用于檢測冬生疫霉的引物對和探針及其檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于檢測冬生疫霉的引物對和探針，所述引物對的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。本發明進一步提供了檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法，其是以樣品總DNA為模板，利用上述引物對和探針進行實時熒光PCR擴增，每個循環結束采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。該方法可從發病植物組織及土壤中復雜的病原菌環境快速、準確地檢測出冬生疫霉。根據該方法構建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，對冬生疫霉疫情的早期預警、疫區的病原監測以及進出口安全等方面具有重要意義。
【專利說明】用于檢測冬生疫霉的引物對和探針及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學檢測技術，具體地說，涉及一種用于檢測冬生疫霉的引物對和探針及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]冬生疫霉(Phytophthora hibernalis Carne)是導致柑橘褐腐疫病的主要病原菌之一，柑橘褐腐疫病在果實采收前、采收后發生均可造成重大的經濟損失，尤其是在雨季。該病菌在澳大利亞西部的柑橘果實上首次被發現，隨后在歐洲、美洲及非洲等許多國家均有報道。該病菌主要侵染柑橘屬植物的果實和枝葉，還可侵染杜鵑、玫瑰、紅花、芝麻、番茄、蘋果等多種植物，導致植物出現枯萎、根腐或潰瘍癥狀。
[0003]因此開發冬生疫霉的早期快速檢測技術，對相關植物生產中的病害防控和無公害化具有重要的意義。
[0004]近年來，實時熒光定量PCR (熒光RT-PCR)技術及其相關分子檢測技術已廣泛用于植物病原菌消長動態的分子檢測與預警，然而國內外鮮有利用熒光RT-PCR技術檢測冬生疫霉方面的報道。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種用于檢測冬生疫霉的引物對和探針。
[0006]本發明的另一目的是提供用于檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法。
[0007]為了實現本發明目的，本發明的一種用于檢測冬生疫霉的引物對，其包括上游引物 PH-F:5，-CGACTTGCCACCGGGA-3，(SEQ IDN0.1)和下游引物 PH-R:5’ -AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0008]本發明還提供含有上述引物對PH-F和PH-R的用于檢測冬生疫霉的試劑盒。
[0009]本發明還提供一種用于檢測冬生疫霉的探針，所述探針為:5’-Fl-TTCCACAACCAATTCCAT-Ql-3’ (SEQ ID N0.3)，其中 Fl 為報告熒光基團，Ql 為非熒光性的淬滅基團。優選Fl為FAM熒光染料，Ql為MGB。
[0010]本發明還提供一種檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法:以樣品DNA為模板，采用引物對PH-F和PH-R以及上述探針進行熒光RT-PCR反應，每個循環結束采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。
[0011]上述熒光RT-PCR擴增反應中，25yL的反應體系含有成分如下:樣品DNAI μ L (0.0005-50ng)，10 X PCR 反應緩沖液(不含 Mg2+) 2.5 μ L, 25mM MgCL2 2.0 μ L, 2.5mMdNTP 2.0yL, 10 μ M引物PH-F I μ L, 10 μ M引物PH-R I μ L, 10 μ M探針 1.5 μ L, 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.3 μ L，ddH20 13.7 μ L。
[0012]熒光RT-PCR擴增反應過程中使用的退火溫度為60°C。優選地，反應程序為:950C 3min ；95°C 10s，60。。30s,40 個循環。
[0013]本發明還提供用于檢測冬生疫霉的試劑盒，其包括引物對PH-F和PH-R以及上述探針。
[0014]優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。
[0015]更優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0016]本發明在測序分析冬生疫霉及其近似種和近緣種的ITS序列的基礎上，分別設計用于檢測冬生疫霉的引物對和熒光探針。該探針與普通的Taqman探針不同之處在于3’端采用了非熒光性的淬滅基因，即淬滅基團吸收報告基團的能量后并不發光，大大降低了本底信號的干擾。
[0017]Taqman MGB探針技術，即將報告熒光染料標記在探針的5’端，而3’端采用了非熒光性的淬滅基因，二者構成能量轉移結構，即報告熒光染料所發射的熒光可被淬滅基團吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅基團的抑制作用消失，報告熒光染料信號增強，從而實現對冬生疫霉的檢測。
[0018]本發明根據冬生疫霉ITS序列，設計出可快速檢測冬生疫霉病菌的特異性引物對和探針，并在此基礎上建立了熒光RT-PCR檢測法，可從發病植物組織及土壤中復雜的病原菌環境快速、準確地檢測出冬生疫霉。根據該方法構建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，對冬生疫霉疫情的早期預警、疫區的病原監測以及進出口安全等方面具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發明實施例4中采用熒光RT-PCR技術檢測冬生疫霉的結果示意圖，其中，1:冬生疫霉(Phytophthora hibernalis,來源于澳大利亞)；2:冬生疫霉(P.hibernalis,來源于英國);3_4:丁香疫霉(P.syringae) ;5_7:雪松疫霉(P.lateralis)；8-9:櫟樹粹死病菌(P.ramorum) ；10-11:苜猜疫霉根腐病菌(P.medicaginis) ；12-13:馬鈴薯緋腐疫霉(P.erythroseptica) ;14_16:栗黑水疫霉(P.cambivora) ;17_18:草莓疫霉(P.fragariae) ; 19-20:樹霉疫霉(P.fragariae var.rubi) ；21:大豆疫霉(P.sojae) ；22:棕櫚疫霉(P.palmivora) ；23:辣椒霜霉(P.capsici) ；24:康沃爾疫霉(P.kernoviae) ；25:空白對照。
[0020]圖2是本發明實施例5中熒光RT-PCR檢測方法的靈敏度實驗結果示意圖，其中，1_8 的 DNA 濃度分別為 50ng/ μ L、5ng/ μ L、0.5ng/ μ L、0.05ng/ μ L、0.005ng/ μ L、
0.0005ng/y L、0.00005ng/y L 和 0.000005ng/μ L, 9 為空白對照。
【具體實施方式】
[0021]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0022]以下實施例均按照常規實驗條件，如SambiOOk等分子克隆實驗手冊(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper 等(Blackwell 科學出版社，1988)，鄭小波(疫霉菌及其研究技術，中國農業出版社，1997)中所述的操作技術規程，或按照制造廠商所建議的實驗條件。[0023]實施例1引物對及探針的設計與合成
[0024]根據冬生疫霉ITS序列，采用探針設計軟件Express 3.0設計引物對及探針，引物對序列為:
[0025]PH-F (正向引物):5’ -CGACTTGCCACCGGGA-3’
[0026]PH-R (反向引物):5’ -AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’
[0027]探針的序列為:5’-F1-TTCCACAACCAATTCCAT-Q1-3';其中，Fl 為 FAM 熒光染料，Ql為非熒光性的淬滅基團MGB。
[0028]上述引物對及探針序列合成由上海基康生物技術有限公司完成。
[0029]實施例2樣品總DNA的提取
[0030]包括以下步驟:
[0031]I)采集適量冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)真菌菌絲體或染病果實、葉片，用液氮研成粉末，取0.4g裝入1.5mL離心管中。
[0032]2)預熱CTAB提取液至65°C，向裝有粉末的1.5mL離心管中加入600 μ L預熱的CTAB提取液，混勻。
[0033]3)立即置于65°C水浴30min，然后加入5001^氯仿/異戊醇(24:1，體積比)，上下顛倒數次，13000g離心I分鐘。
[0034]4)吸取上清液約400 μ L至一個新的2.0ml離心管中，加入500 μ I氯仿/異戊醇(24:1) ,500 μ L CTAB提取液，輕輕混勻，13000g離心I分鐘。
[0035]5)取800μ I上清液至一個新的1.5mL離心管中，加入500μ L異丙醇，輕輕混勻，室溫放置20min。
[0036]6) 13000g離心2min，去上清，用70%乙醇洗沉淀，室溫干燥。
[0037]7)力卩入 50 μ L IXTE 緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，含 20 μ gRNase，pH 值
8.0 )，置于4°C過夜，待DNA溶解后，檢測DNA濃度及質量。
[0038]實施例3實時熒光定量PCR (突光RT-PCR)法的建立
[0039]1、熒光RT-PCR反應體系
[0040]以總DNA為模板，進行實時熒光PCR反應，反應體系(總體積25 μ L)為:樣品DNAI μ L (0.0005-50ng)，10 X PCR 反應緩沖液(不含 Mg2+) 2.5 μ L, 25mM MgCL2 2.0 μ L, 2.5mMdNTP 2.0yL, 10 μ M引物PH-F I μ L, 10 μ M引物PH-R I μ L, 10 μ M探針 1.5 μ L, 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.3 μ L，ddH20 13.7 μ L。
[0041]2、實時熒光PCR反應條件
[0042]將樣品管放入BIO-RAD公司IQ?5熒光PCR儀后，設置如下條件進行反應:第I個循環為95°C 3min;然后是95°C 10s,60°C 30s，40個循環。每個循環結束后采集數據。反應結束后根據擴增曲線判定結果。
[0043]實施例4冬生疫霉熒光RT-PCR檢測法的特異性分析
[0044]以冬生疫霉的總DNA為模板，以冬生疫霉的近似種及近緣種的總DNA為對照，通過熒光RT-PCR檢測熒光強度變化。
[0045]試驗結果:
[0046]以冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的總DNA為模板，通過實時突光PCR檢測可觀察到明顯的熒光強度變化，而冬生疫霉的近似種及近緣種，如丁香疫霉(P.syringae)、雪松疫霉(P.lateralis)、櫟樹粹死病菌(P.ramorum)、苜猜疫霉根腐病菌(P.medicaginis)、馬鈴薯緋腐疫霉(P.erythroseptica)、栗黑水疫霉(P.cambivora)、草莓疫霉(P.fragariae)、樹霉疫霉(P.fragariae var.rubi )、大豆疫霉(P.spjae)、棕櫚疫霉(P.palmivora)、辣椒霜霉(P.capsici )、康沃爾疫霉(P.kernoviae)的突光強度沒有變化，檢測結果如圖1所示。
[0047]實施例5冬生疫霉熒光RT-PCR檢測法的靈敏度分析
[0048]用超純水分別稀釋冬生疫霉的DNA，進彳了相對靈敏度檢測，在25 μ L反應體系中，DNA 分別為 50ng/μ L、5.0ng/μ L、0.5ng/μ L、0.05ng/μ L、0.005ng/μ L、0.0005ng/μ L、0.00005ng/ μ L和0.000005ng/ μ L。檢測結果如圖2所示，最低檢測限為0.0005ng/ μ L。
[0049]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的 基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1.用于檢測冬生疫霉的引物對，其特征在于，
上游引物 PH-F:5’ -CGACTTGCCACCGGGA-3’，
下游引物 PH-R:5’ -AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’。
2.用于檢測冬生疫霉的探針，其特征在于，所述探針為:5’ -F1-TTCCACAACCAATTCCAT-Q1-3'，其中Fl為報告熒光基團，Ql為非熒光性的淬滅基團。
3.根據權利要求2所述的探針，其特征在于，Fl為FAM，Ql為MGB0
4.檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法，其特征在于，以樣品DNA為模板，采用權利要求1所述的引物對以及權利要求2或3所述的探針進行熒光RT-PCR反應，每個循環結束采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，25μ L的反應體系含有成分如下:樣品DNA I μ L (0.0005-50ng)，10 X PCR 反應緩沖液(不含 Mg2+)2.5 μ L, 25mM MgCL22.0 μ L，2.5mMdNTP 2.0yL, 10 μ M引物PH-F I μ L, 10 μ M引物PH-R I μ L, 10 μ M探針 1.5 μ L, 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.3 μ L，ddH20 13.7 μ L。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，反應程序為:95°C3min ；95 °C 10s,60°C 30s, 40 個循環。
7.用于檢測冬生疫霉的試劑盒，其包括權利要求1所述的引物對以及權利要求2或3所述的探針。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征`在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。
9.根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
10.含有權利要求1所述引物對的用于檢測冬生疫霉的試劑盒。
【文檔編號】C12N15/11GK103725762SQ201210385102
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月11日 優先權日:2012年10月11日
【發明者】杜洪忠, 吳品珊 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院