專利名稱：節桿菌zjb-09277及其在制備(s)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的菌種-節桿菌ZJB-09277 (Arthrobacter sp.ZJB-09277)，及利用該微生物選擇性拆分3-氰基-5-甲基己酸酯制備普瑞巴林中間體
(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。
背景技術：
(S)-3_氰基-5-甲基己酸是合成普瑞巴林的重要手性中間體。普瑞巴林，化學名為⑶-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，是由美國輝瑞公司開發的的Y-氨基丁酸的3位異丁基取代物(Angew Chem Int Ed, 2008, 47(19): 3500-3504)。由于普瑞巴林能夠有效抑制與神經病理性疼痛、癲癇相關的神經元過度興奮及神經遞質釋放增加(Curr OpinPharmacol, 2006, 6(1): 108- 113)，已被FDA批準用于帶狀皰疹后神經痛、糖尿病外周神經痛、癲癇、纖維肌痛等。與傳統藥物相比，普瑞巴林的劑量更低、服用次數少、副作用小、持續時間長、耐受性強(Curr Med Res Opin, 2006，22(2): 375-384)，因此被國際疼痛學會(IASP)、歐洲神經病學學會聯盟(EFNS)和英國NICE等多個國際指南推薦為一線治療藥物，國內外市場前景十分廣闊。國內外報道了大量有關普瑞巴林及其中間體合成工藝的文獻，可歸為手性拆分法、不對稱催化法、手性配體法和手性化合物直接合成法等四大類化學合成工藝。由于上述工藝步驟冗長、手性拆分試劑昂貴、反應條件苛刻、有毒有害溶劑用量大，而無法實現規模化生產。生物催化法由于反應條件溫和、立體選擇性高、環境友好等優點成為最受矚目的醫藥及精細化學品合成技術之一。目前，已報道的生物催化合成普瑞巴林手性中間體工藝主要有以下幾種:Xie 等(Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, 41: 75 - 80)以從Arabidopsis thaliana中克隆得到的重組腈水解酶AtNitl為催化劑拆分外消旋異丁基丁二腈合成(S) -3-氰基-5-甲基己酸，ee值高達98%，(S) -3-氰基-5-甲基己酸催化加氫，制得普瑞巴林。Felluga 等(Tetrahedron: Asymmetry, 2008, 19(8): 945-955)報道了以異戊醛為原料，在t-Bu0K存在條件下與Witting試劑反應，得到α，β -不飽和酸酯。α，β-不飽和酸酯與硝基甲烷發生Michael加成得到外消旋β-異丁基-Y-硝基酯，經Novozyme 435動力學拆分得到S型β-異丁基-Y-硝基酸,最后在酸性環境中氫化還原得到普瑞巴林。Sterimbaum 等利用 Candida antartica 脂肪酶 CALB (Candida antarcticlipase B)選擇性酯化3_異丁基戊二酸，產物ee為95.5%，再通過化學反應得到普瑞巴林(W02009158343-A1)。Thijs等在拆分步驟引入豬肝臟酯酶對吡咯酮化合物進行動力學拆分，ee值達到97%，最后在酸性條件下水解2-吡咯酮得到普瑞巴林(W02009149928-A1)。輝瑞公司普瑞巴林生產工藝已經更新至第二代，該工藝引入脂肪酶Lipolase催化拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。該手性中間體經脫羧、堿性水解、氫化等步驟制得普瑞巴林(US20050283023)。
發明內容
本發明目的是提供一株可用于制備光學純(S)-3_氰基-5-甲基己酸的新菌種——節桿菌ZJB-09277 (Arthrobacter sp.ZJB-09277)。其次提供該新微生物在選擇性拆分外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用。本發明采用的技術方案是:本發明涉及一種節桿菌ZJB-09277 (Arthrobacter sp.ZJB-09277),保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22日。該新菌株特征如下:菌落形態:30 °C在牛肉膏蛋白胨平板培養24 h，菌落呈圓形，直徑2 3 mm，隆起形狀為凸鏡狀，乳白色·，邊緣整齊，光滑。菌落隨時間的延長而增大，數天后直徑可達5 _以上。細胞形態:16 h培養物的細胞呈不規則的桿狀，0.8 1.2 μ mX 1.8^8.0 μπι。呈V形排列，端圓，無絲狀體，無芽孢形成。培養時間延長，細胞逐漸變短，老培養物變成球狀。生理生化特征:革蘭氏陽性，接觸酶陽性，利用Biolog (GENIII)自動微生物鑒定系統對菌株進行了 94種表型測試，包括71種碳源利用情況檢測以及23種化學敏感性檢測，具體特征見表I及表2。本發明所涉及的微生物是通過以下方法篩選得到的:(I)稱取從杭州及周邊地區采集的土樣I g加入到9 ml 0.85%的生理鹽水中，在渦流振蕩器上充分混勻。取上清I ml，加入到49 ml富集培養基中，30°C，150 rpm下培養72 h，然后再取I ml培養基加入到49 ml的富集培養基，30°C，150 rpm下培養72 h，如此進行三輪富集。富集培養基以2 3 g/L (R，S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為唯一碳源，其它組分如下(g/L): (NH4)2SO4:5 15，MgSO4.7H20:0.5 1，NaCl:Γ .5，K2HPO4:Γ2, FeSO4.7Η20:
0.01 0.03，以蒸餾水配制，用1.0 M鹽酸或NaOH溶液調節pH至6.(Γ8.0。(2)最后一次富集培養液稀釋后涂布到平板培養基上，挑取單菌落至斜面保藏。平板培養基及斜面培養基為富集培養基中加入1.5^2.0%的瓊脂。(3)挑取的單菌落接種到發酵培養基，組份如下(終濃度):葡萄糖1(T20 g/L，酵母膏 5 15 g/L, (MM)2SO4 5 15 g/L，MgSO4.7H20 0.5 I g/L，NaCl Γ .5 g/L，K2HPO4 I 2g/L, FeSO4.7H 20 0.θΓθ.03 g/L, pH 6.0^8.0(115。C 下，滅菌 30 min) ;25 35°C下，搖瓶轉速15(T200 rpm，培養48 72 h，離心后懸浮于磷酸緩沖液體系中，加入(R，S)_3_氰基-5-甲基己酸酯作為底物，進行轉化。(4)用手性毛細管氣相色譜法分析底物和產物的含量及對映體過量值(ee)。所用氣相色譜儀為用日本島津GC-14C，手性毛細管氣相色譜柱為BGB-174。色譜條件為:進樣量1.0 μ 1，進樣口、檢測器的溫度均為220 °C;載氣為氦氣，流速為1.6 mL/min，流量為40 mL/min,分流比為30:1。3-氰基-5-甲基己酸乙酯和3-氰基-5-甲基己酸丙酯的程序升溫條件為:初始溫度為130 °C，保持17 min,以10 °C/min的速度升到170 °C，保持13 min ;3_氰基-5-甲基己酸丁酯的程序升溫條件為:110°C持30 min,5°C/min升溫至170°C,保持14 min ;3_氰基-5-甲基己酸戊酯的程序升溫條件為:130°C保持45 Hiinao0C /min升溫至170°C，保持11 min。本發明還涉及節桿菌ZJB-09277在制備(S) _3_氰基_5_甲基己酸中的應用，所述的應用為:以式(I )所示外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯為底物，以節桿菌ZJB-09277發酵培養獲得的濕菌體或含濕菌體的菌懸液為催化劑，于PH 6.5^8.0的緩沖液構成的轉化反應體系a中，在25、0°C下轉化反應,反應完全后,將反應液分離純化得到式(II)所示(S)-3-氰基-5-甲基己酸；
權利要求
1.節桿菌ZJB-09277(Arthrobacter sp.ZJB-09277)，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22曰。
2.—種權利要求1所述節桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用，其特征在于所述的應用為:以式(I )所示外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯為底物，以節桿菌ZJB-09277發酵培養獲得的濕菌體或含濕菌體的菌懸液為催化劑，于pH 6.5^8.0的緩沖液構成的轉化反應體系a中，在25、0°C下轉化反應,反應完全后,將反應液分離純化得到式(II)所示⑶-3-氰基-5-甲基己酸；
3.如權利要求2所述節桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用，其特征在于所述轉化體系a中底物初始濃度為100 400mmol/Lo
4.如權利要求2所述節桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用，其特征在于所述轉化體系a中催化劑的質量用量以濕菌體的質量計為10(T300 g/L，所述濕菌體含水質量為7(Γ90%。
5.如權利要求2所述節桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用，其特征在于所述轉化體系a還包括有機溶劑，由底物、催化劑、有機溶劑與pH 6.5^8.0的緩沖液構成轉化體系b，有機溶劑占轉化體系b總體積1(Γ80%，轉化體系b中底物初始濃度為100 400mmol/L，催化劑的質量用量以濕菌體的質量計為10(T300 g/L，所述濕菌體含水質量為70 90%。
6.如權利要求5所述節桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用，其特征在于所述有機溶劑為二甲基亞砜、二甲基甲酰胺或乙腈。
7.如權利要求2或5所述節桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用，其特征在于所述轉化反應是在25飛(TC下轉化反應12、6 h。
8.如權利要求2所述節桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用，其特征在于所述轉化反應液分離純化方法為:反應結束后，將轉化反應液離心，取上清液用等體積的乙酸乙酯萃取，有機層即為含(S)-3-氰基-5-甲基己酸的粗品，將粗品提純即獲得(S) -3-氰基-5-甲基己酸。
9.如權利要求2所述節桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備: (1)斜面培養:將節桿菌ZJB-09277接種至斜面培養基，在3(T35°C下恒溫培養48 72h后，獲得斜面菌體；所述斜面培養基終濃度組成為:葡萄糖1(T20 g/L，酵母膏5 15 g/L,(MM)2SO4 5 15 g/L，MgSO4.7Η20 0.5 I g/L,NaCl Γ .5 g/L,K2HPO4 I 2 g/L，FeSO4.7Η200.0Γ0.03 g/L，瓊脂 15 20 g/L，溶劑為水，pH 6.0 8.0 ; (2)發酵培養:從斜面菌體上挑取一接種環菌體，接種至發酵培養基，在3(T35°C、150^200 rpm條件下振蕩培養36 72 h，培養結束后將發酵液離心，沉淀用生理鹽水洗滌后，收集濕菌體，將濕菌 體懸浮于pH 7.0的磷酸緩沖液中，獲得含濕菌體的菌懸液；所述發酵培養基終濃度組成為:檸檬酸鈉1(T25 g/L，酵母提取粉2(T40 g/L, Na2HPO4 Γ2 g/L,KH2PO4 Γ2 g/L，MgSO4.7H20 0.5 I g/L，FeSO4.7H20 0.θΓθ.03 g/L，NaCl Γ .5 g/L，溶劑為水，pH 6.0 8.0。
全文摘要
本發明公開了一種節桿菌ZJB-09277(Arthrobacter sp. ZJB-09277)及其在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國 武漢 武漢大學，保藏編號CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22日；本發明提供了一種立體選擇性水解制備 (S)-3-氰基-5-甲基己酸的新菌種，通過該菌種可制備普瑞巴林的重要手性中間體——(S)-3-氰基-5-甲基己酸；本發明中所述(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制備方法具有原子經濟性高、條件溫和、環境友好等優點，具有較高的工業化應用潛力。
文檔編號C12N1/20GK103114054SQ20121059404
公開日2013年5月22日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者鄭裕國, 鄭仁朝, 李愛朋, 沈寅初 申請人:浙江工業大學