茄屬物種鑒定基因、引物及檢測方法
【專利摘要】本發明提出以核基因waxy為主要基因序列，輔以其他葉綠體基因序列如trnS-trnG，ndhF等，用于茄屬植物物種鑒定，并提供了核基因waxy的序列合成引物，本發明還進一步提供了進境檢疫性4種茄屬雜草及其他茄屬外來雜草的檢測方法。本發明特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度高，為檢測茄屬物種提供方法，也為防范外來生物提供了保證。
【專利說明】茄屬物種鑒定基因、引物及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物檢測【技術領域】，具體地說涉及茄屬物種分子鑒定基因序列及其PCR引物和檢測方法。
【背景技術】
[0002]茄屬全世界有1400余種，大多起源于南美，分布廣，適應性強，部分入侵性雜草危害性大，其中有4種已被列我國列為進境檢疫性雜草，另外有30余種具有潛在危害性。然而該類群形態變異復雜，物種鑒定極其困難，特別對于外來種的鑒定，問題尤為突出。
[0003]DNA條形碼技術可以克服因物種缺乏足夠的性狀信息和表型可塑性等因素影響物種準確鑒定的問題，因此該技術已經成為物種鑒定最具前景的發展方向。目前在動物鑒定領域一段線粒體COI序列已經成為公認的通用序列應用于實際鑒定。然而，在陸生植物中至今還沒有找到可作為通用DNA的分辨力強的可作為條形碼的基因序列。主要原因是植物線粒體基因組進化速率慢、遺傳變異小，因此線粒體COI序列并不適合于植物；此外，在植物進化歷程中的雜交、網狀進化以及同一基因在不同類群中進化速率的異質性使植物條形碼的研究比動物要復雜的多。近年來，各國諸多學者提出了眾多植物DNA條形碼的候選序列及其組合，例如葉綠體基因rbcL+matK組合以及核基因ITS被提議作為陸生植物的核心條形碼，但它們僅能解決較高階元(科、屬)的鑒定問題，在物種水平分辨率較差，如單個rbcL和matK只能區別不到50%的物種，其組合的分辨力也不足70%。因此目前研究成果的鑒定通用性不理想，都沒有達到應用條件。

【發明內容】

[0004]針對上述技術問題，本發明提出了一種PCR擴增引物，其一對核苷酸序列為:
[0005]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ；
[0006]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'。
[0007]根據本發明的另一方面，提出了一種上述核基因waxy在茄屬植物物種鑒定中的用途。
[0008]如上所述的用途中，利用核基因waxy與葉綠體基因組中ndhF基因和trnS_trnG基因組合進行茄屬雜交種的鑒定和父母本來源的鑒定。
[0009]根據本發明的另一方面，提出了一種茄屬物種的檢測方法，包括:1.提取樣品總DNA ；i1.利用權利I所述引物進行PCR擴增；ii1.擴增得到權利要求2所述核基因waxy序列；iv.經測序分析構建系統發育樹；v.根據樣品在系統發育樹上的位置及聚合、分離狀況判定結果；以及v1.當被鑒定樣品為雜交種時，利用上述基因組合共同分析判定結果。
[0010]本發明所述基因，其種間變異大于種內變異，可有效檢測茄屬所有物種；其“引物”擴增效果好，檢測方法快速簡單，為防范外來生物提供了技術保證。
【專利附圖】

【附圖說明】[0011]圖1是本發明利用waxy序列構建的茄屬系統發育樹；
[0012]圖2是本發明利用waxy序列、ndhF基因和trnS-trnG基因共同構建的爺屬系統發育樹；
[0013]圖3是利用本發明鑒定茄屬物種銀毛龍葵時構建的系統發育樹；
[0014]圖4是銀毛龍葵與它三種近緣種的遺傳距離間隔柱狀圖。
【具體實施方式】
[0015]下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。
[0016]本發明提出了一種植物核基因waxy作為茄屬物種鑒定的通用DNA序列，并由此設計了該基因的檢測引物，并進一步提出了茄屬物種的檢測方法，有效解決了茄屬物種的鑒定問題，可應用推廣。
[0017]針對設計引物。所述的引物由一對正向和反向引物組成，其核苷酸序列分別為正向引物WAXYS和反向引物WAXYA2:
[0018]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ；
[0019]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'
[0020]本發明關于茄屬物種的檢測方法，包括:以樣品總DNA為模板，利用waxy序列的檢測引物進行PCR擴增，擴增后的測序結果構建系統發育樹，根據樣品在系統發育樹上聚合、間隔狀況判定結果。
[0021]根據本發明的一個實施例，提出了一種PCR擴增引物，其一對核苷酸序列為:
[0022]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG T TG ATCG-3'；
[0023]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'。
[0024]根據本發明的另一個實施例，提出了一種上述核基因waxy在茄屬植物物種鑒定中的用途?？蛇x地，在如上所述的用途中，利用核基因waxy與葉綠體基因組中ndhF基因和trnS-trnG基因組合進行爺屬雜交種的鑒定和父母本來源的鑒定。
[0025]根據本發明的另一個實施例，提出了一種茄屬物種的檢測方法，包括:1.提取樣品總DNA;i1.利用權利I所述引物進行PCR擴增；ii1.擴增得到權利要求2所述核基因waxy序列；iv.經測序分析構建系統發育樹；v.根據樣品在系統發育樹上的位置及聚合、分離狀況判定結果；以及v1.當被鑒定樣品為雜交種時，利用上述基因組合共同分析判定結
果O
[0026]以下根據不同的實施例對本發明的技術方案詳細說明。
[0027]理想的物種鑒定通用DNA序列應該種間遺傳變異大于種內變異，且自身短小，便于擴增和測序。本發明根據上述原則確定核基因waxy序列為茄屬物種鑒定的主鑒定序列。
[0028]圖1是利用本發明確定的waxy序列構建的爺屬系統發育樹。雖然爺屬物種上千種，本示例覆蓋了茄屬9大支系的48個種類，且其中部分種類存在若干重復，可以合理預見其分辨結果對于茄屬物種具有很好的鑒定能力。從圖1可以看出，包括4種檢疫性外來物種在內的68個樣品得以成功區分鑒定，重復樣品成功聚合在一起，而親緣種之間存在明顯的遺傳距離，即waxy序列在茄屬種間變異大于種內變異，達到通用檢測序列的理想要求。
[0029]當發生種間雜交等特殊情況時，樣品僅通過waxy序列系統發育樹不能得到準確鑒定。如圖1中有3個樣品與認為屬于相同物種的樣品在系統發育樹上沒有發生聚合，而是產生間隔，這時需輔以葉綠體trnS-trnG和ndhF基因序列構建的系統發育樹共同分析。圖2中右邊是利用本發明構建的waxy序列系統發育樹,左邊是構建的葉綠體trnS-trnG和ndhF系統發育樹。由于葉綠體基因母系遺傳、核基因雙親遺傳，因此構建的2個系統發育樹可對茄屬雜交物種及其父母本來源進行鑒定。圖1中未能得到準確鑒定的3個樣品通過在圖2中的位置分析可知S.macrocarpon7是一個母本為S.macrocarpon父本為S.rostratum的雜交種；名為S.virginanum的兩個樣品均不是雜交種，至少其中之一為錯誤鑒定樣品。
[0030]本發明還進一步針對waxy序列設計引物。所述的引物由一對正向和反向引物組成，其核苷酸序列分別為正向引物WAXYS和反向引物WAXYA2:
[0031]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ；
[0032]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3' [0033]實施例
[0034]檢疫性雜草銀毛龍葵的鑒定
[0035]爺屬分子系統學研究表明銀毛龍葵屬于爺亞屬分支(Leptostemonum),該分支有350-450種，在進化關系樹上分屬于10個亞支，銀毛龍葵屬于銀毛龍葵亞支(Elaeagnifolium Clade)。本發明收集了 5個銀毛龍葵不同來源個體及其多個近緣種,共16種26份樣品，這些樣品覆蓋了茄亞屬10亞支中的9支(表1)。樣品來自口岸截獲、口岸周邊監測、與國外標本館交換或從國外種子公司購買。
[0036]表1.實驗材料
【權利要求】
1.一種PCR擴增引物，其一對核苷酸序列為:
WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ； WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'。
2.核基因raxy在茄屬植物物種鑒定中的用途。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，利用核基因raxy與葉綠體基因組中ndhF基因和trnS-trnG基因組合進行茄屬雜交種的鑒定和父母本來源的鑒定。
4.一種爺屬物種的檢測方法，其特征在于: i.提取樣品總DNA ； ii.利用權利I所述引物進行PCR擴增； ii1.擴增得到權利要求2所述核基因waxy序列； iv.經測序分析構建系統 發育樹； V.根據樣品在系統發育樹上的位置及聚合、分離狀況判定結果； v1.當被鑒定樣品為雜交種時，利用權利要求3所述基因組合共同分析判定結果。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937784SQ201310018341
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月18日 優先權日:2013年1月18日
【發明者】范曉虹, 張偉, 邵秀玲 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院