大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體及其構建和表達的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體及其構建和表達。所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體是通過在pYN7443質粒的BamHI和SacI酶切位點之間插入根據梭菌密碼子偏愛化學合成的大腸桿菌lacZ基因（EclacZS）編碼序列構建而成的。通過對該表達載體轉化的梭菌進行大腸桿菌lacZ基因的活性測定證明了本發明的根據梭菌密碼子偏愛合成的來源于大腸桿菌的LacZ基因同樣也是一個適合于在梭菌中表達的報告基因。這對于通過比較不同啟動子及終止子來確定最優的啟動子終止子組合來構建高產丁醇的工程菌株具有重要的理論意義。
【專利說明】大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體及其構建和表達
【技術領域】
[0001]本發明屬生物工程【技術領域】，涉及一種大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體及其構建和表達，具體涉及一種根據梭菌密碼子偏愛化學合成的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體及其構建，以及將此表達載體在轉化入梭菌中能夠成功地看到大腸桿菌IacZ基因在梭菌中表達的應用。
【背景技術】
[0002]雖然近年來在梭菌的代謝工程已取得相當大的成績，但是幾個必須的遺傳工具的研究不佳限制了丙酮丁醇發酵的進一步發展，其中一個最重要的遺傳工具就是控制外源基因表達的報告基因。一個很好的報告基因可以幫助研究者詳細的研究溶劑梭菌中的不同的同源或者異源啟動子，從而可以進一步理解這些啟動子在梭菌中的調控功能。只有更好地理解啟動子的強度和調控功能才可以產生更加有效的梭菌表達載體，這樣的表達載體最終能夠被用作提高丙酮丁醇發酵的溶劑產量。在理解不同啟動子的強度和調控的前提下，結合反義RNA技術和基因敲除技術可以發展更加復雜的工程菌株來提高溶劑的產量。
[0003]由于目前并沒有有效的梭菌外源基因表達報告系統，所以目前就沒有詳細的梭菌啟動子的研究。而大腸桿菌基因在梭菌中表達的非常不理想，因而傳統的大腸桿菌野生型報告基因在梭菌中就不能很好的使用。對于另一個在其它許多菌株中使用非常良好的報告基因一綠色熒光蛋白，由于其需要足夠的氧來產生熒光的發色團，所以綠色熒光蛋白作為報告基因也不適合于梭菌。而非常適合作為梭菌報告基因的產氣莢膜梭菌氯霉素乙酰轉移酶則由于梭菌含有許多可能會干擾氯霉素乙酰轉移酶表達的高水平非特異性的乙酰輔酶A，因而應用前景也不是很理想。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題之一在于提供一種大腸桿菌IacZ基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。將其命名為EclacZS基因，它是通過梭菌偏愛密碼子生物法改造人工合成的。
[0005]本發明所要解決的技術問題之二在于提供一種梭菌OABC基因的啟動子，其核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。該啟動子是以 R27320 (5’_TCT, AGA, AAA, GGA, AAA, TAT, GAT,AAA, AAA, TTT, CA-3’)和 R27321 (5，-GGA, TCC, CAT, TAA, TAT, CGA, AAA, TAG, CTT, AAA, CCC, AAC-3’)為引物，以梭菌的基因組DNA (GenBank:AEOO1437.1)為模板，用日本TAKARA公司的高保真耐高溫DNA聚合酶Pyrobest經PCR擴增而得的。
[0006]本發明所要解決的技術問題之三在于提供一種包含上述梭菌OABC基因的啟動子的pYN7443質粒，它是在現有載體PS0S94的制備方法的基礎上通過把原有的ptb基因啟動子替換為上述梭菌OABC基因啟動子構建而成的，其中pS0S94制備方法參看U-B.Tummal etal., 1999, Applied Ana Environmental Microbiology, 9，3793 - 3799)。
[0007]本發明所要解決的技術問題之四在于提供一種大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體(pYN7443-EclacZS),它是在上述pYN7443質粒的BamHI和SacI酶切位點之間插入如上所述的EclacZS基因編碼的序列構建而成的。
[0008]本發明所要解決的技術問題之五在于提供一種所述大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體(pYN7443-EclacZS)的構建方法，具體包括以下步驟:
[0009]I)按照梭菌偏愛密碼合成生物法【A1-Sheng Xiong,Quan-hong Yao7R1-He Peng,Xian Li,Huiqin Fan,Zong-ming Cheng and Yi Li,Nucleic Acid Research, 2004,32(12),e98:1~10】設計引物,引物均為5’端至3’端,進而合成大腸桿菌IacZ基因；
[0010]2)構建包含梭菌OABC基因的啟動子的PYN7443質粒；
[0011]3)利用BamHI和SacI進行雙酶切后，通過T4DNA連接酶將大腸桿菌IacZ基因即EclacZS序列與pYN7443質粒連接，進而得到大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體pYN7443-EclacZS。
[0012]將該大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體pYN7443-EclacZS轉化到梭菌中并測定大腸桿菌IacZ基因的活性，具體步驟如下:
[0013]I)參照 Tardif 等的電擊方法(C Tardif et al., 2001, Journal of IndustrialMicrobiology &Biotechnology, 27, 271-274)轉化梭菌。
[0014]2)參照 U B.Tummal 等的方法(U_B.Tummal et al., 1999, Applied AnaEnvironmental Microbiology, 9, 3793-3799)進行大腸桿菌 IacZ 基因的活性測定。 [0015]針對目前梭菌中可以應用的報告基因非常少的情況，本發明根據梭菌密碼子偏愛合成了一種來源于大腸桿菌的LacZ基因，并構建了一種新型的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體，通過對該載體轉化的梭菌進行大腸桿菌IacZ基因的活性測定證明了本發明的根據梭菌密碼子偏愛合成的來源于大腸桿菌的LacZ基因同樣也是一個適合于在梭菌中表達的報告基因。這對于通過比較不同啟動子及終止子來確定最優的啟動子終止子組合來構建高產丁醇的工程菌株具有重要的理論意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發明的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體pYN7443-EclacZS的構建方式。
[0017]圖2為本發明的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體pYN7443-EclacZS轉化梭菌后涂布在含有紅霉素和X-gal的平板上的生長情況。
[0018]圖3為不同時間段的β -半乳糖苷酶酶活性。
【具體實施方式】
[0019]以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍,其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。
[0020]本發明所用的試劑若未經說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
[0021]本發明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》-書(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、Τ.曼尼阿蒂斯著，1994，科學出版社)。
[0022]實施例1大腸桿菌IacZ基因的合成[0023]按照梭菌(GenBank:AE001437.1)偏愛密碼子合成生物法【A1-Sheng Xiong,Quan-Hhong Yao,R1-He Peng,Xian Li,Huiqin Fan,Zong-ming Cheng and Yi Li,NucleicAcid Research, 2004, 32 (12), e98:1~10】設計如下引物，其中引物均為5，端至3’端，進而優化合成大腸桿菌lacZ基因。
【權利要求】
1.大腸桿菌IacZ基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
2.梭菌OABC基因的啟動子，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
3.包含權利要求2所述的梭菌OABC基因的啟動子的PYN7443質粒。
4.大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體，其特征在于，是在權利要求3所述的pYN7443質粒的BamHI和SacI酶切位點之間插入權利要求1所述的大腸桿菌IacZ基因編碼的序列構建而成的。
5.權利要求4所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)根據梭菌偏愛密碼子合成生物法合成大腸桿菌IacZ基因； 2)構建包含梭菌OABC基因的啟動子的PYN7443質粒； 3)將所述大腸桿菌IacZ基因與pYN7443質粒連接構建大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體。
6.權利要求4所述的梭菌穿梭表達載體轉化到梭菌中并測定大腸桿菌IacZ基因活性的方法，其特征在于，包括以下步驟: O電擊法轉化梭菌； 2)大腸桿菌IacZ基因的活性測定。
【文檔編號】C12N15/11GK103898098SQ201210571635
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優先權日:2012年12月25日
【發明者】姚泉洪, 田永生, 彭日荷, 許晶, 王波, 王麗娟, 韓靜 申請人:上海市農業科學院