專利名稱：msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種融合蛋白轉基因工程菌株。
背景技術：
血栓形成是一種涉及許多彼此相互作用的遺傳和環境因素的多因素變化的過程。而對于老年人其凝血系統又有其特殊性，老年人纖維蛋白原(FIB)含量、組織型纖溶酶原激活物增加以及纖溶酶原激活物抑制劑復合物的增加都導致老年人的高凝狀態，所以更容易形成血栓；其中研究發現絕經期后的女性的血栓發生率遠高于男性。老年人骨質疏松發病率較高，全球有2億骨質疏松患者，并且女性多于男性。根據世界衛生組織(WHO)的標準，美國國家健康和營養調查(NHANES III，1988 1994年)結果 表明，骨質疏松嚴重影響老年人生活質量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會出現骨質疏松性骨折，一旦患者經歷了第一次骨質疏松性骨折，繼發性骨折的危險明顯加大。中國老年人居于世界首位，現有骨質疏松癥患者9000萬，占總人口的
7.1%。隨著社會老齡化的進程，骨質疏松癥的發病率呈上升趨勢，預計到2050年將增加到
2.21億，那時全世界一半以上的骨質疏松性骨折將發生在亞洲，絕大部分在中國。有學者對1995 1996年美國骨質疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發生數進行調查顯示，每年發生骨質疏松性骨折150萬次，其中椎體骨折70萬次，腕部骨折20萬次，髖部骨折30萬次，其它骨折30萬次。對于老年人骨質疏松和血栓已成為常見多發病，且往往同時存在，特別是絕經期后的女性。如果患者服用多種藥物同時治療骨質疏松和血栓，容易產生藥物拮抗反應；若要錯開服藥時間一方面要靠考慮藥物的半衰期，另一方面還要考慮藥物有效濃度，而且給患者造成不便。目前缺乏一種可以同時有效治療骨質疏松和血栓的藥品。

發明內容
本發明要解決目前尚無同時有效治療骨質疏松和血栓藥品的缺陷，而提供的一種msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株。msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)，大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)按以下步驟制備一、將含有msCT-AcAP5融合蛋白基因的質粒載體pUC (msCT/AcAP5)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/AcAP5 ；四、用載體pGEX-msCT/AcAP5轉化大腸桿菌BL21 (DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)。
本發明中msCT_AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。本發明中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發明msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)發酵產生的msCT-AcAP5融合蛋白含有127個氨基酸。本發明msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)發酵產生的msCT_AcAP5融合蛋白可用于同時治療骨質疏松和血栓，適合同時患有這兩種疾病的患者使用。且msCT-AcAP5融合蛋白為微生物制劑，不產生拮抗反應，使用安全。本發明采用生物基因工程手段獲得大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)。采用本發明基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)可大規模發酵生產msCT_AcAP5融合蛋白，具有廣泛應用前景。本發明為治療骨質疏松和血栓奠定了物質基礎。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式msCT_AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌 BL21 (DE3-msCT/AcAP5)，大腸桿菌 BL21 (DE3_msCT/AcAP5)按以下步驟制備一、將含有msCT-AcAP5融合蛋白基因的質粒載體pUC (msCT/AcAP5)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/AcAP5 ； 四、用載體pGEX-msCT/AcAP5轉化大腸桿菌BL21 (DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)。本實施方式步驟四采用電擊轉化法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施 方式一的不同點在于步驟一中質粒載體pUC (msCT/AcAP5)酶切反應體系為
pUC ( msCT/AcAP5 )20μ1
IOXM buffer6μ1
BamHX3μ1
EcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。其他步驟及參數與具體實施方式
一相同。本實施方式步驟一酶切反應在37°C條件下反應10h，然后1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二的不同點在于步驟二中質粒pGEX-6P-l酶切反應體系為
載體 pGEX-6P-l20 μ IOXM buffer 6μ1BamHX 3μ1EcoR I 3μ1不含 DNA 酶的 ddH20 28μ1。其他步驟及參數與具體實施方式
一或二相同。本實施方式步驟二酶切反應在37°C條件下反應10h，然后O. 6%瓊脂糖凝膠電泳，
目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一、二或三的不同點在于步驟三
中酶連接反應體系為
雙酶切的載體PGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA片段Ι3μ110 X Τ4 DNA 連接酶 buffer 2μ1Τ4 DNA連接酶 2μ1。其他步驟及參數與具體實施方式
一、二或三相同。本實施方式步驟三酶連接反應在16 °C條件下進行。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一的不同點在于步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。其他步驟及參數與具體實施方式
一至四之一相同。本實施方式msCT_AcAP5融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的質粒載體pUC (msCT/AcAP5)。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一的不同點在于步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。其他步驟及參數與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌 BL21 (DE3-msCT/AcAP5)，大腸桿菌 BL21 (DE3_msCT/AcAP5)按以下步驟制備一、將含有msCT-AcAP5融合蛋白基因的質粒載體pUC (msCT/AcAP5)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/AcAP5 ；四、用載體pGEX-msCT/AcAP5轉化大腸桿菌BL21 (DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21(DE3_msCT/AcAP5)；其中步驟一中質粒載體pUC (msCT/AcAP5 )酶切反應體系為
pUC ( msCT/AcAP5 )20 μ
IOXM buffer6μ1
BamHX3μ1
EcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1；其中步驟二中質粒pGEX-6P-l酶切反應體系為
載體 pGEX-6P-l20 μ
IOXM buffer6μ1
BamHX3μ1 Ι',αυΚ I 3 μ
不含DNA酶的ddH2028μ1其中步驟三中酶連接反應體系為
雙酶切的載體PGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA片段Ι3μ1
10ΧΤ4 DNA 迮接峋 buffer2μ1
Τ4 DNA連接酶2μ1。其中步驟一中msCT_AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示；步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。本實施方式中msCT_AcAP5融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的質粒載體pUC (msCT/AcAP5)。本實施方式在構建msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)時去除了 AcAP5基因的原始信號肽，而且在msCT和犬鉤蟲抗凝血肽之間插入Kpn I酶切位點，既可以提高所編碼融合蛋白的穩定性，同時也改變融合蛋白的二級結構，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因兩側分別加上BamHI和EcoR I酶切位點，而且根據大腸桿菌偏愛密碼子的特點，重新設計了融合基因編碼堿基序列。
載體pGEX-6P-l上不含有Kpn I酶切位點，本實施方式合成的pGEX_msCT/AcAP5均能為Kpn I單酶切開，說明本實施方式msCT-AcAP5融合蛋白成功導入質粒pGEX_6P_l中。然后將質粒pGEX-msCT/AcAP5導入大腸桿菌BL21 (DE3)中，選取陽性克隆。隨機挑取陽性克隆大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)菌落37°C過夜培養，提取質DNA，用Kpn I進行單酶切，并用相應的空白質粒PGEX-6P-1作為對照，將含有Kpn I酶切位點的質粒進行基因測序。測序工作委托生物公司進行，大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)內含有SEQ ID NO 1所示DNA。將大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)置于LB培養基28°C環境條件下培養15h，然后采用GST標簽融合蛋白純化方法進行蛋白的分離純化，本實施方式用于治療骨質疏松和血栓的融合蛋白的純度為98%，融合蛋白的表達量為38. 2%。利用本實施方式大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)發酵獲得的msCT_AcAP5融合蛋白進行試驗 msCT-AcAP5融合蛋白治療骨質疏松實驗取雌性SD大鼠在無菌條件下摘除雙側卵巢，12周后取存活健康大鼠32只，隨機分為4組(陽性對照組1、陽性對照組2、融合蛋白實驗組和陰性對照組)，每組8只。另取雌性SD大鼠切除雙側一小塊脂肪，12周后隨機取存活健康大鼠8只作為假手術對照組。共計5組，分別口服以下藥物假手術對照組質量濃度為O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；陰性對照組質量濃度為O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；融合蛋白實驗組質量濃度為O. 5%的msCT-AcAP5融合蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；(獲得的用于治療骨質疏松和血栓的msCT-AcAP5融合蛋白用無菌水溶解)陽性對照組1:阿侖膦酸鈉(Alen) 5mg/kg ；陽性對照組2 :質量濃度為O. 5%的msCT蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg。連續給藥三個月，處死后取大鼠股骨頭，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金剛石鋸將股骨頭矢面鋸開，取其一片，經清洗，10%次氯酸鈉浸泡6h，超聲清洗15min，乙醇梯度脫水，乙醚浸泡，干燥，離子濺射鍍膜，SX-40掃描電鏡觀察，加速電壓20kV。觀察骨質疏松治療對比實驗結果，實驗結果見表1，結果表明融合蛋白實驗組、陽性對照組I和陽性對照組2都具有治療骨質疏松的作用，且融合蛋白實驗組的效果最好。表I骨小梁寬度的比較和骨面積(X土SD)
miI給藥劑量 I骨小梁寬度X±SD~I骨小梁面積X±SD~
假手術對照組 8 5ml/kg112. 50+14.89 0.6911+0.0510
陰性對照組8 5ml/kg52.34+16.8O. 5347 + 0.0500
陽性對照組 I 8 5ml/kg115. 76 + 14.50.6962 + 0.0593
陽性對照組 2 8 5ml/kg117. 52 + 14.10.6970 + 0.0485
融合蛋白實驗組~8 5ml/kg124. 78+15. 9O. 7051+0. 0438融合蛋白(msCT_AcAP5)通過靜脈注射給藥治療骨質疏松效果更佳。
msCT-AcAP5融合蛋白抗大鼠血栓實驗取SD大鼠48只，隨機分為6組，每組8只，即空白組、對照組I (陽性藥)、對照組2(AcAP5多肽)和msCT-AcAP5融合蛋白低、中、高劑量組。對照組I選用肝素鈉注射液(給藥劑量為1650 U/kg)，對照組2 (給藥劑量為200 μ g/kg)，msCT-AcAP5融合蛋白低、中、高劑量組(給藥劑量5倍遞增)的給藥劑量分別為40 μ g/kg、200 μ g/kg、I mg/kg,空白組給予同體積的生理鹽水。全部由靜脈注射給藥，經靜脈注射給藥后，立即將分離好的頸動脈置于YLS-14B小動物血栓生成儀的探測接頭內，啟動血栓生成儀，用恒流直流電刺激(I mA)。記錄探頭通過紅外掃描測量血液的流通量并換算出血管堵塞程度(測量的時間間隔為4 S，以百分數表示數據，全部過程持續5 min)。觀察抗血栓治療實驗結果，實驗結果見表2，結果表明空白組的頸動脈堵塞程度與另外五組都用明顯的區別。表2 msCT_AcAP5融合蛋白抗大鼠頸總動脈血栓的效果[n，(Y±s) %]
權利要求
1.msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)，大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)按以下步驟制備 一、將含有msCT-AcAP5融合蛋白基因的質粒載體pUC(msCT/AcAP5 )用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ； 三、msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/AcAP5 ； 四、用載體pGEX-msCT/AcAP5轉化大腸桿菌BL21(DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)。
2.根據權利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟一中質粒載體pUC (msCT/AcAP5)酶切反應體系為 pUC (msCT/AcAP5)20 μ IOXM buffer6μ1 BamHX3μ1 KcoR I3 μ 不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。
3.根據權利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟二中質粒pGEX-6P-l酶切反應體系為載體 pGEX-6P-l20 μ IOXM bufferΟμΙ BamHl^μ EcoR I3μ1 不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。
4.根據權利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟三中酶連接反應體系為 雙酶切的載體PGEX-6P-13 μ 融合蛋白的DNA片段13μ1 10ΧΤ4 DNA 迮接iW buiicv2μ1Τ4 DNA連接酶2μ1。
5.根據權利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。
6.根據權利要求5所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
全文摘要
msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株，它涉及一種融合蛋白轉基因工程菌株。解決目前尚無同時有效治療骨質疏松和血栓藥品的缺陷。msCT-AcAP5融合蛋白轉基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3-msCT/AcAP5)按以下步驟制備一、獲得融合蛋白DAN片段；二、雙酶切質粒；三、酶連接；四、轉化大腸桿菌BL21。本發明可用于醫藥制備領域。
文檔編號C12N1/21GK103013900SQ20121058541
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者余瓊 申請人:黑龍江大學