專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其在抗曲霉菌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物及微生物的檢測(cè)及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種枯草芽孢桿菌及其在抗曲霉菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素作為一種天然毒素，在花生田間生長(zhǎng)時(shí)就可產(chǎn)生。即便通過良好的管理規(guī)范也無法將黃曲霉毒素毒素從食物鏈中去除。生物控制法是剛剛新興的一種方法，主要是利用微生物間的拮抗，尋找對(duì)黃曲霉有抑制作用的微生物；或者通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)產(chǎn) 毒黃曲霉進(jìn)行基因修飾，使不產(chǎn)毒的黃曲霉成為可能污染食品的優(yōu)勢(shì)菌種，來達(dá)到對(duì)黃曲霉毒素的控制作用。它經(jīng)濟(jì)、有效、并且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染，有望從源頭對(duì)花生黃曲霉毒素污染加以控制。到目前為止，國(guó)內(nèi)還沒有開發(fā)出成型、經(jīng)濟(jì)的生物控制劑產(chǎn)品。生物控制劑作為黃曲霉毒素控制的一種很好的手段急需加以研究和開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，通過黃曲霉毒素平板篩選試驗(yàn)和產(chǎn)毒黃曲霉拮抗試驗(yàn)，從花生種植田間、儲(chǔ)存?zhèn)}庫(kù)中篩選黃曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黃曲霉拮抗菌株的篩選方法，并對(duì)篩選出的拮抗菌的作用效果、安全性進(jìn)行評(píng)估，得到適合需要的黃曲霉毒素抑制菌株。通過細(xì)菌分離，發(fā)酵培養(yǎng)；制備曲霉的培養(yǎng)及孢子懸液；篩選抗曲霉菌株；抗曲霉菌株的復(fù)篩等一系列工作，形成安全、有效、經(jīng)濟(jì)的黃曲霉毒素生物控制劑產(chǎn)品。將產(chǎn)品應(yīng)用于農(nóng)作物(花生等)收獲前后以及儲(chǔ)存期間等易被黃曲霉毒素污染的階段，提高出口農(nóng)作物(花生等)的黃曲霉毒素防控水平，降低出口風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)農(nóng)作物(花生等)及其制品的出口貿(mào)易。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌對(duì)黃曲霉菌具有拮抗作用，其保藏編號(hào)為=CCTCC M 2012217。保藏日期為2012年6月8日。保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏中心地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。分類命名為枯草芽孢桿菌21-1-2 (Bacillus subtilis21-l_2)。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了一種從土壤中篩選對(duì)黃曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌的方法，包括以下步驟a.細(xì)菌分離；b.曲霉的培養(yǎng)及抱子液的制備；c.抗曲霉菌株的篩選；d.抗曲霉菌株的復(fù)篩。所述步驟a可以進(jìn)一步包括稱取土壤樣品5 IOg,加入50 IOOml無菌生理鹽水，渦旋混勻I 3min，制成體積比為I : 10的懸液，分別用微量移液器吸取100 200iil，涂布LB平板，37°C培養(yǎng)24 36h，挑取單菌落純化。所述步驟b可以進(jìn)一步包括將產(chǎn)毒黃曲霉菌和無毒黃曲霉菌接種到PDA斜面，28°C培養(yǎng)6d，待孢子充分形成后，每個(gè)試管中加入4 8ml已滅菌的0. 9%生理鹽水，震蕩后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并調(diào)至100 110/ml，4°C 保存。所述步驟c可以進(jìn)一步包括移液槍取100 ill步驟b制備好的孢子液于PDA平板上，涂布器將孢子液涂干；將步驟a分離純化得到的菌株點(diǎn)種到平板上，每個(gè)菌株做兩個(gè)平行樣，28 °C培養(yǎng)48h后觀察試驗(yàn)菌株周圍是否存在抑菌圈。所述步驟d可以進(jìn)一步包括用接種環(huán)取步驟c初篩過程中選出的有抑菌活性的菌株一環(huán)，接于LB液體培養(yǎng)基中37°C，190r/min發(fā)酵24 26h，8000r/min離心10 20min，用一次性濾器過濾濾除菌體；移液槍取IOOy I制備好的孢子液于PDA平板上，用涂布器將孢子液涂干，每個(gè)板上放置三個(gè)牛津杯，分別用移液槍加入I00ia、200ia濾液，IOOul生理鹽水作為對(duì)照，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察試驗(yàn)菌株周圍是否有抑菌圈并用十字測(cè)量法測(cè)定抑菌圈直徑。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明又提供了一種枯草芽孢桿菌，包含下述基因序列 CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAMAAo為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明再提供了一種枯草芽孢桿菌，采用如下方法進(jìn)行鑒定時(shí)，包含下述基因序列鑒定方法枯草芽孢桿菌37°C肉湯中培養(yǎng)過夜，取3ml菌液使用OMEGABacterialDNA kit(D3350-01)試劑盒提取基因組DNA ;16S rDNA基因序列PCR反應(yīng)上游引物AGAGTTTGATCATGGCTCAG,下游引物TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反應(yīng)條件94 °C 5min ；94°C 45s, 58 °C 30s, 72°C 45s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；測(cè)得的基因序列為CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGT
TTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTG
GTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACG
GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG
TGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACG
GTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAAT
TATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTG
GAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGA
ACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGA
TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGC
ATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGG
AGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGAC
GTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG
CAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAG
GAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGG
GCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTG
AAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA
CACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明另提供了一種所述枯草芽孢桿菌在農(nóng)產(chǎn)品對(duì)黃曲霉菌拮抗中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種所述枯草芽孢桿菌在制備黃曲霉菌拮抗制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于通過黃曲霉毒素平板篩選試驗(yàn)和產(chǎn)毒黃曲霉拮抗試驗(yàn)，從花生種植田間、儲(chǔ)存?zhèn)}庫(kù)中篩選黃曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黃曲霉拮抗菌株的篩選方法，得到適合需要的黃曲霉毒素抑制菌株。通過細(xì)菌分離，發(fā)酵培養(yǎng)；制備曲霉的培養(yǎng)及孢子懸液；篩選抗曲霉菌株；抗曲霉菌株的復(fù)篩等一系列工作，形成安全、有效、經(jīng)濟(jì)的黃曲霉毒素生物控制劑產(chǎn)品。本發(fā)明應(yīng)用于花生等農(nóng)作物收獲前后以及儲(chǔ)存期間等易被黃曲霉毒素污染的階段，能夠提高出口花生等農(nóng)作物的黃曲霉毒素防控水平，降低出口風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)農(nóng)作物及其制品的出口貿(mào)易。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例所述枯草芽孢桿菌21-1-2對(duì)黃曲霉菌絲延長(zhǎng)的抑制作用照片;圖2為本發(fā)明實(shí)施例對(duì)比使用枯草芽孢桿菌17-3對(duì)黃曲霉菌絲延長(zhǎng)的抑制作用照片；圖3為本發(fā)明實(shí)施例對(duì)比使用枯草芽孢桿菌38-3對(duì)黃曲霉菌絲延長(zhǎng)的抑制作用照片。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例所述枯草芽孢桿菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
具體實(shí)施例方式黃曲霉拮抗菌的篩選I實(shí)驗(yàn)材料I. I實(shí)驗(yàn)菌株樣品來源濰坊諸城，青島萊西的大片花生種植區(qū)采取土壤樣品，進(jìn)行選擇性分離，以期得到目標(biāo)菌。I. 2實(shí)驗(yàn)儀器
DHG系列電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)精密電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)電子萬(wàn)用爐(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)不銹剛手提式滅菌器 (上海申安醫(yī)療器械廠)單人雙面超凈工作臺(tái) (蘇州安泰技術(shù)有限公司)HZQ-C空氣浴振蕩器 (哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)SPX型智能生化培養(yǎng)箱 (寧波東南儀器有限公司)臺(tái)式離心機(jī)及離心管 (上海安亭科學(xué)儀器廠)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀牛津杯(內(nèi)徑6_、夕卜徑8_、高IOmm)試管培養(yǎng)皿三角瓶燒杯細(xì)菌過濾器移液槍及槍頭鑷子酒精燈涂布器打孔器濾紙接種環(huán)I. 3培養(yǎng)基PDA固體培養(yǎng)基(真菌培養(yǎng)基)土豆去皮切塊，稱取200g加入500ml水，煮沸30min。雙層紗布過濾至燒瓶中，力口A 20g鹿糖，20g瓊脂粉,加水至1L, 115°C高壓滅菌20min。PDA液體培養(yǎng)基上述操作不加瓊脂。營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)于北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)CM106。稱取19g粉末加入IL水，加熱煮沸至完全溶解，分裝。121°C高壓滅菌15min。營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)于北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)CM107。稱取33g粉末加入IL水，加熱煮沸至完全溶解，分裝。121°C高壓滅菌15min。冷卻至46°C左右倒平板或斜面。
I. 4供試菌株黃曲霉(Aspergillusflavus) 289O,編號(hào) CGMCC3. 2890 ；黃曲霉(Aspergillusflavus) 395O,編號(hào) CGMCC3. 3950 ；寄生曲霉(Aspergillusparasiticus) 3,124,編號(hào) CGMCC3. 124 ;均購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。2實(shí)驗(yàn)方法2. I細(xì)菌分離稱取土壤樣品5g,加入50ml無菌生理鹽水,潤(rùn)旋混勻Imin,制成比例為I : 10(V/V)的懸液，分別用微量移液器吸取100 iil，涂布LB平板，37°C培養(yǎng)24h，挑取單菌落純化。 2. 2抗曲霉菌株的篩選曲霉的培養(yǎng)及抱子液的制備將實(shí)驗(yàn)室保存的廣毒和無毒曲霉接種到PDA斜面，28°C培養(yǎng)6d，待孢子充分形成后，每個(gè)試管中加入4ml已滅菌的0. 9%生理鹽水，充分震蕩后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并調(diào)至107/ml，4°C保存。抗曲霉菌株的初篩移液槍取100 U I制備好的孢子液于PDA平板上，涂布器將孢子液涂干。將分離純化得到的菌株點(diǎn)種到平板上，每個(gè)平板數(shù)量適宜，每個(gè)菌株做兩個(gè)平行。28°C培養(yǎng)48h后觀察試驗(yàn)菌株周圍是否存在抑菌圈?？骨咕甑膹?fù)篩用接種環(huán)取初篩過程中選出的有抑菌活性的菌株一環(huán)，接于LB液體培養(yǎng)基中37°C, 190r/min發(fā)酵24h, 8000r/min離心lOmin,用一次性濾器過濾濾除菌體。移液槍取IOOiU制備好的孢子液于PDA平板上，用涂布器將孢子液涂干，每個(gè)板上放置三個(gè)牛津杯，分別用移液槍加入100 Ii 1>200 u I濾液，100 u I生理鹽水作為對(duì)照,置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察試驗(yàn)菌株周圍是否有抑菌圈并用十字測(cè)量法測(cè)定抑菌圈直徑。2. 3對(duì)曲霉孢子萌發(fā)的抑制將2種產(chǎn)毒曲霉-黃曲霉2890和寄生曲霉3，124的孢子濃度調(diào)整為IXlO6CFU/mL,每種曲霉孢子分別與終濃度為I X 107CFU/mL的枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)于PDA液體培養(yǎng)基中(以不加枯草芽孢桿菌的PDA液體培養(yǎng)基為對(duì)照)，放入28°C搖床培養(yǎng),分別于培養(yǎng)6h和18h后顯微鏡觀察曲霉孢子萌發(fā)情況，每個(gè)處理隨機(jī)觀察50個(gè)黃曲霉孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率.實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次.2. 4抑制黃曲霉菌絲延長(zhǎng)用無菌打孔器打直徑6_的長(zhǎng)有曲霉的瓊脂塊倒置于PDA培養(yǎng)基平板中央，在距其2cm處分別放置4個(gè)直徑6mm的無菌濾紙片。將鑒定出的幾株細(xì)菌37°C肉湯中培養(yǎng)過夜(調(diào)整濃度為I X 107CFU/mL)，在每張濾紙片上分別滴加10 ii L的細(xì)菌培養(yǎng)液，滅菌生理鹽水作為對(duì)照，每株細(xì)菌重復(fù)3次在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d.2. 5對(duì)黃曲霉毒素生物合成的抑制實(shí)驗(yàn)將2種產(chǎn)毒曲霉-黃曲霉2890和寄生曲霉3，124的孢子濃度調(diào)整為IXlO6CFU/mL,分別與終濃度為I X 107CFU/mL的枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)于PDA液體培養(yǎng)基中(以不加枯草芽孢桿菌的PDA液體培養(yǎng)基為對(duì)照)，28°C下?lián)u床培養(yǎng)4d, Beacon黃曲霉毒素固相萃取柱純化后，LC-MS/MS檢測(cè)黃曲霉毒素含量.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.2. 6對(duì)黃曲霉毒素的分解作用
選取復(fù)篩枯草芽孢桿菌菌株接種于肉湯培養(yǎng)基中發(fā)酵24h，取5mL菌體發(fā)酵液加入黃曲霉毒素4種的標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為20ppb，以無菌的發(fā)酵液加入黃曲霉毒素4種作為空白對(duì)照，將其置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2d，4d，6d分別取樣，檢測(cè)黃曲霉毒素的含量，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。2. 7菌株鑒定基因組DNA的提取枯草芽孢桿菌37°C肉湯中培養(yǎng)過夜，取3ml菌液使用OMEGABacterial DNA kit (D3350-01)試劑盒提取。 16S rDNA基因序列PCR反應(yīng)上游引物AGAGTTTGATCATGGCTCAG,下游引物TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 45s, 58°C 30s, 72°C 45s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。測(cè)得的基因序列為CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAAC CGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA0序列的數(shù)據(jù)處理測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnology Information, NCBI)使用 Blast 比對(duì)。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌21-1-2 (Bacillus subtilis21-l_2)，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌21-1-2對(duì)黃曲霉菌具有拮抗作用，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2012217。
2.一種從土壤中篩選對(duì)黃曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟 a.細(xì)囷分尚； b.曲霉的培養(yǎng)及孢子液的制備； c.抗曲霉菌株的篩選； d.抗曲霉菌株的復(fù)篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟a進(jìn)一步包 括稱取土壤樣品5 IOg,加入50 IOOml無菌生理鹽水，潤(rùn)旋混勻I 3min,制成體積比為I : 10的懸液，分別用微量移液器吸取100 200 yl，涂布LB平板，37°C培養(yǎng)24 36h，挑取單菌落純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟b進(jìn)一步包括將產(chǎn)毒黃曲霉菌和無毒黃曲霉菌接種到PDA斜面，28°C培養(yǎng)6d，待孢子充分形成后，每個(gè)試管中加入4 8ml已滅菌的0. 9%生理鹽水，震蕩后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并調(diào)至100 110/ml，4°C 保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟c進(jìn)一步包括移液槍取100 步驟b制備好的孢子液于PDA平板上，涂布器將孢子液涂干；將步驟a分離純化得到的菌株點(diǎn)種到平板上，每個(gè)菌株做兩個(gè)平行樣，28°C培養(yǎng)48h后觀察試驗(yàn)菌株周圍是否存在抑菌圈。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟d進(jìn)一步包括用接種環(huán)取步驟c初篩過程中選出的有抑菌活性的菌株一環(huán)，接于LB液體培養(yǎng)基中37°C, 190r/min發(fā)酵24 26h, 8000r/min離心10 20min,用一次性濾器過濾濾除菌體；移液槍取100 u I制備好的孢子液于PDA平板上，用涂布器將孢子液涂干，每個(gè)板上放置三個(gè)牛津杯，分別用移液槍加入100 u 1.200U I濾液，100 u I生理鹽水作為對(duì)照，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察試驗(yàn)菌株周圍是否有抑菌圈并用十字測(cè)量法測(cè)定抑菌圈直徑。
7.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于，包含下述基因序列CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。
8.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于，采用如下方法進(jìn)行鑒定時(shí)，包含下述基因序列 鑒定方法枯草芽孢桿菌37°C肉湯中培養(yǎng)過夜，取3ml菌液使用OMEGA BacterialDNAkit(D3350-01)試劑盒提取基因組DNA; 16SrDNA基因序列PCR反應(yīng)上游引物AGAGITTGATCATGGCTCAG，下游引物TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 45s, 58°C 30s, 72°C 45s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ； 測(cè)得的基因序列為CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。
9.一種如權(quán)利要求1,7,8中任一項(xiàng)所述枯草芽孢桿菌在農(nóng)產(chǎn)品對(duì)黃曲霉菌拮抗中的應(yīng)用。
10.一種如權(quán)利要求1，7,8中任一項(xiàng)所述枯草芽孢桿菌在制備黃曲霉菌拮抗制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌及其在抗曲霉菌中的應(yīng)用。本發(fā)明枯草芽孢桿菌對(duì)黃曲霉菌具有拮抗作用。本發(fā)明從土壤中篩選對(duì)黃曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌的方法，包括以下步驟a.細(xì)菌分離；b.曲霉的培養(yǎng)及孢子液的制備；c.抗曲霉菌株的篩選；d.抗曲霉菌株的復(fù)篩。通過黃曲霉毒素平板篩選試驗(yàn)和產(chǎn)毒黃曲霉拮抗試驗(yàn)，從花生種植田間、儲(chǔ)存?zhèn)}庫(kù)中篩選黃曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黃曲霉拮抗菌株的篩選方法，得到適合需要的黃曲霉毒素抑制菌株。本發(fā)明應(yīng)用于花生等農(nóng)作物收獲前后以及儲(chǔ)存期間等易被黃曲霉毒素污染的階段，能夠提高出口花生等農(nóng)作物的黃曲霉毒素防控水平，降低出口風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)農(nóng)作物及其制品的出口貿(mào)易。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102965306SQ20121044488
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者宮小明, 張藝兵, 孫軍, 李建軍, 馬榮檜, 金超, 田國(guó)寧, 丁葵英 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局