一種重組表達的ADAM15h融合蛋白及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種真核細胞重組表達的去整合素金屬蛋白酶ADAM15完整胞外段及其制備方法與應用，目的是提供一種可用于生產、研究用的ADAM15蛋白。本發明所提供的重組ADAM15h蛋白，是由pSCT-ADAM15h轉化宿主細胞系后表達得到的ADAM15h融合蛋白。本發明提供了該重組ADAM15h融合蛋白的制備方法，即用pSCT-ADAM15h轉化宿主細胞系，被轉化的宿主細胞系經培養篩選出重組ADAM15h高效表達克隆，得到重組ADAM15h融合蛋白。本發明還提供了從細胞培養上清中純化ADAM15h融合蛋白的方法及利用切割熒光底物檢測重組ADAM15h酶活的活性檢測方法。
【專利說明】—種重組表達的ADAM15h融合蛋白及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體的說，本發明涉及一種重組融合表達的去整合素金屬蛋白酶ADAM15片段及其制備方法與應用，特別涉及一種可以在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中可溶、穩定表達的ADAM15h及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]金屬蛋白酶去整合素家族(ADisintegrin And Metalloproteinase, ADAM),又稱 MDC (metalloproteinase/disintergrin/cystein-rich),是近年來新發現的一類含有多個功能結構域的跨膜糖蛋白家族。該家族蛋白與蛇毒金屬蛋白酶(snake venom metalloproteinase,SVMP)家族具有很高的同源性，其結構相似，通常由800-1200個氨基酸組成，包括前導域、類金屬蛋白酶功能域、去整合素功能域、富含半胱氨酸功能域、類表皮生長因子功能域、跨膜域和C端的胞質尾區結構域等。
[0003]ADAM家族蛋白在細胞間相互識別和相互作用中發揮重要作用。研究表明，ADAM蛋白在多種組織和器官中表達分布，參與了多種生理、病理過程，如精卵結合、神經發育、肌管形成等。在細胞外基質蛋白的水解、細胞間和細胞與基質間的粘連、細胞融合、遷移、信號傳導、生物活性因子釋放等細胞活動中具有重要的生理作用。同時，ADAM家族成員還是胚胎干細胞(ESC)、成體干細胞(ASC)分子網絡中關鍵的調控因子，參與受精卵ESC的整合、分化、裂解，以及肌肉、神經等組織ASC的遷移、分化等過程。
[0004]另外，ADAM 家族蛋白通過調芐基因表達、調控胞內外環境、激活酶原和解除抑制劑等途徑參與惡性腫瘤的發生及演變。在30多種ADAM家族成員中，ADAM15(metargidin)被發現與人類多種實體瘤，如胃癌、腸癌、乳腺癌和前列腺癌等的發生和發展密切相關。作為ADAM家族中唯一一個在去整合素結構域含有RGD (Arg-Gly-Asp)基序的成員，ADAMl5具有典型的藥物分子靶點結構與特征，對于抗腫瘤藥物的研制具有重要指導意義。然而，由于天然來源的ADAM15蛋白十分有限，如何獲得高表達量的重組ADAM15蛋白或其片段，進而深入研究其在腫瘤發生發展中的分子機制已成為腫瘤新型藥物開發領域的研究熱點。
[0005]重組蛋白可以在原核生物表達體系和真核細胞表達體系中進行表達生產。對于結構比較簡單，蛋白翻譯后修飾很少或翻譯后修飾對蛋白結構和活性沒有影響的蛋白，可以直接采用原核表達體系，如大腸桿菌進行生產表達。這類表達方法具有產量高、成本低的優點。對于結構相對比較復雜，蛋白翻譯后修飾很重要的蛋白通常需要采用真核細胞表達系統進行表達生產，但是此類表達系統有蛋白產量低，生產成本高的缺點。
[0006]真核細胞表達體系包括哺乳動物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞/桿狀病毒表達體系，其中以哺乳動物細胞表達出的蛋白與人的生理狀態下蛋白結構最接近、活性最高。常用的哺乳動物細胞表達體系包括瞬時表達體系和穩定表達體系，瞬時表達體系可以米用人HEK293細胞，或中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等，其主要方法是將大量的表達載體DNA質粒通過試劑轉染進入細胞內進行短時間內的蛋白表達。而穩定表達體系是通過篩選DNA質粒整合到細胞染色體上的穩定表達克隆并建立穩定表達細胞株進行培養表達。常用的穩定表達宿主細胞系有人HEK293細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、BHK細胞、SP2/0細胞等。其中，CHO (dhfr-)系統是目前應用最廣泛的真核表達系統之一，當攜帶dhfr基因的表達質粒轉染CHO細胞后，可以得到在選擇培養基生長的細胞克隆，dhfr可被葉酸類似物氨甲喋呤(Amethopterin, MTX)所抑制，不斷提高MTX濃度，絕大多數細胞死亡，但在極少數幸存下來的抗性細胞中，dhfr基因均得以擴增。進行性選擇抗氨甲喋呤的細胞系，結果會導致與dhfr串聯在一起的外源基因的共擴增，拷貝數可增加幾百到幾千倍，從而使目的基因高水平表達，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應。
[0007]目前，重組ADAM15胞外段在sf21昆蟲細胞中已有表達，其去整合素結構域蛋白片段在大腸桿菌、畢赤酵母表達系統中也成功表達，重組ADAM15在哺乳動物細胞體內表達還未見有報道，更沒有相關文獻涉及構建穩定株、生產完整ADAM15胞外段重組蛋白。
[0008]本發明提供了一種可以成功在真核細胞表達體系中高效獲得可溶表達的完整ADAM15胞外段蛋白的方法。通過與多聚組氨酸片段融合表達，可以方便地使用鎳柱純化，從而實現商業化生產。
【發明內容】
[0009]本發明的目的在于提供一種可在真核細胞中高效表達的去整合素金屬蛋白酶ADAMl5胞外段蛋白的方法。該蛋白為融合表達的蛋白，其具體結構為C端his融合的ADAM15(即ADAMl5h)，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1，由該核苷酸編碼的氨基酸序列為SEQID NO:2。
[0010]本發明所提供的ADAMl5h，是由pSCT_ADAMl5h轉化宿主細胞系后表達得到的ADAMl5h融合蛋白。
[0011]ADAMl5cDNA是使用人脾臟cDNA文庫通過PCR方法制備的。宿主細胞系是動物細胞；優選為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，和/或人胚腎(HEK)細胞；最優選為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
[0012]本發明的第二個目的是提供一種制備重組ADAM15h融合蛋白的方法。
[0013]本發明所提供的制備重組ADAMl5h融合蛋白的方法，是用pSCT_ADAMl5h轉化宿主細胞系，被轉化的宿主細胞系經培養篩選出重組ADAM15h表達克隆，得到重組蛋白ADAMl5h0其中，宿主細胞系是動物細胞，優選為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和/或人胚腎(HEK)細胞。宿主細胞系的培養方法包括懸浮培養、將細胞固定在培養燒瓶或瓶子或生物反應器上培養等。
[0014]所篩選出的重組蛋白ADAM15h表達克隆是CHO ADAM15h_G8_l I。所述CHOADAM15h-G8-ll是通過在培養基中加入增量氨甲喋吟(MTX)選擇得到的。按照本發明提供方法生產的ADAM15h，培養上清中可獲得10mg/L以上的蛋白產量。
[0015]本發明提供了純化重組ADAM15h融合蛋白的方法?？梢允褂肗i柱親和純化。
[0016]本發明還提供了對純化ADAM15h蛋白進行活性檢測的方法。即測定該蛋白切割熒光肽底物Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2能力的方法。
[0017] 按照本發明提供方法得到的ADAM15h可用于研究該家族蛋白的生物功能、作用機理，更可進一步用于抗腫瘤藥物的研發?！緦＠綀D】
【附圖說明】
[0018]圖1.ADAMl5h純化蛋白的SDS-PAGE圖(還原膠)
[0019]圖2.純化的ADAM15_His的Western印跡分析圖
[0020]圖3.重組人ADAM15ELISA檢測標準曲線圖
[0021]圖4.重組 ADAM15h 與 PTK6，SRC, mouseSRC 及 LYN 的結合趨勢圖
【具體實施方式】
[0022]實施例1、重組ADAM15h的CHO細胞系的構建
[0023](I)表達載體的構建
[0024]ADAMl 5cDNA是使用人脾臟cDNA文庫通過PCR方法制備的，它可以被克隆進PMD18-T載體中，即獲得pMD-ADAM15。核昔酸序列是用儲存在基因庫中的序列(GeneBank NM_207191.1)驗證的。使用該pMD_ADAM15 DNA作為模板，通過PCR方法用正引物(CTGAAGCTTACCATGCG GCTGGCGCT)和反引物(GGATCTAGAITTAATGGTGATGATGGTGGTGATGGTGGTGATGAGCTGTGGTCAGGGAGCTGGTT)制備的用于 ADAM15 表達的 2130bp ADAM15cDNA。上游引物包括用于克隆的HindIII酶切位點序列，下游引物包含有IOHis標簽和XbaI位點序列。該cDNA被克隆進pSCT載體(該載體帶有dhfr及neo基因)中以制備pSCT_ADAM15h，ADAM15h的序列通過基因庫序列再次得到驗證。
[0025](2) pSCT-ADAM15h轉染進表達宿主中
[0026]①pSCT_ADAM15h 質粒 DNA 的制備
[0027]將pSCT_ADAM15h DNA 轉染進 DH5a[supE44，Δ lacU169 (0801acZ Δ M15), hsdR17,recAl, endAl, gyrA96, th1-1, relAl)大腸桿菌中之后，在含有100ug/mL氨卞青霉素的IOOmL LB培養基中培養轉化體。通過使用QUIAPREP質粒Midi試劑盒(Quiagen，USA)，從該培養物中制備pSCT-ADAM15h質粒DNA。用PvuI消化制備得到線性pSCT_ADAM15h DNA。
[0028]②CHO細胞的制備
[0029]在MW12中用DMEM+10% FBS+HT+pro培養基培養CH0-DG44細胞，用血細胞計數器確定細胞數，調節細胞數為4.8X105個/mL細胞，繼續在C02培養箱中培養18小時。
[0030]③轉染
[0031]在室溫下將含有1.2ug 的 pSCT-ADAM15h DNA 和 3.6ul Sinofection(北京義翹神州生物技術有限公司即Sino Biological Inc.,)的混合物培養20分鐘。然后將該混合物加入到宿主細胞中，于37°C培養6小時。6hs后，去除培養基，加入ImL新鮮的DMEM+FBS+HT+pro培養。第2天用胰酶將細胞消化下來后計數，按le3/w接種在96微孔板中，用含10% dFBS的DMEM+pro培養6h后，補加G418使其終濃度達到0.8mg/ml，培養基每2~3天換一次液，持續10天后耐G418的克隆逐步形成。用雙抗夾心ELISA檢測單克隆上清中ADAMl5h表達量，選取表達量高的20個克隆進行MTX加壓擴增ADAMl5h基因。
[0032](3) ADAMl5h 基因的擴增
[0033]通過在培養基中逐漸加入增量的MTX，擴增在轉化細胞中轉導的ADAM15h基因。最初在存在IOnM MTX的培養基中培養，直到細胞達到融合狀態。然后通過類似方式將MTX的濃度逐步增加到300nM。在每一步，使用ELISA檢測確定ADAM15h表達水平。ADAM15h的水平隨著MTX濃度的增加而增加。[0034](4)亞克隆及ADAM15h生產細胞的選擇
[0035]選擇300nM MTX下表達量高的克隆CH0-ADAM15h_G8進行單細胞克隆。將細胞計數后按0.5c/w接種至MW96，用MDM+10% dFBS+300nM MTX培養，約15天后，單細胞克隆長大，用生長培養基換液，ELISA檢測不同單細胞克隆的表達量，選擇表達量高細胞生長好的3株克隆傳至麗24中擴大培養。
[0036]將選出的3株克隆懸浮馴化。綜合細胞生長情況和ADAM15h表達水平確定生產細胞株CH0-ADAM15h-G8-ll，凍存細胞。按照傳統方法對培養上清用鎳柱(Ni)純化，將純化后樣品在還原條件下進行聚丙烯酞胺電泳和Western印跡分析,結果如圖1和圖2所示,表明產生的重組人ADAM15h與理論推測的ADAM15片段聚丙烯酞胺電泳和Western印跡分析圖
譜一致。
[0037]實施例2、重組人ADAMl5的ELISA檢測
[0038]通過ELISA方法檢測重組人ADAMl5的蛋白濃度，本實驗檢測所需蛋白及抗體均來自Sino Biological Inc.,具體操作步驟見下:
[0039](1)用包被液將兔抗人ADAM15單抗稀釋至2ug/ml后包被在酶標板上，IOOul/孔，4°C過夜。
[0040](2)棄去孔內液體，甩干，按300ul/孔加入洗液，洗板2次。
[0041](3)按300ul/孔加入封閉液，室溫反應I小時。
[0042](4)重復步驟⑵。
[0043](5)將重組人 ADAMl5 標準品稀釋到 lng/ml、0.5ng/ml>0.25ng/ml>0.125ng/ml>0.0625ng/ml及0.03125ng/ml，同時將ADAM15樣品進行相應的稀釋，稀釋后的樣本按IOOul/孔進行點樣，室溫反應2小時。
[0044](6)將HRP標記兔抗人ADAM15多抗稀釋到lug/ml，按IOOul/孔進行加液，室溫反應I小時。
[0045](7)重復步驟⑵。
[0046](8)加入200ul/孔的底物溶液，室溫下避光反應20min。
[0047](9)加入50ul/孔的終止液，輕敲酶標板以混勻溶液。
[0048](10)立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(0D值)。以0D-B值為橫坐標，ADAM15-his標準品的濃度為縱坐標，繪制標準曲線，根據樣品的OD值計算出樣品相應的濃度。標準曲線圖見圖3，該曲線的線性范圍:0D-B在0.039~0.960之間；標準品的曲線方程:y = 1.011x+0.026。
[0049](11)按照上述ELISA檢測方法測得CH0-ADAM15h-G8-ll克隆培養上清中ADAMl5h的純度為 10.7mg/L ~16.lmg/L。
[0050]實施例3、重組ADAM15h的純化
[0051]重組ADAM15h蛋白用Ni柱親和純化，具體方法為:
[0052](I).平衡柱子:5 個柱體積平衡 buffer (PH7.0 20mM PBS 500mM Nacl 20mM 咪唑
0.4mM PMSF 10%甘油)平衡 Ni 柱。
[0053](2).上樣，5個柱體積平衡buffer沖洗Ni柱。
[0054](3).洗脫:5-10 個柱體積的 Elution Buffer (BI:PH7.0 20mM PBS 500mM Nacl50mM咪唑 0.4mM PMSF 10%甘油；B2:PH7.020mM PBS 500mM Nacl 500mM咪唑 0.4mM PMSF10%甘油)洗脫目的蛋白。
[0055](4).待所有的樣品完成以上操作后，取樣品電泳。電泳檢測結果見圖1。
[0056]實施例4、重組ADAMl5h蛋白活性驗證
[0057]1.通過結合實驗分析驗證重組ADAM15h蛋白的活性
[0058](I)包被 10ug/ml 的 PTK6-GST(Sino Biological Inc.),用不同濃度生物素化的ADAM15-his蛋白與之結合,加入HRP標記的鏈親和素(Vector Laboratories),加入底物溶液，放置20min后終止，在450nm波長下讀光密度值。
[0059](2)包被 10ug/ml 的 SRC-GST (Sino Biological Inc.),用不同濃度生物素化的ADAM15-his蛋白與之結合，加入HRP標記的鏈親和素，加入底物溶液，放置20min后終止，在450nm波長下讀光密度值。
[0060](3)包被 10ug/ml 的 Mouse SRC-GST (Sino Biological Inc.),用不同濃度生物素化的ADAM15-his蛋白與之結合，加入HRP標記的鏈親和素，加入底物溶液，放置20min后終止，在450nm波長下讀光密度值。
[0061](4)包被 10ug/ml 的 LYN-GST (Sino Biological Inc.),用不同濃度生物素化的ADAM15-his蛋白與之結合，加入HRP標記的鏈親和素，加入底物溶液，放置20min后終止，在450nm波長下讀光密度值。
[0062](5)以ADAM15h蛋白濃度為橫坐標，以光密度值為縱坐標做圖。結果見圖4，從圖4可以看出，CHO表達的重組ADAM15h與其相互作用分子PTK6，SRC, mouseSRC及LYN都有很好的結合。
[0063]2.通過測定切割熒光肽底物Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR_NH2的能力檢測重組ADAMl5h酶活性。
[0064](I)用分析緩沖液(50mM Tris, IOmM CaCl2,150mM NaCl, ρΗ7.5)將重組 ADAM15h稀釋至100ug/ml。
[0065](2)等體積混合 1.5ug/ml 的 thermolysin 和稀釋的重組 ADAM15h,使 thermolysin終濃度為0.75ug/ml、重組ADAM15h終濃度為50ug/ml。
[0066](3)37。(:孵育3011^11。
[0067](4)加入 0.05mM 的 phosphoramidon 以終止反應。
[0068](5)室溫放置 15min。
[0069](6)用分析緩沖液將活化的重組ADAM15h稀釋至10ng/ul.[0070](7)用分析緩沖液將熒光肽底物Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2稀釋至40uM。
[0071](8)酶標黑孔板中放置50ul 10叩/111的重組40411511，加入5(^1 40 μ M的底物以起始反應。以含50 μ I分析緩沖液和50 μ I 40 μ M底物的孔作為對照。
[0072](9)分別在320nm激發光、405nm發射光下動力學頂讀檢測5min。
[0073](10)計算比活:
[0074]
【權利要求】
1.一種重組表達的ADAM15h蛋白，是由pSCT-ADAM15h轉化宿主細胞系后表達得到的融合蛋白。
2.根據權利要求1所述的重組ADAM15h蛋白，其特征在于:所述宿主細胞系為動物細胞。
3.根據權利要求1所述的重組ADAM15h蛋白，其特 征在于:所述宿主細胞系為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
4.一種制備權利要求1所述重組ADAM15h蛋白的方法，是用pSCT_ADAM15h轉化宿主細胞系，被轉化的宿主細胞系經培養篩選出重組ADAM15h表達克隆，得到重組ADAM15h融合蛋白。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述宿主細胞系的培養篩選方法包括貼壁培養、懸浮培養或生物反應器上培養。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述篩選出的重組ADAM15h表達克隆是CHO ADAM15h-G8-ll，該克隆是通過在培養基中加入增量氨甲喋吟(MTX)選擇得到的。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述方法還包括純化重組ADAM15h的方法，即使用Ni柱親和純化的方法。
8.一種檢測權利要求1所述重組ADAM15h蛋白的方法，其特征在于以純化的重組ADAMl5h與相關蛋白SRC、PTK6、LYN結合進行檢測。
9.一種檢測權利要求1所述重組ADAM15h蛋白的方法，其特征在于以純化的重組ADAMl5h與熒光肽底物Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2作用檢測酶活性的方法。
【文檔編號】C12N15/85GK103937770SQ201310018270
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月18日 優先權日:2013年1月18日
【發明者】羅春霞, 楊茜, 孫春昀, 李成紅, 胡萍, 黃序 申請人:北京義翹神州生物技術有限公司