專利名稱：降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種融合蛋白及其編碼基因。
背景技術：
目前,我國現有高血壓患者2億多人,每年增加1000萬人。高血壓是心腦血管疾病的首要危險因素，高血壓的常見心腦血管并發癥(腦卒中、心臟病)約占居民總死亡的40%。另外，血栓病在中老年人中發病也較高，據國內外醫學統計資料表明腦血栓的致死率幾乎占所有疾病的第一位。降鈣素基因相關肽(CGRP)是Rosenfeld等于1983年發現的一種生物活性肽，它與降鈣素(CT)均來源于位于11號染色體的CT/CGRP基因，由于CT/CGRP基因不同的RNA編碼而翻譯成CGRP和CT，CGRP是應DNA基因重組和分子生物技術研究發現的一種由37個氨基酸組成的生物活性多肽，是迄今發現的最強的內源性擴血管肽類物質，對神經、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系統具有重要作用。CGRP的舒張冠狀血管的作用遠強于P物質，心鈉素和去甲腎上腺素(NE)，比乙酰膽堿(Ach)、5-羥色胺(5-HT)等強10000倍左右，比異丙腎上腺素強10-100倍。犬鉤蟲抗凝血肽(anticoagulant peptide, AcAPs)是犬鉤蟲吸血時,其頭腺分泌一種具有抗凝血活性的物質，該物質本質是一種蛋白水解酶，具有延長血漿凝血酶原時間、抑制血液凝固以及促進纖維蛋白溶解的作用。AcAPs目前應用的有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三種重組蛋白。其中rAcAP5由77個氨基酸組成，含10個半胱氨酸，形成5對二硫鍵(C6-C50，C15-C42，C21-C37，C25-C69，C50-C63)，主要由二硫鍵決定其二級結構，從而決定其生物活性。它是Xa因子(凝血因子)的高效特異性抑制劑，阻斷凝血的共同途徑，達到抗凝血作用。AcAPs的抗凝血、抗血栓作用，使其在臨床上成為一種新的抗凝劑和抗血栓藥物。然而目前這兩種蛋白單獨作用，效果單一。

發明內容
本發明的目的在于提供降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白及其編碼基因，以期獲得一種能同時具有治療高血壓和抗血栓雙重作用的融合蛋白，兩種蛋白之間作用互補且協同增效。本發明降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。上述降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白編碼基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。本發明的有益效果本發明進行合理設 計，將降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合，兩者之間作用互補且協同增效，所得融合蛋白經實驗證實具有很好的抗血栓和治療高血壓的作用。本發明的融合蛋白可由于制備抗血栓及預防和治療高血壓疾病的藥物，為抗凝血及預防和治療高血壓疾病的研究打下基礎。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本實施方式降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白的制備方法，按以下步驟進行一、融合蛋白CGRP/AcAP5基因的合成CGRP和AcAP5融合基因內設計一個Kpn I酶切位點，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因兩端分·別添加BamH·I和EcoR I酶切位點，然后克隆在PUC57 載體上，獲得 pUC (CGRP/AcAP5)載體；
·
二、重組表達載體的構建將步驟一獲得的pUC (CGRP/AcAP5)載體用BamHI和EcoR I雙酶切，再與同樣經BamHI和EcoR I雙酶切的表達載體pGEX_6P_l連接，獲得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重組表達載體pGEX_CGRP/AcAP5 ；三、基因工程菌株的構建然后將載體pGEX-CGRP/AcAP5轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，隨機挑取轉化菌37°C過夜培養，采用質粒提取試劑盒(購買自北京艾德萊生物科技有限公司)提取質粒DNA，用Kpn I單酶切，并用相應的空白質粒pGEX_6P_l作為對照，將含有Kpn I酶切位點的質粒進行基因測序，測序結果正確的即為陽性重組菌；其中大腸桿菌BL21 (DE3)為購買得到；四、融合蛋白的誘導表達與純化將陽性重組菌置于LB培養基28°C培養15h，然后采用GST標簽融合蛋白方法進行蛋白的分離純化，本實施方式降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白的純度為98%，融合蛋白表達量為38. 1%。步驟二中pUC (CGRP/AcAP5)載體用BamHI和EcoR I雙酶切的體系如下
權利要求
1.降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽ACAP5融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.如權利要求1所述降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白的編碼基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
全文摘要
降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白及其編碼基因，涉及一種融合蛋白及其編碼基因。本發明的目的在于提供降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白及其編碼基因，以期獲得一種能同時具有治療高血壓和抗血栓雙重作用的融合蛋白，兩種蛋白之間作用互補且協同增效。融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發明將降鈣素基因相關肽和犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合，兩者之間作用互補且協同增效，所得融合蛋白經實驗證實具有很好的治療高血壓及抗血栓的作用。本發明的融合蛋白可由于制備抗血栓及預防和治療高血壓疾病的藥物。
文檔編號C12N15/62GK103031294SQ20121058541
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者余瓊 申請人:黑龍江大學