專利名稱：一種可供細胞無源生長的細胞培養基及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種可供多種細胞長期無源生長的細胞培養基的配制，屬于生物技術領域，確保多種細胞長時間抵御外界環境中的不利因素，適度增長，降低死亡率，從而為細胞領域的研究提供必需的條件。
背景技術：
隨著科學技術的進步、人類認識的深化以及對微觀領域研究的增多，醫學相關領域的實驗需要從人體、組織、細胞以及動物實驗等全方位進行。細胞培養作為一項基本技術，已漸漸呈模式化，總體來看，實驗室中細胞培養的條件較為苛刻，目前公認的細胞培養方法仍然比較保守，需嚴格遵守無菌原則，24或48小時更換一次新鮮的細胞培養基，保持一定的細胞密度以及選擇適宜細胞生存的環境(37°C、5% C02的細胞培養箱)等。如果不能及時更換新鮮的細胞培養基，細胞通常在7 9天內死亡。目前，多種慢性疾病嚴重威脅著人類的健康和生活質量，對其致病機制的研究在細胞領域廣泛開展，但由于現有細胞培養基需要定期更換，且更換間隔時間多為24 48小時，這限制了對長時間細胞損傷的研究。例如按現有技術手段，研究缺氧15天對血管內皮細胞的影響，在研究過程中為保證細胞的生存，需要每間隔24 48小時更換一次新鮮細胞培養基，在每次更換培養基時必然帶入一定濃度的氧氣，這從一定程度上將影響了研究結果。另外，一些空間細胞搭載的研究中，不具備定期更換培養基的條件，現有培養基也不能保證細胞可長時間生存，這為空間醫學細胞領域的研究帶來很多障礙。

發明內容
本發明目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種具有適應多種細胞長時間無源生長的細胞培養基，可以為細胞領域的研究提供必需的研究條件。

本發明中將下列物質按一定百分比配制成可供細胞無源生長的細胞培養基55% 65%的DMEM基礎培養基，4% 5%的3g/L L-谷氨酰胺，0. 01% 0. 015%的1.5mg/L氫化可的松，30% 40%的胎牛血清，I % 2%的青、鏈霉素。如配制可供細胞無源生長的細胞培養基的基本步驟為①向DMEM基礎培養基中依次加入濃度為3g/L的L-谷氨酰胺及1. 5mg/L氫化可的松，配制為無血清的該培養基；②按上述該培養基的比例，再取胎牛血清及青、鏈霉素加入到無血清該培養基中，充分混合均勻；③上述過程均在超凈工作臺上完成，嚴格遵守無菌操作原則，配制好的培養基放4°C儲存備用。培養基配制成功后，將細胞接種于該細胞培養基中首先取出保存在液氮中的細胞，在37°C水浴箱中迅速融化，然后利用水平轉子離心機以1000r/min的速度離心5min后，去除上層凍存液，其次用該細胞培養基重懸細胞，血細胞計數板計數細胞數量，按IO6個/mL的細胞密度接種到T25的細胞培養瓶中，最后放入37°C、5% CO2細胞培養箱中培養18 20天。培養結束后，再次利用血細胞計數板計數此時細胞個數，計算存活率。本發明中DMEM培養基為細胞生長提供基本的生長環境，通過提高培養基中胎牛血清的比例，使血清濃度達到30% 40%，可大大提高細胞的存活時間，有利于細胞在長時間的不更換培養基的條件下，仍能擁有充足的營養，保持增殖與凋亡之間的平衡。


圖1為可供細胞無源生長的細胞培養基的配制方法流程圖；圖2為利用本發明培養不同類型的細胞，無源密閉生長18天后細胞存活率。
具體實施例方式本發明中按一定百分比配制成可供細胞無源生長的細胞培養基55 % 65 %的DMEM基礎培養基，4% 5%的3g/L L-谷氨酰胺，0. 01 % 0. 015%的1. 5mg/L氫化可的松，30 % 40 %的胎牛血清，I % 2 %的青、鏈霉素。可供細胞無源生長的細胞培養基中DM EM基礎培養基作為細胞生長發育的基本微環境，確保細胞生長所必需的營養物質；L-谷氨酰胺是細胞生長過程中合成核酸、蛋白質的原材料；氫化可的松可促進細胞的生長發育；胎牛血清是細胞培養的重要因子，血清不僅含有豐富的營養成份，其中的各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等也起著協調細胞生長平衡的作用。通常細胞培基選擇的血清濃度為10% -20%，本發明中考慮到在長時間無源環境中，細胞生長會消耗掉大量的營養物質，故將血清濃度調整為30% 40%。例如配制500mL可供細胞無源生長的細胞培養基的基本步驟為①按所述自Gibco公司購買DMEM培養基，按65%的比例取325mL的DMEM培養基，25mL的3g/L L-谷氨酰胺，0. 075mL的1. 5mg/L氫化可的松(按0. 015%比例)，配制為該培養基共計350. 075mL ；②按所述30%的比例再取150mL胎牛血清及青、鏈霉素ImL (按1%比例)加入到無血清的該培養基中，充分混合均勻；③上述過程均在超凈工作臺上完成，嚴格遵守無菌操作原則，配制好的培養基放4 °C儲存備用。可供細胞無源生長的細胞培養基配制成功后，將細胞接種于培養基中首先取出保存在液氮中的細胞，在37°C水浴箱中迅速融化，然后利用水平轉子離心機以lOOOr/min的速度離心5min后，去除上層凍存液，其次用該細胞培養基重懸細胞，血細胞計數板計數細胞數量，按IO6個/mL的細胞密度接種到T25的細胞培養瓶中，最后放入37°C、5% CO2細胞培養箱中培養18 20天。培養結束后，再次利用血細胞計數板計數此時細胞個數，計算存活率，如圖2所示利用本發明培養的不同類型的細胞在培養18天后，其生存率分別為人單核巨噬細胞(THP-1)200% ;人肺微血管內皮細胞(HPMECs) 37. 5 % ;人小細胞肺癌細胞(H446) 16. 25% ;人肺鱗狀 上皮細胞癌細胞(H520)40% ;大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs) 25 %。本發明未詳細闡述部分屬于本領域公知技術。
權利要求
1.一種可供細胞無源生長的細胞培養基，其特征在于培養基由下列物質按一定百分比組成55% 65%的DMEM基礎培養基，4% 5%的3g/LL_谷氨酰胺，0. 01% 0. 015%的1. 5mg/L氫化可的松，30% 40%的胎牛血清，1 2%的青、鏈霉素。
2.配制500mL權利要求1所述的可供細胞無源生長的細胞培養基，其特征在于所需上述物質分別為325mL的DMEM基礎培養基，25mL的3g/L L-谷氨酰胺，0. 075mL的1. 5mg/L氫化可的松，150mL的胎牛血清，ImL的青、鏈霉素。
3.可供細胞無源生長的細胞培養基的制備方法，其特征在于具體配置過程為 ①向DMEM基礎培養基中依次加入3g/L的L-谷氨酰胺及1.5mg/L氫化可的松,配制為無血清的該培養基； ②按權利要求1所述比例，再取胎牛血清及青、鏈霉素加入到無血清該培養基中，充分混合均勻； ③上述過程均在超凈工作臺上完成，嚴格遵守無菌操作原則，配制好的培養基放4°C儲存備用。
4.利用權利要求1和2所述，可供細胞無源生長的細胞培養基，其特征在于培養細胞的具體步驟為首先取出保存在液氮中的細胞，在37°C水浴箱中迅速融化，然后利用水平轉子離心機以1000r/min的速度離心5min后,去除上層凍存液,其次利用血細胞計數板計數細胞數量，按106個/mL的細胞密度接種到細胞培養基中，最后放入37°C、5% CO2細胞培養箱中培養18 20天。
全文摘要
本發明涉及一種生物技術領域，尤其是涉及一種適應細胞無源生長的細胞培養基的制備。包括將DMEM基礎培養基，3g/L L-谷氨酰胺，1.5mg/L氫化可的松，胎牛血清及青、鏈霉素按一定比例配制成可供細胞無源生長的細胞培養基。本發明保障了多種細胞在密閉環境下長時間的無源生長，并不需要對現有的培養基原料進行大量變動，保證細胞可以長時間抵御低氧、低溫及微重力等惡劣環境，確保多種細胞保持適度生長、減少凋亡率，這為研究細胞長期慢性缺氧損傷、長期慢性低溫損傷及長時間暴露于微重力環境的研究提供了必需的條件。
文檔編號C12N5/00GK103060257SQ20121037963
公開日2013年4月24日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者劉長庭, 郭英華, 郭娜, 方向群, 王俊峰, 李天志, 常德, 蘇龍翔, 王雅娟, 徐國綱 申請人:中國人民解放軍總醫院