專利名稱：一種葡萄芽變的快速區分方法
技術領域：
本發明涉及一種葡萄芽變的快速區分方法，屬于生物學分子標記領域。
背景技術：
芽變(budsport、bud mutation)是體細胞突變(somatic mutation)的一種。芽變選種作為葡萄育種的一種方式，與其它育種方式(實生選種、雜交育種、輻射誘變育種、原生質體融合育種等)相比，有著獨特的優勢。其變異性狀在田間容易被發現，可通過嫁接繁殖被保存下來而沒有童期的干擾，可較快地進行鑒定和推廣應用。芽變是細胞中遺傳物質的突變，只有梢端組織分生層的細胞發生突變時才有可能成為一個芽變。組織發生層學說是目前解釋芽變的主要學說，被子植物梢端分生組織都有幾個相互區分的細胞層，叫組織發生層，分別用L M Lu、Lm表示。植物的組織即由這三層細胞分別衍生而成，各個組織發生層按不同的方式進行細胞分裂，并且衍生為特定的組織。L !層細胞進行垂周分裂，形成一層細胞，衍生為表皮和果肉。L工工層細胞進行垂周分裂，形成
1-3層細胞，衍生為皮層的外層及孢原組織。Lm層細胞既有平周分裂，又有垂直分裂和斜向分裂，形成多層細胞，衍生為皮層的中內層、輸導組織和髓心組織(中柱)。在正常情況下，這三層細胞具有相同的遺傳物質基礎。如果層間或層內不同部分之間含有不同的遺傳物質基礎，經細胞分裂、分化發育后，形成具有兩種或多種遺傳結構的細胞組織使植物的某一器官表現出兩種或多種不同性狀即嵌合體。葡萄植株的細胞，在受到外界環境條件變化的刺激后，常會發生突然變異，變異后的芽發育成枝并開花結果時，其枝芽及果實的性狀都與原株發生了變化。葡萄植株發生芽變后，其突變性狀是多種多樣的，但必須進行仔細的現察和對比，一般情況下芽變的主要特征有以下幾個方面芽變后的葉片肥大，葉厚，色澤變深，枝條節間變短，生長勢變強，也有的葉片無毛或裂刻深淺、葉緣的鋸齒及尖銳程度發生了變化，還有的葉脈顏色、凹凸度發生 了變化；花蕾的數量、大小發生了變化，有的穂梗變得短粗；果粒、果穗變大，成熟后果粒色澤變深或變淺；樹體的萌芽期、花期、果實成熟期提早或延遲；樹體抗寒性增強，也有的枝條扦插不易生根，但嫁接成活率無大變化。除發生芽變這一類屬于遺傳物質的突變外，還普遍存在著可能由于一般的環境條件(包括砧木、肥水、土壤及各種氣象和其他生態因子)或一系列栽培措施的影響而出現的飾變。這些飾變是非遺傳物質的變異，是不可能遺傳給下一代的。傳統的芽變鑒定主要通過形態學的觀察比較，但是有些情況下，芽變和飾變的性狀特征非常相似，僅通過傳統的形態學觀察無法有效判斷植株的突變性狀是否屬于植株芽變。而且傳統的芽變鑒定通過形態學觀察比較，受環境和經驗影響較大，效率不高。所以準確鑒定芽變具有重要的意義，可快速獲得一些具有優良性狀的新材料，提高育種效率。反轉錄轉座子在植物基因組中分布廣泛，拷貝數多，異質性高，在種內和種間表現出較高的序列差異性和豐富的插入多態性(Applications of retrotransposons asgenetic tools in plant biology. Trends Plant Sci, 2001, 6 (3) : 127-134.);活性反轉錄轉座子常在宿主基因組中產生新的插入位點，從而改變宿主基因組大小和組成，用來在譜系中建立系統發生關系，并產生插入突變(Plant retrotransposons. Annu RevGenet, 1999，33(1) :479-532.);反轉錄轉座子插入、DNA甲基化和表達差異等被認為是果樹變異的主要原因。研究表明反轉錄轉座子能導致果樹芽變，Yao等發現RaeIme等單性結實的蘋果品種是由于反轉錄轉座子插入內含子的MdPI基因造成的(Parthenocarpicapple fruit production conferred by transposon insertion mutations in aMADS-boxtranscription factor. ProcNatlAcad SciUSA,2001, 98(3):1306-1311.),Tignon等在對喬納金蘋果和它的兩個紅色突變進行差異顯示分析時獲得一個與Tyl-copia類反轉錄轉座子的RT基因非常相似的一個片段(Identification of Copia —like retrotransposable element by apple. Acta Hortic 546, 2001:515 - 520.)； Kobayashi等發表論文表明紅葡萄芽變品種RubyOkuyama和FlameMuscat均是反轉錄轉座子缺失產生的(Retrotransposon-induced mutations in grape skin color. Science, 20
04,304(5673) :982-982.) ;Breto等證實反轉錄轉座子是造成甜橙基因組變異的原因(TheDiversification of Citrus Clementina Hort. ex Tan. , a Vegetatively PropagatedCrop Species. Mol Phylogen Evol, 2001, 21 (2) :285-293.) 因此，利用反轉錄轉座子標記區分葡萄芽變具有重大意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種葡萄芽變的快速區分方法。為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是提供一種葡萄芽變的快速區分方法，包括以下步驟提取親本葡萄植株及對應的疑似芽變葡萄植株的DNA，用iPBS引物分別對DNA進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳區分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，疑似芽變品種為芽變。所述的提取葡萄植株的DNA可以從葡萄植株的葉片、根、莖、果實或花中提取。所述的葡萄植株的DNA提取方法，包括以下步驟I)研缽預冷后，放入葉片、聚乙烯基吡咯烷酮和液氮，研磨成細粉放入離心管并-20°C 冷藏 30min ；2)將熱的CTAB提取緩沖液裝入步驟I)的離心管中，使葉片組織均勻分散在緩沖液中，65°C水浴90min,每隔5min輕輕顛倒搖勻一次；3)將步驟2)的離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m離心IOmin ；4)取上清液，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m 離心 IOmin ；5)取上清液，加入2倍體積的預冷無水乙醇，搖勻，-20°C靜置2h，4°C下4000r/m離心IOmin ；6)棄上清液，加入70%乙醇蓋住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4°C靜置5h ；7)棄乙醇，風干5h，每管加入300 ii LTE緩沖液，充分溶解后，加入5 y L的RNase，37°C水浴7h，得到葡萄植株的DNA。所述的iPBS 引物是序列表 SEQ ID NO: U SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3 或 SEQ IDNO:4的核苷酸序列的引物。
所述的PCR 擴增體系包括無菌 ddH20、I XBuffer、2. Ommol L^1Mg2+>
0.3mmol L^dNTPs.O. I u mol L-1 引物、DNAl. Ong/y L、Taq 酶 0. 05U u L'所述的PCR擴增程序是94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，72°C充分延伸lOmin，其中，變性、退火、延伸三個步驟循環30次。反轉錄轉座子廣泛存在于果樹基因組中，可以通過改變等位基因或調控基因表達以改變園藝學性狀(成熟期和果皮色澤)。本發明鑒定芽變所采用的方法iPBS就是基于反轉錄轉座子的一種分子標記。與常規分子標記技術比較，反轉錄轉座子最大的優勢在于它能覆蓋全基因組，提供的信息更豐富，可作為高通量標記分析，具有很大的發展潛力。本發明以3組葡萄品種和其對應的早熟芽變葡萄品種為原料，利用iPBS分子標記有效區分了芽變葡萄品種，同時本發明無需預知反轉錄轉座子的相關序列，具有較強的通用性，為有效選擇變異奠定了理論基礎。本發明操作簡便、用途廣泛，節約了大量的人力和 物力，便于推廣。


圖I為引物序列2220、2224、2229、2231的iPBS-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為引物序列2256、2295、2298、2373的iPBS-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3 為引物 GretlFa、GretlRb, VinelRa, TvvlFa 的 IRAP-PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式材料本發明選取3組親本葡萄品種及其對應的早熟芽變葡萄品種，均來自中國農業科學院鄭州果樹研究所，見表I。表13組葡萄品種
序號(親本葡萄品種一芽變葡萄品種)名稱(親本葡萄品種一芽變葡萄品種)
15—163京亞一洛浦早生
~18—100巨峰一98-2
~162—161乍娜一90-1實施例1、DNA的提取I、將研缽預冷后，加入少量液氮，并充足預冷；2、取-20°C預冷的新鮮完好干凈葉片3g放入研缽中，加入半藥勺聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和適量液氮，研磨至細粉，裝入離心管，-20°C冷藏30min ;3、配制 CTAB 提取緩沖液稱取 CTAB 2g 加蒸餾水 40ml，IM Tris_cl(pH8. 0)10ml，
0.5M EDTA (pH 8. 0)4ml和5M NaCl 28ml，待CTAB溶解后用蒸餾水定容到100ml，加熱，至沸騰后再加入2%的P -巰基乙醇；4、將熱的CTAB提取緩沖液裝入步驟2)的離心管中，每管5ml，并將葉片組織均勻分散在緩沖液中，然后放入65°C的恒溫水浴鍋中90min，每隔5min輕輕顛倒搖勻一次；5、取出離心管，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻使混合物成乳濁狀，4000r/m離心IOmin ；6、取上清液，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻使混合物成乳濁狀，4000r/m離心IOmin ；7、取上清液，加入2倍體積的預冷無水乙醇，搖勻，-20°C靜置2h ；8、取出并在 4°C下 4000r/m 離心 IOmin ；
9、棄上清液，加入70%乙醇蓋住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4°C靜置5h ；10、棄乙醇，風干5h，每管加入300 u LTE緩沖液，充分溶解后，每管加入5 y L的RNase，在37°C的恒溫水浴鍋中水浴7h，得到葡萄植株的DNA。實施例2、iPBS-PCR 擴增PCR擴增體系及程序參考Kalendar等，如表2、表3所示，引物由上海生物工程技術有限公司合成，如表4所示。表2iPBS-PCR擴增反應體系
權利要求
1.一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，包括以下步驟提取親本葡萄植株及對應的疑似芽變葡萄植株的DNA，用iPBS弓丨物分別對DNA進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳區分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，疑似芽變品種為芽變。
2.根據權利要求I所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的提取葡萄植株的DNA可以從葡萄植株的葉片、根、莖、果實或花中提取。
3.根據權利要求2所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的葡萄植株的DNA提取方法，包括以下步驟 1)研缽預冷后，放入葉片、聚乙烯基吡咯烷酮和液氮，研磨成細粉放入離心管并-20°C冷藏30min ； 2)將熱的CTAB提取緩沖液裝入步驟I)的離心管中，使葉片組織均勻分散在緩沖液中，65°C水浴90min,每隔5min輕輕顛倒搖勻一次； 3)將步驟2)的離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m離心IOmin ； 4)取上清液，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m離心 IOmin ； 5)取上清液，加入2倍體積的預冷無水乙醇，搖勻，-20°C靜置2h，4°C下4000r/m離心IOmin ； 6)棄上清液，加入70%乙醇蓋住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4°C靜置5h； 7)棄乙醇，風干5h，每管加入300μ LTE緩沖液，充分溶解后，加入5μ L的RNase，37°C水浴7h，得到葡萄植株的DNA。
4.根據權利要求I所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的iPBS引物是序列表SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3或SEQ ID N0:4的核苷酸序列的引物。
5.根據權利要求I所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的PCR擴增體系包括無菌 ddH20、I XBuffer、2. Ommol · L 1Mg2^O. 3mmol · L MNTPs、。· I μ mo I .L1SI物、DNA1.0ng/yL、Taq 酶 0.05U · μ L'
6.根據權利要求I所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的PCR擴增程序是94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，72°C充分延伸lOmin，其中，變性、退火、延伸三個步驟循環30次。
全文摘要
本發明公開了一種葡萄芽變的快速區分方法，包括以下步驟提取親本葡萄植株及對應的疑似芽變葡萄植株的DNA，用iPBS引物分別對DNA擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳區分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，疑似芽變品種為芽變。本發明以3組早熟芽變葡萄品種為原料，利用iPBS分子標記有效區分了芽變葡萄品種，同時本發明無需預知反轉錄轉座子的相關序列，具有較強的通用性，為有效選擇變異奠定了理論基礎。本發明操作簡便、用途廣泛，節約了大量的人力和物力，便于推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102965434SQ201210446959
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者郭大龍, 張國海, 侯小改, 張瀟玉, 郭明曉 申請人:河南科技大學