專利名稱：一株能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌。
背景技術：
植物內生菌的研究始于19世紀末,Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內生菌起始于上世紀八十年代，主要是在溫帶地區、亞熱帶地區和熱帶地區的植被中開展研究。前人從大部分植物中都能分離出內生菌，因此可以推測內生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內至少在80多個屬290多種的禾本科農作物中發現了內生菌[2]。目前從植物中分離的內生菌根據其具有的獨特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3~4]、具有抗病蟲害的生防菌[5~8]和具有促進植物對不良環境的修復能力的抗性菌。在促進光合作用方面的內生菌報道極少，僅有在水稻上發現一種具有光合作用能力的內生菌，它也被證明是豆莢Aeschynomene[9]莖瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一個株系。木麻黃科植物是兼有弗蘭克氏菌菌(Frankia)、內生菌根菌和外生菌根菌的共生營養型植物，因此，關于木麻黃真菌學方面的研究方向目前較多涉及弗蘭克氏菌(Frankia)、青枯菌(Solanasearum)、青枯假單胞桿菌(Pseudomonas solanacearum Smith)等，雖然木麻黃人工接種菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是僅停滯于根瘤菌根菌的研究，木麻黃內生真菌方面的研究尚未見報道[1°_11]。前人的研究中應用菌株，多為外生真菌，同時也沒有從促進根系生長作用的根本因素去尋找內生真菌，提高其科學性和可靠性[12]。證實能促進根系生長作用的內生菌方面尚未見報道。根系是所有 植株體的重要組成部分，植物地下部分根群對水分、養分的吸收能力同地上部分的光合作用效率一樣，對植物的正常生長發育起到了至關重要的作用，植株對水分和養分獲取的能力取決于根系的形態，其中重要的根系形態指標有根系長度、根系表面積和根系生物量等，因此，植物根系的研究已作為生態學研究的重要內容[13~14]。

發明內容
本發明的目的在于提供一株能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌。本發明提供的一株能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌，所述功能內生真菌為葉點霉iicia sp.)木麻黃根際真菌15，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6307。該菌的分離、純化包括:
A、材料:將采集得到不同年份的根、枝條、鱗狀葉小枝分成三個部分，用自來水清洗干凈，分裝到自封袋內，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續調整消毒方法[15_17];
C、接種部位的選擇:鱗狀葉小枝:分取植株的上、中、下三個部分的鱗狀葉小枝，每個鱗狀葉小枝又分為枝尖部、枝中部和枝基部3個處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部:分為根尖和根基2個部分；
D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養基表面，于28°C恒溫培養箱內培養5— 7天后觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產生的菌株進行分離純化；生長緩慢且數量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩定后純化。固體培養:使用改良馬丁固體培養基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值
6.4±0.2，培養溫度為28°C，培養方式為平板培養，培養時間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內生真菌接入平板培養基進行純化，經過2-3次點接純化、轉接后得到單一菌種的上述的Phyllostic-ta sp.功能菌株；
其在平面培養基上，菌落呈圓形，淡黃色菌絲，中部隆起黃色絨毛，基質呈酒紅色；背部中心黑紅色，生長較慢。分生孢子器暗色，有孔，兩面凸到球形；分生抱子梗短；分生孢子小，單孢，無色，卵圓形到長；參照真菌鑒定手冊將其鑒定為葉點霉屬sp.)，保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6307。上述的一種能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌應用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養基，搖床振蕩培養，培養溫度為28°c，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中 蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。

上述的一種能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地澆根。上述的一種能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌應用菌液的應用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地澆于每株木麻黃的根際。上述的一種能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前將苗蘸根lOmin。本發明涉及的菌株是從木麻黃植株中分離純化得到的，目標菌株為葉點霉{Phyllosticta sp.)木麻黃根際真菌15,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6307。經接種于木麻黃水培苗，根據根系生長的各項指標綜合評判，進一步證實木麻黃根際真菌15對生根作用具有促進作用以及實際對木麻黃的干物質的增效作用，尋找到對促進生根作用有益的功能內生真菌可應用于生產。與對照相比，木麻黃根際真菌15處理植株為對照苗木根系總表面積的4.72倍，苗木根系總長為對照苗木的3.73倍，植物0.25mm徑級以下的細根為對照苗木的3.36倍，0.25、.5mm徑級下根長為對照苗木的3.68倍；0.5^0.75 mm、0.75^1 mm和彡Imm根系徑級下，其中木麻黃根際真菌15處理下苗木的根長增幅均為最大。因此，木麻黃根際真菌15處理下的木麻黃苗木較對照苗木所有徑級下的根長增幅均達到最大。表明其對于促進植株的根系生長具有極顯著效果。


圖1為不同處理對木麻黃苗木根系總表面積的影響。圖2為不同處理對木麻黃苗木根系總長的影響。圖3為不同處理對木麻黃苗木根系各徑級根系長度的影響。
具體實施例方式1、水培繁殖中的應用
取配制好的上述內生真菌應用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根IOmin0可提高植苗成活率10%以上。2、根際土壤澆施應用
試驗材料為惠安一號水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建農林大學森林生態研究所田間試驗地。水培苗根系長齊后，將其移入黃心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分裝于約500個直徑22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等質量的3.36KG混合土壤，為了保證后期苗木接菌的準確性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福爾馬林)消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時間為24h。待土壤內甲醛滲透消毒完全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醛蒸發，以免影響幼苗的移植成活率。經過一個月的恢復性生長，在木麻黃根際施入菌株濃度為
9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重復3次，用蒸餾水溶液處理作為空白對照。菌液的制備:將木麻黃根際真菌15(以下簡稱菌株15號)接入液體培養基，培養基為改良馬丁培養基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀1.0g、硫酸鎂0.5g，其它為無菌水，pH值6.4±0.2。經過24h的培養，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml備用。接種后30天后進行各指標的測定，檢測方法和結果如下:
2.1菌株浸泡后木麻黃根系生長狀況分析
為了研究內生真菌接種對木麻黃苗木根系的效應，試驗將栽有木麻黃苗木的花盆傾倒，取出帶有土壤和沙礫的整株苗木，用清水反復沖洗后晾干，剪下地下部分，分別裝入信封袋中備用，每個處理采3株苗木。應用愛普生(10000XL，Epson Inc.，北京)根系掃描儀，將完整的根系圖像掃描存入計算機，應用(WinRHIZ0 2009)專業根系形態和結構分析系統軟件(Regent Instruments Canada Inc.)對根系總表面積、根系總長以及根系徑級(根系平均直徑分級)進行定量分析[18]，取3個重復值的平均值作為該處理苗木的根系特征值。同一接菌方式下，接菌苗木和未接菌苗木之間的比較采用ANOVA分析，不同處理之間采用Duncan多重比較,并用字母標記法表示。4結果分析
4.1菌株15處理對苗木根系總表面積的影響
根系表面積的大小影響著植株根系與 土壤間營養物質的交換，其與植物水分吸收能力緊密聯系，能夠大致反映苗木對土壤環境的利用現狀，若根系表面積越大，則根系分布就越廣，植物能更好地吸收利用土壤中的養分，同時，根系的大小和深淺也決定著植物根系的發達程度，與植物的抗風性能、耐旱性和生活力密切相關，特別對沿海或水土保持防風固沙植物也有重要的影響[19_22]。通過根系分析軟件對樣品的分析和SPSS軟件對數據的多重比較得到圖1。
通過單因素方差分析和鄧肯多重比較，菌株15處理與對照處理有顯著的差異(S:Sig=0.000 ；P:Sig=0.000)，由圖1也可看出，與對照相比，菌株15號為對照苗木根系總表面積的4.72倍；
4.2菌株15處理對苗木根系總長的影響
植株根系的總長度同樣作為描述根系特征的重要參數，其值的大小還決定著根系表面積的大小和根系遍布的深淺。圖2反映了內生真菌對木麻黃苗木根系總長的影響。單因素方差分析表明，菌株15處理與對照處理相比有顯著差異(S:sig=0.000 ；P:sig=0.000)，菌株15號為對照苗木根系總長的3.73倍。4.3菌株15處理對苗木根系徑級的影響
試驗通過WinRHIZO根系分析軟件按直徑分級(最小分辨單位0.0lmm)對每株植物的根系進行細致統計，由于本試驗中，木麻黃幼苗均為無性系水培苗木，其根系均為直徑< 2mm的細根，因此將木麻黃水培幼苗的根系劃分為五個徑級區間:彡0.25,0.25、.5、
0.5 0.75,0.75 1、≥ I (單位:mm)。眾所周知，木麻黃生長在年降水量充沛的亞熱帶等地區，樹種本身具有一定的抗 勞性，Osundina研究發現,在淹水情況下，木麻黃能夠通過增加暴露于水面之上的不定根數量，從而緩解木麻黃水澇時根系的缺氧狀況，因此，植物的根系，特別是直徑< 2mm的細根對所處土壤環境資源的狀況有著敏感的響應[23_25];通過植株根系總表面積和根系總長的大小可以直觀地反映植物地下部分的生物量狀況和所消耗的光合產物的多少，為了進一步研究接種內生真菌對木麻黃幼苗細根構型以及功能特征的影響，本試驗通過根系分析軟件統計了不同徑級下各接菌處理苗木較對照的增長情況，以初步尋找接菌與苗木根系各徑級產量變化的規律。不同接菌方式處理下苗木根系不同徑級的特征值。由表I的數據和圖3可以看出，不同接菌處理對木麻黃苗木各徑級的根長均有促進作用。植物的細根，特別是0.25mm徑級以下的根系對植物吸收水分的能力起到重要作用，細根量越多，則植物對水分的吸收能力越強，其中菌株15號的增幅達到最大，為對照苗木的3.36倍；0.25、.5mm徑級下，菌株15號的增幅最大，為對照苗木該徑級下根長的3.68倍；0.5 0.75 mm、0.75 I mm和彡Imm根系徑級下，其中菌株15號處理下苗木的根長增幅均為最大。因此，15號內生真菌處理下的木麻黃苗木較對照苗木所有徑級下的根長增幅均達到最大。表I不同菌株處理對木麻黃苗木根系各徑級根系長度的影響
權利要求
1.一株能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌，其特征在于:所述內生真菌為葉點霉{Phyllosticta sp.)木麻黃根際真菌15,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6307。
2.一種如權利要求1所述的內生真菌的應用菌液，其特征在于:所述應用菌液的制備方法，是將所述的葉點霉sp.)木麻黃根際真菌15接入液體培養基,搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH 值 6.4±0.2。
3.—種如權利要求2所述的應用菌液的用途，其特征在于:所述應用菌液用于林地澆根或苗木栽植前期 蘸根。
全文摘要
本發明涉及一株能促進木麻黃根系生長作用的內生真菌。所述內生真菌為葉點霉(Phyllosticta sp.)木麻黃根際真菌15，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.6307。經接種于木麻黃水培苗，根據根系生長的各項指標綜合評判，進一步證實木麻黃根際真菌15對生根作用具有促進作用以及實際對木麻黃的干物質的增效作用，尋找到對促進生根作用有益的功能內生真菌可應用于生產。
文檔編號C12R1/645GK103173359SQ201310068758
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者謝安強, 洪偉, 吳承禎, 林燕青, 陳燦 申請人:福建農林大學