專利名稱：用于檢測(cè)黃瓜疫霉的lamp引物及含有該引物的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃瓜疫霉的檢測(cè)，具體地說，涉及用于檢測(cè)黃瓜疫霉的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。
背景技術(shù)：
植物病原卵菌是一類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導(dǎo)致多種植物的毀滅性病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici )、大豆疫霉(P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分別引起馬鈴薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹及柑橘的重要疫病，嚴(yán)重年份乃至絕產(chǎn)。該類病菌主要以菌絲體或卵孢子在病殘?bào)w或土壤中渡過不良環(huán)境而作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或卵孢子均可萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊-釋放游動(dòng)孢子，再借助雨水或氣流進(jìn)行傳播、侵染而導(dǎo)致植物病害。因此，對(duì)該類病菌的初侵源或侵染寄主早期進(jìn)行適時(shí)監(jiān)控，利于控制病害的 發(fā)生，傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調(diào)控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發(fā)乃至產(chǎn)生明顯危害時(shí)才實(shí)施，忽視了對(duì)初侵染源或侵染寄主早期適時(shí)采取綜合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。黃瓜疫霉(P. melonis)是我國(guó)乃至亞洲常見黃瓜病害種類，多在溫室等低溫高濕低光照環(huán)境下侵染黃瓜(Cucumis sativus),造成黃瓜根腐病，導(dǎo)致生產(chǎn)損失，此病還在臺(tái)灣地區(qū)、日本和韓國(guó)等地也均有報(bào)道。此外，黃瓜疫霉在亞洲地區(qū)也有侵染西瓜(CitrullusIanatus,韓國(guó))、香瓜(Cucumis melo,韓國(guó)和日本)開心果(Pistacia vera,伊朗)、異株括樓(Trichosanthes dioica,印度)等多種作物的報(bào)道。因此，它是我國(guó)和亞洲地區(qū)的重要作物病害，開發(fā)黃瓜疫霉的早期快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)相關(guān)作物生產(chǎn)中的病害防控和無公害化具有重要的意義。近年來，PCR技術(shù)及其相關(guān)分子檢測(cè)技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的分子檢測(cè)與預(yù)警，主要利用核糖體rDNA/ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物來對(duì)植物致病菌進(jìn)行快速檢測(cè)。ITS+5. 8S區(qū)域由編碼真核細(xì)胞rRNA 5. 8S亞基的基因和該基因兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間序列(InterTranscribedSpacer, ITS)組成，由于ITS+5. 8S區(qū)域具有較高的變異速率，因此常被用于真菌種水平的鑒定和分子系統(tǒng)學(xué)研究。目前大多采用常規(guī)PCR方法進(jìn)行植物病原菌檢測(cè)，對(duì)儀器設(shè)備(如PCR儀、凝膠成像系統(tǒng))要求高，投入大，給技術(shù)的基層推廣造成了極大障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種便于基層推廣使用的，用于檢測(cè)黃瓜疫霉的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測(cè)黃瓜疫霉(Phytophthora melonis)的LAMP引物組，其包括外側(cè)正向引物F3 :5 ’ -CGGCGACTGGCTGCTA-3 ’ ；
外側(cè)反向引物B3 :5 ’ -ATTACGTATCGCAGTTCGCA-3 ’ ；以及內(nèi)側(cè)正向引物 FIP : 5 ’ -CAAGAATGGGTTTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGTTTGGG-3，；內(nèi)側(cè)反向引物 BIP :5’ -TTACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTTTCCTAGACATCCACTGCTGAAAG-3，。本發(fā)明還提供含有上述LAMP引物組的用于檢測(cè)黃瓜疫霉的試劑盒，其中所述試劑盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。前述試劑盒中還包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。更優(yōu)選地，前述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述LAMP引物組或試劑盒在檢測(cè)黃瓜疫霉中的應(yīng)用，包括步驟1)提取樣品中的DNA ;2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進(jìn)行LAMP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物，即對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果判定樣品中是
否含有黃瓜疫霉。LAMP-PCR反應(yīng)體系以40 ill計(jì)為
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)黃瓜疫霉(Phytophthoramelonis)的LAMP引物組,其特征在于,其包括 外側(cè)正向引物 F3 :5，-CGGCGACTGGCTGCTA-3，；外側(cè)反向引物 B3 :5’ -ATTACGTATCGCAGTTCGCA-3’ ；以及內(nèi)側(cè)正向引物 FIP :5’ -CAAGAATGGGITTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGITTGGG-3’ ；內(nèi)側(cè)反向引物 BIP :5’ -TTACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTTTCCTAGACATCCACTGCTGAAA G-3，。
2.含有權(quán)利要求I所述LAMP引物組的用于檢測(cè)黃瓜疫霉的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、BstDNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
5.權(quán)利要求I所述LAMP引物組或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述試劑盒在檢測(cè)黃瓜疫霉中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟1)提取樣品中的DNA；2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進(jìn)行LAMP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以40μ I計(jì)為
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，LAMP-PCR反應(yīng)條件為65°C60分鐘， 80 0C 2分鐘，冰上終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)黃瓜疫霉(Phytophthora melonis)的LAMP引物及含有該引物的試劑盒，所述引物包括FIP和BIP以及F3和B3(如Seq ID No.1-4所示)。本發(fā)明將LAMP引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于黃瓜疫霉病菌的快速檢測(cè)，可從發(fā)病植物組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境準(zhǔn)確地檢測(cè)出黃瓜疫霉。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR方法更高，可對(duì)黃瓜疫霉的各種形態(tài)的繁殖體如菌絲、卵孢子和游動(dòng)孢子等進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)黃瓜疫霉疫情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測(cè)等方面具有重要意義；同時(shí)可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102978285SQ20121049260
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者孫翔, 郭良棟, 季妞妞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所