專利名稱：產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其構建方法
技術領域：
本發明涉及ー種基因工程菌株及其構建方法。
背景技術：
Rosenfeld等于1983年發現降鈣素基因相關肽(CGRP)是ー種生物活性肽，它與降鈣素(CT)均來源于位于11號染色體的CT/CGRP基因，但是由于CT/CGRP基因不同的RNA編碼而翻譯成CGRP和CT，CGRP是應DNA基因重組和分子生物技術研究發現的ー種由37個氨基酸組成的生物活性多肽，是目前發現的最強的內源性擴血管肽類物質，對神經、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系統具有重要作用。CGRP的舒張冠狀血管的作用遠強于P物質，心鈉素和去甲腎上腺素(NE)，比こ酰膽堿(Ach)、5-羥色胺(5-HT)等強10000倍左右，比異丙腎上腺素強10-100倍。犬鉤蟲吸血時，其頭腺能分泌ー種抗凝血活性物質，被稱作犬鉤蟲抗凝血肽(anticoagulant peptide, AcAPs)。該物質本質是ー種蛋白水解酶,具有延長血衆凝血酶原時間(Pt)、抑制血液凝固以及促進纖維蛋白溶解的作用。目前發現的AcAPs有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三種重組蛋·白，其中AcAPc2(10KD)是Xa因子的高效特異抑制劑，其抗血栓效果明顯優于凝血酶抑制劑，AcAPc2作為Xa因子的高效特異抑制劑對血小板聚集功能影響甚小，用于抗血栓治療時引發出血的危險性小。1998年，Donnelly等報道AcAPc2在體內還具有抗腫瘤細胞轉移的作用。AcAPc2的抗凝血、抗血栓作用，使之具有成為臨床上ー種新的抗凝劑和抗血栓治療藥物。然而目前這兩種蛋白単獨作用，效果單一。

發明內容
本發明的目的在于提供ー種產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其構建方法，該菌株可以生產CGRP-AcAPc2融合蛋白，CGRP-AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治療高血壓雙重作用。本發明產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。上述產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的構建方法，按以下步驟進行一、在CGRP和AcAPc2融合基因內設計ー個Kpn I酶切位點，合成核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因兩端分別添加BamHI和EcoR I酶切位點，然后克隆在pUC57載體上，獲得pUC (CGRP/AcAPc2)載體；ニ、將步驟一獲得的pUC (CGRP/AcAPc2)載體用BamHI和EcoR I雙酶切，再與同樣經BamHI和EcoR I雙酶切的表達載體pGEX_6P_l連接，獲得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重組表達載體pGEX-CGRP/AcAPc2 ；三、然后將載體pGEX-CGRP/AcAPc2轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，隨機挑取轉化菌37°C過夜培養，采用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，用Kpn I單酶切，并用空白質粒PGEX-6P-1作為對照，將含有Kpn I酶切位點的質粒進行基因測序，測序結果正確的即為陽
性重組菌。本發明的有益效果本發明基因工程菌株可以生產CGRP_AcAPc2融合蛋白，降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2之間作用互補且協同增效，CGRP-AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治療高血壓雙重作用。本發明基因工程菌株生產的融合蛋白的純度為98%，融合蛋白表達量為38. 1%。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。
具體實施方式
ニ具體實施方式
一所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
具體實施方式
三具體實施方式
一所述產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的構建方法，按以下步驟進行一、在CGRP和AcAPc2融合基因內設計ー個Kpn I酶切位點，由上海生エ公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因兩端分別添加BamHI和EcoR I酶切位點，然后克隆在pUC57載體上，獲得pUC (CGRP/AcAPc2)載體；ニ、將步驟一獲得的pUC (CGRP/AcAPc2)載體用BamHI和EcoR I雙酶切，再與同樣經BamHI和EcoR I雙酶切的表達載體pGEX_6P_l連接，獲得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重組表達載體pGEX-CGRP/AcAPc2 ；三、然后將載體pGEX-CGRP/AcAPc2轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，隨機挑取轉化菌37°C過夜培養，采用質粒提取試劑盒(購買自北京艾德萊生物科技有限公司)提取質粒DNA，用Kpn I單酶切，并用空白質粒PGEX-6P-1作為對照，將含有Kpn I酶切位點的質粒進行基因測序，測序結果正確的即為陽性重組菌；其中大腸桿菌BL21 (DE3)為購買得到。步驟ニ中pUC (CGRP/AcAPc2)載體用BamHI和EcoR I雙酶切的體系如下
權利要求
1.產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株，其特征在于該基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。
2.根據權利要求1所述的產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株，其特征在于所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所 ο
3.如權利要求1所述的產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的構建方法，其特征在于該方法按以下步驟進行 一、在CGRP和AcAPc2融合基因內設計一個KpnI酶切位點，合成核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因兩端分別添加BamHI和EcoR I酶切位點，然后克隆在pUC57載體上，獲得pUC (CGRP/AcAPc2)載體； 二、將步驟一獲得的pUC(CGRP/AcAPc2)載體用BamHI和EcoR I雙酶切，再與同樣經BamHI和EcoR I雙酶切的表達載體pGEX_6P_l連接，獲得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重組表達載體 pGEX-CGRP/AcAPc2 ； 三、然后將載體pGEX-CGRP/AcAPc2轉化到大腸桿菌BL21(DE3 )中，隨機挑取轉化菌37 °C過夜培養，采用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，用Kpn I單酶切，并用空白質粒PGEX-6P-1作為對照，將含有Kpn I酶切位點的質粒進行基因測序，測序結果正確的即為陽性重組菌。
4.根據權利要求3所述的產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中pUC (CGRP/AcAPc2)載體用BamHI和EcoR I雙酶切的體系如下 成分用量 pUC (CGRP/AcAPc2)載體20μΕ IOxM buffer6μL BamWl3 pL EcoR I3μ ddH2028pL 酶切反應條件37°C水浴，IOh0
5.根據權利要求3所述的產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中表達載體PGEX-6P-1雙酶切的體系如下成分用量 pGEX-6P~ I20μIOxM buffer6pLBamHX3pL EcoR I3 pLddH2028μ 酶切反應條件37°C水浴，IOh0
6.根據權利要求3所述的產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中連接反應體系如下 成分用量 目的基因 CGRP/AcAPc213μΙ, 酶切后pGEX-6P-l載體3pL T4 DNA連接酶2μ IOxT4 DNA 連接酶 buffer2μL 連接反應條件16°C水浴，8 12h。
全文摘要
產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其構建方法，涉及一種基因工程菌株及其構建方法。本發明的目的在于提供一種產降鈣素基因相關肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其構建方法，該菌株可以生產CGRP-AcAPc2融合蛋白，該融合蛋白具有治療高血壓和抗血栓雙重作用。該基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAPc2基因。方法一、融合蛋白CGRP/AcAPc2基因的合成；二、重組表達載體構建；三、將重組表達載體轉化到大腸桿菌中，提取轉化菌質粒DNA，用KpnⅠ單酶切，基因測序，測序結果正確的為陽性重組菌。本發明用于生產具有抗血栓和治療高血壓雙重作用的融合蛋白。
文檔編號C12N1/21GK103031267SQ20121058541
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者余瓊 申請人:黑龍江大學