專利名稱：一種耐酸性淀粉酶突變體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐酸性淀粉酶突變體及其制備方法。
背景技術(shù)：
酸性淀粉酶是在酸性條件下能水解淀粉的酶類，可應(yīng)用于酸性條件下淀粉原料的加工，顯著的耐酸性使其具有很大的應(yīng)用潛力和開發(fā)前景，廣泛應(yīng)用于青貯飼料、發(fā)酵飲料、廢液的處理等多種領(lǐng)域。酸性淀粉酶生產(chǎn)菌株的獲得主要通過篩選和突變獲得。篩選 的盲目性較大，不容易獲得目的菌株。突變包括自然突變和誘變，自然突變的幾率相當(dāng)小，誘變的工作量較大且不可控出現(xiàn)負突變的幾率較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種耐酸性淀粉酶突變體，其特征在于，淀粉酶催化區(qū)域內(nèi)組氨酸替換為天冬氨酸。所述淀粉酶突變體是以SEQ ID NO. I為出發(fā)序列，分別將第222位、第275位、第293位和第310位的組氨酸突變成天冬氨酸得到的突變體。所述SEQ ID NO. I 已提交 NCBI，序列號 NO: JQ768415。本發(fā)明還提供一種制備所述淀粉酶突變的方法，是將催化區(qū)域內(nèi)組氨酸突變成天冬氨酸。具體而言，是以SEQ ID NO. I為出發(fā)序列，分別將第222位、第275位、第293位和第310位的組氨酸突變成天冬氨酸。所述制備所述淀粉酶突變的方法，具體步驟如下I)根據(jù)枯草芽孢桿菌淀粉酶序列SEQ ID NO. I所示，采用化學(xué)全合成的方法全合成后克隆到質(zhì)粒pET-20b (+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAmyQ ；2)利用Swiss-model軟件對源自枯草芽孢桿菌淀粉酶(SEQ ID NO. I)進行模擬，獲得淀粉酶空間結(jié)構(gòu)；3)通過對淀粉酶空間結(jié)構(gòu)進行分析，確定要突變的組氨酸位點；4)設(shè)計突變引物，對淀粉酶基因序列進行定點突變，將組氨酸位點突變?yōu)樘於彼幔@得含有突變淀粉酶序列的重組載體；5)將突變后重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)表達，獲得淀粉酶突變體。表I淀粉酶突變引物序列
權(quán)利要求
1.一種耐酸性淀粉酶突變體，其特征在于，淀粉酶催化區(qū)域內(nèi)組氨酸替換為天冬氨酸。
2.權(quán)利要求I所述突變體，其特征在于，以SEQID NO. I為出發(fā)序列，分別將第222位、第275位、第293位和第310位的組氨酸突變成天冬氨酸得到的突變體。
3.權(quán)利要求I所述淀粉酶突變體的制備方法，其特征在于，將催化區(qū)域內(nèi)組氨酸突變成天冬氨酸。
4.權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，以SEQID NO. I為出發(fā)序列，分別將第222位、第275位、第293位和第310位的組氨酸突變成天冬氨酸。
5.權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟如下 1)根據(jù)枯草芽孢桿菌淀粉酶序列SEQID NO. I所示，采用化學(xué)全合成的方法全合成 后克隆到質(zhì)粒pET-20b (+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAmyQ ； 2)利用Swiss-model軟件對源自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)淀粉酶進行模擬，獲得淀粉酶空間結(jié)構(gòu)； 3)通過對淀粉酶空間結(jié)構(gòu)進行分析，確定要突變的組氨酸位點； 4)設(shè)計突變引物，對淀粉酶基因序列進行定點突變，將組氨酸位點突變?yōu)樘於彼幔@得含有突變淀粉酶序列的重組載體； 5)將突變后重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)表達，獲得淀粉酶突變體。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種耐酸性淀粉酶突變體及其制備方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌(Bacilus ssubtilis)淀粉酶為母本，采用分子生物學(xué)技術(shù)對枯草芽孢桿菌淀粉酶序列進行定點突變，在此改造條件下，枯草芽孢桿菌淀粉酶最適反應(yīng)pH由對照(突變前)例的7.0變?yōu)?.5；突變后，在pH4.5條件下，淀粉酶催化效率提高5倍。利用此策略可以大大提高淀粉酶的耐酸性，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。此策略對其它酶的性質(zhì)改造具有重要的指導(dǎo)意義。
文檔編號C12N9/28GK102965359SQ20121053285
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者陳堅, 堵國成, 劉龍, 李江華, 楊海泉 申請人:江南大學(xué)