I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
^cRII μ I加水至終體積20 μ 1，37°C反應8小時，得到pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物雙酶切反應體系
PCR產(chǎn)物I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至終體積20μ 1，37°C反應8小時，得到GFP基因的酶切產(chǎn)物。GFP基因的酶切產(chǎn)物和PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒純化，得到純化 后GFP基因的酶切產(chǎn)物和純化后PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。利用DNA連接試劑盒連接純化后GFP基因的酶切產(chǎn)物和純化后pET_T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，16°C條件下連接4小時。將連接后的產(chǎn)物轉入感受態(tài)細胞疋coli DH5a中，涂板，30°C培養(yǎng)24小時。從平板上挑選陽性單菌落進行PCR檢測，引物為GFP-PF和GFP-PR，PCR反應模板為含有單菌落的菌液，PCR擴增反應條件同上所述，用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析。選取含有GFP基因片段的陽性單菌落，測序分析插入基因片段序列的正確性，得到含有正確GFP基因片段插入的單菌落。步驟(3).載體轉化
挑取經(jīng)鑒定含有正確GFP基因插入序列的單菌落，接種于Iml LB液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24小時，5000轉/分鐘，離心5分鐘，得到沉淀。利用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提沉淀菌體中的PET-T7表達載體，I %瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提產(chǎn)物。將含有GFP基因片段插入的pET-T7表達載體轉化到表達型菌株疋HT115中，涂板培養(yǎng)，挑選陽性菌落進行PCR檢測，反應條件同上所述。PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析。選取含有目的載體的陽性菌落，保存待用。此處的含有目的載體的陽性菌落為攜帶GFP基因片段的pET-T7載體的疋coliHT115單菌落。步驟⑷.雙鏈RNA的誘導表達
將攜帶GFP基因片段的pET-T7載體的疋coli HT115單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24小時。將攜帶GFP基因片段的pET-T7載體的疋HTl 15單菌落轉接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，原先的LB液體培養(yǎng)基與新鮮的LB液體培養(yǎng)基的體積比為I :20，在同樣條件下培養(yǎng)使細菌生長至0D_=0. 4。在LB液體培養(yǎng)基中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2mmol/L,30°C誘導培養(yǎng)8小時。5000轉/分鐘，離心5分鐘，收集細菌沉淀。磷酸緩沖液漂洗2次，得到漂洗后的細菌沉淀，保存待用。步驟(5).雙鏈RNA的純化
總RNA抽提取漂洗后的細菌沉淀，利用Trizol試劑盒提取漂洗后的細菌沉淀中的總
RNA ；
變性將提取的總RNA溶解于核糖核酸酶A (RNase A)緩沖液中，80°C變性15分鐘，得到變性溶液；
復性將變性溶液置于水浴中冷卻至常溫，使得變性溶液復性，得到復性后的溶液；酶切在復性后的溶液中加入RNase A進行酶切，加至RNase A在復性后的溶液中的終濃度為10 μ g/ml,35°C反應60分鐘，去除單鏈RNA，得到酶切后產(chǎn)物，用I. O %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果；
純化在酶切后產(chǎn)物中加入與酶切后產(chǎn)物等量體積的酚氯仿溶液，充分混勻，10000轉/分鐘，4°C，20分鐘，離心取上清液。在上清液中加入2倍上清液體積的無水乙醇，充分混勻，靜置，沉淀雙鏈RNA，10000轉/分鐘，4°C，30分鐘，離心收集沉淀物；用70 %乙醇充分洗滌，10000轉/分鐘，4°C，20分鐘，離心收集沉淀，自然干燥；
溶解加入滅菌水溶解沉淀，所得溶液即為純化后的雙鏈RNA樣品。利用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈RNA樣品，分光廣度計法測定核酸樣品濃度，-30°C保存待用。上述的LB液體培養(yǎng)基為含10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉和50 μ g/ml氨芐青霉素的水溶液，pH為7. 4 ;磷酸緩沖液為含8g/l氯化鈉NaCl，O. 2g/l氯化鉀KCl，I. 38g/l磷酸氫二鈉Na2HPO4,O. 24g/l磷酸二氫鉀KH2PO4的水溶液，pH為7. 4 ;
核糖核酸酶A緩沖液為含300mmol/L的醋酸鈉NaAc，IOmmoI/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸Tris-HCl的水溶液，pH為8. O ;
酚氯仿溶液為PH 4. O的酸性飽和酚與氯仿按體積比O. 8 :1混合而成的混合液。實施例2
步驟(I).基因克隆利用PCR擴增的方法克隆GFP基因分子。根據(jù)基因庫中已報道的GFP基因的cDNA序列設計帶有酶切位點的正向引物GFP-F和反向引物GFP-R。以GFP基因分子的cDNA為模板，進行PCR擴增，克隆目的基因分子，得到PCR產(chǎn)物。PCR反應體系為
10XPCR buffer2. 5 μ I
25mM Mg2+I. 5μ I
5mM dNTPsI μ I
10 μ M GFP-PFI μ I
10 μ M GFP-PRI μ I
GFP cDNAI μ I
Taq DNA 聚合酶O. 25 μ I
加水至終體積為25 μ I。PCR擴增反應條件為先94°C變性5分鐘，然后進行38個擴增循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；其中擴增循環(huán)為94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘。PCR產(chǎn)物用I. 5 %瓊脂糖凝膠電泳分析。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，得到純化后的GFP基因的PCR產(chǎn)物。步驟(2).載體構建利用PET-T7質(zhì)粒構建含有GFP基因片段的表達載體。本實施例中以限制性內(nèi)切酶ZhI和&0RI為例，詳細闡述PET-T7載體的構建過程。純化后的PCR產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒均用限制性內(nèi)切油a I和feoRI進行雙酶切，得到GFP基因的酶切產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。雙酶切反應體系如下PET-T7質(zhì)粒雙酶切反應體系
PET-T7 質(zhì)粒I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至終體積20 μ 1，37°C反應16小時，得到pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物雙酶切反應體系 PCR產(chǎn)物I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至終體積20μ 1，37°C反應16小時，得到GFP基因的酶切產(chǎn)物。GFP基因的酶切產(chǎn)物和PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒純化，得到純化后GFP基因的酶切產(chǎn)物和純化后PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。利用DNA連接試劑盒連接純化后GFP基因的酶切產(chǎn)物和純化后pET_T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，16°C條件下連接12小時。將連接后的產(chǎn)物轉入感受態(tài)細胞疋coli DH5a中，涂板，37°C培養(yǎng)12小時。從平板上挑選陽性單菌落進行PCR檢測，引物為GFP-PF和GFP-PR，PCR反應模板為含有單菌落的菌液，反應條件同上所述，用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析。選取含有GFP基因片段的陽性單菌落，測序分析插入基因片段序列的正確性，得到含有正確GFP基因片段插入的單菌落。步驟(3).載體轉化。挑取經(jīng)鑒定含有正確GFP基因插入序列的單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12小時，5000轉/分鐘，離心10分鐘，得到沉淀。利用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提沉淀菌體中的PET-T7表達載體，I %瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提產(chǎn)物。將含有GFP基因片段插入的pET-T7表達載體轉化到表達型菌株疋HT115中，涂板培養(yǎng)，挑選陽性菌落進行PCR檢測，反應條件同上所述。PCR產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析。選取含有目的載體的陽性菌落，保存待用。此處的含有目的載體的陽性菌落為攜帶GFP基因片段的pET-T7載體的疋coliHT115單菌落。步驟⑷.雙鏈RNA的誘導表達
將攜帶GFP基因片段的pET-T7載體的疋coli HT115單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下培養(yǎng)12小時。將攜帶GFP基因片段的pET-T7載體的疋HTl 15單菌落轉接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，原先的LB液體培養(yǎng)基與新鮮的LB液體培養(yǎng)基的體積比為I :50，在同樣條件下培養(yǎng)使細菌生長至0D_=1. O。在LB液體培養(yǎng)基中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為I. Ommol/L,37°C誘導培養(yǎng)2小時。5000轉/分鐘，10分鐘離心，收集細菌沉淀。磷酸緩沖液漂洗2次，得到漂洗后的細菌沉淀，保存待用。步驟(5).雙鏈RNA的純化總RNA抽提取漂洗后的細菌沉淀，利用Trizol試劑盒提取漂洗后的細菌沉淀中的總
RNA ；
變性將提取的總RNA溶解于核糖核酸酶A (RNase A)緩沖液中，90°C變性5分鐘，得到變性溶液；
復性將變性溶液置于水浴中冷卻至常溫，使得變性溶液復性，得到復性后的溶液；酶切在復性后的溶液中加入RNase A進行酶切，加至RNase A在復性后的溶液中的終濃度為50 μ g/ml,37°C反應10分鐘，去除單鏈RNA，得到酶切后產(chǎn)物，用I. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果；
純化在酶切后產(chǎn)物中加入與酶切后產(chǎn)物等量體積的酚氯仿溶液，充分混勻，11000轉/分鐘，4°C，13分鐘，離心取上清液。在上清液中加入3倍上清液體積的無水乙醇，充分混勻，靜置，沉淀雙鏈RNA，11000轉/分鐘，4°C，25分鐘，離心收集沉淀物；用75 %乙醇充分洗滌，11000轉/分鐘，4°C，13分鐘，離心收集沉淀，自然干燥；
溶解加入滅菌水溶解沉淀，所得溶液即為純化后的雙鏈RNA樣品。利用I. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈RNA樣品，分光廣度計法測定核酸樣品濃度，-20°C保存待用。上述的LB液體培養(yǎng)基為含10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉和50 μ g/ml氨芐青霉素的水溶液，pH為7. 4 ;
磷酸緩沖液為含8g/l氯化鈉NaCl，O. 2g/l氯化鉀KCl，I. 38g/l磷酸氫二鈉Na2HPO4,
O.24g/l磷酸二氫鉀KH2PO4的水溶液，pH為7. 4 ;
核糖核酸酶A緩沖液為含300mmol/L的醋酸鈉NaAc，IOmmoI/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸Tris-HCl的水溶液，pH為8. O ;
酚氯仿溶液為PH 6. O的酸性飽和酚與氯仿按體積比I. 2 :1混合而成的混合液。實施例3
步驟(I).基因克隆利用PCR擴增的方法克隆GFP基因分子。根據(jù)基因庫中已報道的GFP基因的cDNA序列設計帶有酶切位點的正向引物GFP-F和反向引物GFP-R。以GFP基因分子的cDNA為模板，進行PCR擴增，克隆目的基因分子，得到PCR產(chǎn)物。PCR反應體系為
10XPCR buffer2. 5 μ I
25mM Mg2+I. 5μ I
5mM dNTPsI μ I
10 μ M GFP-PFI μ I
10 μ M GFP-PRI μ I
GFP cDNAI μ I
Taq DNA 聚合酶O. 25 μ I
加水至終體積為25 μ I。PCR擴增反應條件為先94°C變性5分鐘，然后進行35個擴增循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；其中擴增循環(huán)為94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸I. 5分鐘。PCR產(chǎn)物用I. 2 %瓊脂糖凝膠電泳分析。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，得到純化后的GFP基因的PCR產(chǎn)物。
步驟(2).載體構建利用PET-T7質(zhì)粒構建含有GFP基因片段的表達載體。本實施例中以限制性內(nèi)切酶ZhI和&0RI為例，詳細闡述PET-T7載體的構建過程。純化后的PCR產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒均用限制性內(nèi)切油a I和feoRI進行雙酶切，得到GFP基因的酶切產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。雙酶切反應體系如下
PET-T7質(zhì)粒雙酶切反應體系
PET-T7 質(zhì)粒I μ g IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至終體積20 μ 1，37°C反應12小時，得到pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物雙酶切反應體系
PCR產(chǎn)物I μ g
IOXM bufferI μ I
XbalI μ I
EcoRlI μ I
加水至終體積20μ 1，37°C反應12小時，得到GFP基因的酶切產(chǎn)物。GFP基因的酶切產(chǎn)物和PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒純化，得到純化后GFP基因的酶切產(chǎn)物和純化后PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。利用DNA連接試劑盒連接純化后GFP基因的酶切產(chǎn)物和純化后pET_T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，16°C條件下連接8小時。將連接后的產(chǎn)物轉入感受態(tài)細胞疋coli DH5a中，涂板，35°C培養(yǎng)18小時。從平板上挑選陽性單菌落進行PCR檢測，引物為GFP-PF和GFP_PR，PCR反應模板為含有單菌落的菌液，反應條件同上所述，用I. 2 %瓊脂糖凝膠電泳分析。選取含有GFP基因片段的陽性單菌落，測序分析插入基因片段序列的正確性，得到含有正確GFP基因片段插入的單菌落。步驟(3).載體轉化。挑取經(jīng)鑒定含有正確GFP基因插入序列的單菌落，接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)18小時，5000轉/分鐘，離心8分鐘，得到沉淀。利用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提沉淀菌體中的PET-T7表達載體，I %瓊脂凝膠電泳檢測抽提產(chǎn)物。將含有GFP基因片段插入的pET-T7表達載體轉化到表達型菌株疋HT115中，涂板培養(yǎng)，挑選陽性菌落進行PCR檢測，反應條件同上所述。PCR產(chǎn)物用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳分析。選取含有目的載體的陽性菌落，保存待用。此處的含有目的載體的陽性菌落為攜帶GFP基因片段的pET-T7載體的疋coliHT115單菌落。步驟⑷.雙鏈RNA的誘導表達
將攜帶GFP基因片段的pET-T7載體的疋coli HT115單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，35°C條件下培養(yǎng)15小時。將攜帶GFP基因片段的pET-T7載體的疋HTl 15單菌落轉接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，原先的LB液體培養(yǎng)基與新鮮的LB液體培養(yǎng)基的體積比為I :30，在同樣條件下培養(yǎng)使細菌生長至0D_=0. 7。在LB液體培養(yǎng)基中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為O. 6mmol/L,35°C誘導培養(yǎng)5小時。5000轉/分鐘，8分鐘離心，收集細菌沉淀。磷酸緩沖液漂洗2次，得到漂洗后的細菌沉淀，保存待用。步驟(5).雙鏈RNA的純化
總RNA抽提取漂洗后的細菌沉淀，利用Trizol試劑盒提取漂洗后的細菌沉淀中的總
RNA ；
變性將提取的總RNA溶解于核糖核酸酶A (RNase A)緩沖液中，85°C變性10分鐘，得到變性溶液；
復性將變性溶液置于水浴中冷卻至常溫，使得變性溶液復性，得到復性后的溶液；酶切在復性后的溶液中加入RNase A進行酶切，加至RNase A在復性后的溶液中的終 濃度為30 μ g/ml,36°C反應30分鐘，去除單鏈RNA，得到酶切后產(chǎn)物，用I. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果；
純化在酶切后產(chǎn)物中加入與酶切后產(chǎn)物等量體積的酚氯仿溶液，充分混勻，12000轉/分鐘，4°C，10分鐘，離心取上清液。在上清液中加入2. 5倍上清液體積的無水乙醇，充分混勻，靜置，沉淀雙鏈RNA，12000轉/分鐘，4°C，15分鐘，離心收集沉淀物；用73 %乙醇充分洗滌，12000轉/分鐘，4°C，10分鐘，離心收集沉淀，自然干燥；
溶解加入滅菌水溶解沉淀，所得溶液即為純化后的雙鏈RNA樣品。利用I. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈RNA樣品，分光廣度計法測定核酸樣品濃度，-25°C保存待用。上述的LB液體培養(yǎng)基為含10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉和50 μ g/ml氨芐青霉素的水溶液，pH為7. 4 ;
磷酸緩沖液為含8g/l氯化鈉NaCl，O. 2g/l氯化鉀KCl，I. 38g/l磷酸氫二鈉Na2HPO4,
O.24g/l磷酸二氫鉀KH2PO4的水溶液，pH為7. 4 ;
核糖核酸酶A緩沖液為含300mmol/L的醋酸鈉NaAc，IOmmoI/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸Tris-HCl的水溶液，pH為8. O ;
酚氯仿溶液為PH 5. O的酸性飽和酚與氯仿按體積比I :1混合而成的混合液。
權利要求
1.一種雙鏈RNA的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟 步驟(I).基因克隆利用PCR擴增的方法克隆目的基因分子； 根據(jù)目的基因分子的cDNA序列設計帶有酶切位點的正向引物和反向引物；以目的基因分子的cDNA序列為模板，進行PCR擴增，克隆目的基因分子，得到PCR產(chǎn)物；PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析；采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，得到純化后的PCR產(chǎn)物； 步驟(2).載體構建利用PET-T7質(zhì)粒構建含有目的基因片段的表達載體； 純化后的PCR產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，得到目的基因的酶切產(chǎn)物和PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；目的基因的酶切產(chǎn)物和PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒純化，得到純化后目的基因的酶切產(chǎn)物和純化后PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；利用DNA連接試劑盒連接純化后目的基因的酶切產(chǎn)物和純化后PET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；將連接后的產(chǎn)物轉入感受態(tài)細胞疋coli DH5 α中，涂板，30 37°C培養(yǎng)12 24小時；挑選陽性單菌落進行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳分析；選取含有目的基因片段的陽性單菌落，測序分析插入基因片段序列的正確性，得到含有正確基因片段插入的單菌落； 步驟(3).載體轉化 挑取經(jīng)鑒定含有正確基因片段插入的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 37°C條件下培養(yǎng)12 24小時，離心得到沉淀；利用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提沉淀菌體中的PET-T7表達載體，凝膠電泳檢測抽提產(chǎn)物；將含有基因片段插入的PET-T7表達載體轉化到表達型菌株疋coli HT115中，涂板培養(yǎng)，挑選陽性菌落進行PCR檢測，凝膠電泳分析，選取含有目的載體的陽性菌落，保存待用；此處的含有目的載體的陽性菌落為攜帶PET-T7載體的B.coli HTl 15 單菌落； 步驟⑷.雙鏈RNA的誘導表達 將攜帶PET-T7載體的疋coli HTl 15單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 37°C條件下培養(yǎng)12 24小時；以1:20 1:50的比例擴大培養(yǎng)至OD6tltl=O. 4 I. O ;在LB液體培養(yǎng)基中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2 I. 0mmol/L,30 37°C誘導培養(yǎng)2 8小時；離心收集細菌沉淀，磷酸緩沖液漂洗，得到漂洗后的細菌沉淀，保存待用； 步驟(5).雙鏈RNA的純化 總RNA抽提取漂洗后的細菌沉淀，利用Trizol試劑盒提取漂洗后的細菌沉淀中的總RNA ； 變性將提取的總RNA溶解于核糖核酸酶A緩沖液中，80 90°C變性5 15分鐘，得到變性溶液； 復性將變性溶液置于水浴中冷卻至常溫，使得變性溶液復性，得到復性后的溶液；酶切在復性后的溶液中加入核糖核酸酶A進行酶切，加至核糖核酸酶A在復性后的溶液中的終濃度為10 50 μ g/ml，在35 37°C條件下反應10 60分鐘，去除單鏈RNA，得到酶切后產(chǎn)物，電泳檢測酶切效果； 純化在酶切后產(chǎn)物中加入與酶切產(chǎn)物等量體積的酚氯仿溶液，充分混勻，離心取上清液；在上清液中加入2 3倍上清液體積的無水乙醇，充分混勻，靜置，沉淀雙鏈RNA，離心收集沉淀物；用70 75 %乙醇充分洗滌，離心收集沉淀，自然干燥； 溶解加入滅菌水溶解沉淀，所得溶液即為純化后的雙鏈RNA樣品；凝膠電泳檢測雙鏈RNA樣品，分光廣度計法測定核酸樣品濃度，-30 -20°C保存待用。
2.如權利要求書I所述的一種雙鏈RNA的制備方法，其特征在于步驟(3)和步驟(4)所述的1^液體培養(yǎng)基為含1(^/1胰蛋白胨，58/1酵母提取物，1(^/1氯化鈉和5(^8/1111氨節(jié)青霉素的水溶液，pH為7. 4。
3.如權利要求書I所述的一種雙鏈RNA的制備方法，其特征在于步驟(4)所述的磷酸緩沖液為含8g/l氯化鈉NaCl，O. 2g/l氯化鉀KCl，I. 38g/l磷酸氫二鈉Na2HPO4,0. 24g/l磷酸二氫鉀KH2PO4的水溶液，pH為7. 4。
4.如權利要求書I所述的一種雙鏈RNA的制備方法，其特征在于步驟(5)所述的核糖核酸酶A緩沖液為含300 mmol/L的醋酸鈉NaAc, 10 mmol/L的三輕甲基氨基甲燒鹽酸Tris-HCl的水溶液，pH為8. O。
5.如權利要求書I所述的一種雙鏈RNA的制備方法，其特征在于步驟(5)所述的酚氯仿溶液為pH 4. O 6. O的酸性飽和酹與氯仿按體積比O. 8:1 I. 2:1混合而成的混合液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙鏈RNA的制備方法。現(xiàn)有體外制備siRNA的方法價格高，定制周期長，實驗規(guī)模受限制。本發(fā)明方法首先利用PCR擴增的方法克隆目的基因分子；利用pET-T7質(zhì)粒構建含有目的基因片段的表達載體；將含有基因片段插入的pET-T7表達載體轉化到表達型菌株E.coliHT115中，選取含有目的載體的陽性菌落；接種于LB液體培養(yǎng)基中，加入IPTG誘導培養(yǎng)；抽提總RNA，溶解于RNaseA緩沖液變性，冷卻復性，加入RNaseA酶切，去除單鏈RNA，純化雙鏈RNA，溶解沉淀，所得溶液即為純化后的雙鏈RNA樣品。本發(fā)明制備方法簡單，實施步驟快捷，操作重復性強，樣品合成量不受限制。
文檔編號C12N15/113GK102876677SQ20121036829
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權日2012年9月28日
發(fā)明者馬文明, 俞炎琴, 莊浩瀚, 錢葉青, 楊勁樹, 楊帆, 楊衛(wèi)軍 申請人:浙江大學舟山海洋研究中心