重組靈芝免疫調節蛋白（rLZ-8）在調節血脂中脂蛋白含量的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)在調節組織中脂蛋白含量的應用，通過動物模型實驗證明，rLZ-8具有調節動物的高密度脂蛋白膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇含量的作用，可以清除蓄積于末梢組織的游離膽固醇，緩解動脈粥樣進程及血管中斑塊生成。
【專利說明】重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)在調節血脂中脂蛋白含量的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及的重組靈芝免疫調節蛋白是由基因重組技術，以巴斯德畢赤酵母為表達載體，深度發酵表達的重組靈芝免疫調節蛋白在調節血脂中脂蛋白含量的應用，重點涉及重組靈芝免疫調節蛋白能夠有效升高高密度脂蛋白膽固醇含量及有效降低低密度脂蛋白含量，屬于生物醫藥工程領域。

【背景技術】
[0002]高密度脂蛋白膽固醇(Highdensity lipoprotein-cholesterol, HDL-C),主要是由肝臟和小腸合成。它是由載脂蛋白、磷脂、膽固醇和少量脂肪酸組成。HDL-C主要功能為，將蓄積于末梢組織的游離膽固醇與血液循環中脂蛋白或與某些大分子結合而運送到各組織細胞，近來，眾多的科學研究證明，由于HDL-C顆粒較小，結構致密，能自由進出動脈壁，可以攝取血管壁內膜底層沉浸下來的低密度脂蛋白、膽固醇、甘油三酯等有害物質，且不向組織釋放膽固醇，具有將組織中膽固醇轉移出來的功能，所以它被認為是抗動脈粥樣硬化的保護因子，因此，高密度脂蛋白具有“抗動脈粥樣硬化性脂蛋白”的美稱。具有明確的抗動脈粥樣硬化的作用，可以將動脈粥樣硬化血管壁內的膽固醇“吸出”，并運輸到肝臟進行代謝清除。上述過程實際上是膽固醇逆轉(RCT)，RCT促進組織細胞內膽固醇的清除，維持細胞內膽固醇量的相對衡定，HDL-C運載周圍組織中的膽固醇，再轉化為膽汁酸或直接通過膽汁從腸道排出，動脈造影證明高密度脂蛋白膽固醇含量與動脈管腔狹窄程度呈顯著的負相關。所以高密度脂蛋白是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護因子，俗稱“血管清道夫”。從而限制動脈粥樣硬化的發生發展，起到抗動脈粥樣硬化作用。
[0003]低密度脂蛋白膽固醇(Lowdensity lipoprotein-cholesterol, LDL-C):一種密度較低(1.019~1.063 g/cm3)的血漿脂蛋白，約含25%蛋白質與49%膽固醇及膽固醇酯。其膽固醇主要來自從CE轉運的高密度脂蛋白中的膽固醇，低密度脂蛋白是富含膽固醇的脂蛋白，主要作用是將膽固醇運送到外周血液，是動脈粥樣硬化的危險因素之一，被認為是動脈粥樣硬化的誘因。如果血液中低密度脂蛋白膽固醇濃度升高，它將沉積于心腦等部位血管的動脈壁內，逐漸形成動脈粥樣硬化性斑塊，阻塞相應的血管，LDL-C水平如果超出正常范圍時就會使心臟的危險性增加。因此LDL-C常被稱為是“壞”膽固醇，降低LDL-C水平，則預示可以降低冠心病的危險。
[0004]動脈粥樣硬化是冠心病，心絞痛，心肌梗死，腦中風，周圍血管性疾病等心血管疾病的根源，嚴重威脅人類健康。動脈粥樣硬化的病程較長，從早期到晚期可長達30年之久，是慢性經過疾病，動脈的主要病理改變是彈性減弱，硬度脆性增加，官腔變窄到晚期的閉塞停滯血供，進而形成最嚴重的動脈瘤。
[0005]動脈粥樣硬化的四個主要病理過程為:(I)低密度脂蛋白在易損區域動脈內皮下間質沉積。(2)單核巨噬細胞粘附于內皮細胞表面。(3)巨噬細胞進入內膜層增殖，并吞噬氧化性LDL-C轉化成泡沫細胞。(4)泡沫細胞死亡并釋放出脂質，形成壞死中心。(5)平滑肌細胞遷移、增生聚集，并分泌纖維樣物質，使形成的斑塊增大。
[0006]本發明中所使用的重組靈芝免疫調節蛋白(recombinant Ganoderma Iucidumimmunoregulatory protein, rLZ-8),是應用基因工程方法得到的具有高純度和穩定生物活性的rLZ-8樣品。靈芝免疫調節蛋白的主要功能在于它可以促進末梢淋巴細胞和脾臟細胞的生物活性，誘導動物和人體的巨噬細胞分泌多種細胞因子進而防御及消除病原體的侵害，維護機體的健康。


【發明內容】

[0007]本發明重點提供重組靈芝免疫調節蛋白在調節血脂中脂蛋白含量的應用，本發明目的之一是提供重組靈芝免疫調節蛋白的一種新用途，即在調節組織中脂蛋白含量以及治療動脈粥樣硬化的應用。
[0008]本發明所述的重組靈芝免疫調節蛋白是使用巴斯德畢赤酵母表達的重組靈芝免疫調節蛋白，不論是從何種途徑提取或得到的靈芝免疫調節蛋白，其主要成分相同，基本結構相同，都具有相同的藥理功效，即都可以用于調節組織中脂蛋白含量以及治療動脈粥樣硬化。
[0009]具體
【發明內容】
如下:本發明采用雄性Wistar大鼠(體重230±20g)建立了高脂蛋白模型，共72只，隨機分為6組，每組12只；實驗分組:正常對照組，模型對照組，rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組，辛伐他汀組(SV，1.8mg/kg)。動物分籠飼養，自由飲水，正常組喂飼正常飼料，模型組、rLZ-8各給藥組以及辛伐他汀組喂食高脂飼料，造模時間為6周。每日觀察大鼠的食欲、體重、行為、狀態、及死亡情況。
[0010]給藥程序:設計合理的給藥程序，正常組和模型對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，藥物rLZ-8治療組采用腹腔注射給藥，rLZ-8低、中、高劑量分別為5 μ g/kg/dUO μ g/kg/d、50 μ g/kg/d ;給藥六周。同時，每日觀察大鼠的食欲、體重、行為、狀態、及死亡情況。本發明通過對大鼠體重肝重、血脂含量、血清抗氧化指標、主動脈組織學觀察等方面參數的檢測，考察和評價rLZ-8對大鼠高脂模型的治療作用和效果，結果表明，rLZ-8在治療大鼠高脂模型及動脈粥樣硬化中具有顯著的效果。具體實驗結果如下:(I)大鼠體重肝重方面:除高脂模型組以外，其他各組大鼠的體重及肝重都顯著低于正常對照組(P < 0.05); (2)血脂含量:rLZ-8低劑量組的LDL-C高于正常對照組，但同時顯著低于高脂模型組(/X0.05)。rLZ-8中、高劑量組的HDL-C和LDL-C顯著高于正常對照組(/7〈0.05)，但與高脂模型組比較顯著低于高脂模型組ΟΚΟ.05);與陽性藥組比較，在高密度脂蛋白方面rLZ-8明顯優于陽性對照組，在低密度脂蛋白方面二者處于同一治療水平，說明了 rLZ-8能夠有效降低血清中低密度脂蛋白的含量的同時升高高密度脂蛋白的含量；(3)血清抗氧化指標:與正常組相比，高脂模型組的MDA顯著上升_.05)、CAT和GSH-PX顯著降低QK0.05)，提示高脂模型組大鼠抗氧化能力下降，脂質過氧化物生成增多。與高脂模型組相比，rLZ-8低劑量組和高劑量組的SOD、CAT和GSH-PX顯著升高(/X0.05)，MDA顯著下降(/X0.05)，且與正常對照組相當，提示低劑量組和高劑量的rLZ-8可以提高大鼠的抗氧化能力；而凡2-8中劑量組則沒有得到類似結果；(4)主動脈組織學:正常對照組:血管膜結構完整，層次清晰，內膜內皮細胞連續完整，排列整齊，中膜平滑肌細胞排列規整，無增生，內膜及中膜均未見泡沫細胞及脂質沉積；高脂對照組:主動脈平滑肌細胞排列紊亂，內膜明顯增厚，內含大量泡沫細胞，內彈力膜斷裂、模糊，內膜與中膜之間有長梭型斑塊；rLZ-8各治療組:組織病變程度有所減輕，平滑肌排列較為整齊，主動脈壁各層次較清晰，中層平滑肌細胞厚度基本正常，泡沫細胞較少。
[0011]本發明有益效果在于:rLZ_8低劑量可以在一定程度上延緩動脈粥樣硬化的發生發展，可以提高機體的抗氧化水平，舒張血管，降低血脂，為動脈粥樣硬化的治療提供了依據。
[0012]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1正常對照組血管組織的HE染色(X 200)
圖2高脂模型組血管組織的HE染色(X 200)
圖3辛伐他汀組血管組織的HE染色(X 200)
圖4 rLZ-8低劑量組血管組織的HE染色(X 200)
圖5 rLZ-8中劑量組血管組織的HE染色(X 200)
圖6 rLZ-8高劑量組血管組織的HE染色(X 200)

【具體實施方式】
[0014]實施例1 rLZ-8對大鼠血酯蛋白水平與生化指標的影響 1.實驗材料與試劑
雄性Wistar大鼠，體重230±20g，由吉林大學白求恩醫學部動物部提供。高脂飼料(基礎飼料，3.5%膽固醇，10%豬油，0.2%丙基硫氧嘧啶，0.5%膽酸鈉，5%白糖)辛伐他汀，乙醚，10%甲醛，生理鹽水，3%戊巴比妥鈉，全自動生化儀，高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒。
[0015]2.實驗方法
動脈粥樣硬化模型建立:動物分籠飼養，自由飲水，正常組喂飼正常飼料，模型組、給藥組及陽性組喂飼高脂飼料，造模時間為六周。每日觀察大鼠的食欲、體重、行為、狀態、及死亡情況。
[0016]實驗動物分組與給藥方法:雄性Wistar大鼠(體重230 ± 20g )，72只，隨機分為6組，每組12只；實驗分為包括正常對照組，模型組，藥物rLZ-8低劑量組(5 μ g/kg/d)、rLZ-8 中劑量組(10 μ g/kg/d)、rLZ-8 高劑量組(50 μ g/kg/d)，辛伐他汀組(SV，1.8mg/kg)在內的6個實驗組。
[0017]給藥方法與程序為:腹腔注射給藥，每天給藥2次，連續給藥6周，各治療組按照設計的給藥劑量給予腹腔注射給藥，其中正常組和模型對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。
[0018]檢測項目:每日觀察大鼠的食欲、體重、行為、狀態、及死亡情況。甘油三脂(Triglyceride, TG)、總膽固醇(Total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇以及生化指標。
[0019]檢測方法:采用全自動生化分析儀測定血清中甘油三脂、總膽固醇；采用磷鎢酸-鎂沉淀法測定高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量。
[0020]3.實驗結果3.1rLZ-8對大鼠血脂水平的影響
高脂模型組血清中的TG、TC和LDL-C顯著高于正常對照組(/7〈0.05)。rLZ-8低劑量組的TG、TC和HDL-C與正常對照組相比，無顯著差異；rLZ-8低劑量組的LDL-C顯著高于正常對照組，但同時也顯著低于高脂模型組OX0.05)。rLZ-8中、高劑量組的TG與正常對照組沒有顯著性差異，但是TC、HDL-C還是顯著高于正常對照組0X0.05)，而LDL-C的含量顯著低于模型組的同時也低于辛伐他汀組的LDL-C的含量，說明在調節血脂中HDL-C與LDL-C的含量rLZ-8具有明顯的治療優勢(表1)。
[0021]表1 rLZ-8對大鼠血脂水平的影響(單位:mmol/L) (x 土 s).咖麵 I mi

【權利要求】
1.rLZ-8用于調節血脂中脂蛋白含量的應用。
2.如權利要求1所述應用，其特征在于重組靈芝免疫調節蛋白升高組織中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。
3.如權利要求1所述應用，其特征在于重組靈芝免疫調節蛋白降低組織中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。
4.如權利要求1所述應用，其特征在于重組靈芝免疫調節蛋白在治療動脈粥樣硬化藥物中的應用。
5.如權利要求1所述應用，其特征在于將其制備成注射液、凍干粉針劑、片劑、膠囊劑、丸劑、水劑、口服液、散劑、糊劑、顆粒劑、貼片或膏劑。
6.如權利要求1所述應用，其特征在于所述的藥物可以通過口服和非腸道給藥，口服藥包括口服液、 片劑、丸劑和膠囊；非腸道包括外用藥和注射劑。
【文檔編號】A61P3/06GK104069481SQ201410362924
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】孫非, 梁重陽, 張喜田 申請人:張喜田, 孫非