專利名稱：一株促進木麻黃光合作用的內生真菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株促進木麻黃光合作用的內生真菌。
背景技術：
植物內生菌的研究始于19世紀末,Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內生菌起始于上世紀八十年代，主要是在溫帶地區、亞熱帶地區和熱帶地區的植被中開展研究。前人從大部分植物中都能分離出內生菌，因此可以推測內生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內至少在80多個屬290多種的禾本科農作物中發現了內生菌[2]。目前從植物中分離的內生菌根據其具有的獨特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3~4]、具有抗病蟲害的生防菌[5~8]和具有促進植物對不良環境的修復能力的抗性菌。在促進光合作用方面的內生菌報道極少，僅有在水稻上發現一種具有光合作用能力的內生菌，它也被證明是豆莢Aeschynomene[9]莖瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一個株系。木麻黃科植物是兼有弗蘭克氏菌菌(Frankia)、內生菌根菌和外生菌根菌的共生營養型植物，因此，關于木麻黃真菌學方面的研究方向目前較多涉及弗蘭克氏菌(Frankia)、青枯菌(Solanasearum)、青枯假單胞桿菌(Pseudomonas solanacearum Smith)等，雖然木麻黃人工接種菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是僅停滯于根瘤菌根菌的研究，木麻黃內生真菌方面的研究尚未見報道[1°_11]。前人的研究中應用菌株，多為外生真菌，同時也沒有從促進光合作用的根本因素去尋找內生真菌，提高其科學性和可靠性[12]。證實能促進光合作用的內生菌方面尚未見報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一株促進木麻黃光合作用的內生真菌。本發明提供的一株促進木麻黃光合作用的內生真菌，所述內生真菌為曲霉{Aspergillus sp.)木麻黃根際真菌7,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6305。該菌的分離、純化包括:
A、材料:將采集得到的不同年份的根、枝條、鱗狀葉小枝分成三個部分，用自來水清洗干凈，分裝到自封袋內，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續調整消毒方法[13_15]；
C、接種部位的選擇:鱗狀葉小枝:分取植株的上、中、下三個部分的鱗狀葉小枝，每個鱗狀葉小枝又分為枝尖部、枝中部和枝基部3個處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處； 根部:分為根尖和根基2個部分；D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養基表面，于28°C恒溫培養箱內培養5— 7天后觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產生的菌株進行分離純化；生長緩慢且數量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩定后純化。固體培養:使用改良馬丁固體培養基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值
6.4±0.2，培養溫度為28°C，培養方式為平板培養，培養時間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內生真菌接入平板培養基進行純化，經過2-3次點接純化、轉接后得到單一菌種的上述的功能內生真菌；
其在平面培養基上，菌落為白色氈狀絨毛，菌落中鑲嵌有墨綠色顆粒狀突起絨毛，基質顏色為黃綠色。分生孢子梗直立，簡單，頂端球形，頂部著生小梗；分生孢子(梗孢子)單孢，球形；參照真菌鑒定手冊將其鑒定為曲霉屬(Aspergillus sp.),保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6305。上述的一種促進木麻黃光合作用的內生真菌應用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養基，搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀
1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。上述的一種促進木麻黃光合作用的內生真菌應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地澆根。

上述的一種促進木麻黃光合作用的內生真菌應用菌液的應用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地澆于每株木麻黃的根際。上述的一種促進木麻黃光合作用的內生真菌應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液5.0X 105cfu/ml在水培苗栽植前將苗蘸根IOmin。本發明涉及的菌株是從木麻黃植株中分離純化得到的，目標菌株為曲霉{Aspergillus sp.)木麻黃根際真菌7,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為 CGMCC N0.6305。將木麻黃根際真菌7接種于木麻黃水培苗，根據光合作用的各項指標綜合評判，進一步證實其對光合作用具有促進作用，尋找到對促進光合作用有益的功能內生真菌可應用于生產。通過菌液燒施的方法接種于木麻黃幼苗，接種30天后用Photon SystemsInstruments.(PSI)公司生產的Handy Fluor Cam突光成像儀在夜間19:00-22:00測定木麻黃苗木的葉綠素熒光參數。證實木麻黃根際真菌7處理的葉綠素熒光參數Fm和Fv較對照CK提高了 39.57%和42.83%。OPSII較對照增加了 31.52%。接菌苗木的NPQ值較對照減少了 22.1%。表明其對于促進植株的光合作用和增加木麻黃的干物質積累具有極顯著效果O


圖1為不同接菌處理下苗木Fm、Fv的比較。
圖2為不同接菌處理植株苗木Fv/Fm的比較。
具體實施例方式1、水培繁殖中的應用
取配制好的木麻黃根際真菌7應用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根lOmin?？商岣咧裁绯苫盥?0%以上。2、根際土壤澆施應用
試驗材料為惠安一號水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建農林大學森林生態研究所田間試驗地。水培苗根系長齊后，將其移入黃心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分裝于約500個直徑22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等質量的3.36KG混合土壤，為了保證后期苗木接菌的準確性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福爾馬林)消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時間為24h。待土壤內甲醛滲透消毒完全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醛蒸發，以免影響幼苗的移植成活率。經過一個月的恢復性生長，在木麻黃根際施入菌株濃度為9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重復3次，用蒸餾水溶液處理作為空白對照。菌液的制備:將木麻黃根際真菌7接入液體培養基，培養基為改良馬丁培養基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀1.0g、硫酸鎂0.5g，其它為無菌水，PH值6.4±0.2。經過24h的培養，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml備用。接種后30天后進行光合作用等指標的測定，檢測方法和結果如下:
2.1菌株澆施后木麻黃葉綠素熒光參數分析
應用 Photon System s Instruments.(PSI)公司生產的 Handy Fluor Cam 突光成像儀在夜間19:00-22:00測定木麻黃苗木的葉綠素熒光參數，測定前先將苗木放入暗箱內，充分暗反應20min，隨后將苗木放于攝像頭之下，調節焦距至能看清葉片圖像為止。測量的原始參數有:Fo (最小、基礎或不變熒光強度等)是光系統II (PS II )反應中心所有電子均處于完全開放時的熒光產量，它與葉片的葉綠素濃度有關；Fm(最大熒光)是葉片經暗適應20min后，光系統II (PS II )反應中心處于完全關閉時的熒光產量，可反映PS II的電子傳遞情況；Fo':(光下最小熒光)是光適應狀態下全部PS II中心都開放時的突光強度；Fm'(光下最大突光)是光適應狀態下全部PS II中心都關閉時的突光強度。其它動力學參數:
1: Fv/Fm= (Fm-Fo)/Fm:PS II的最大或潛在的光化學效率，反映的是PS II原初光能轉化效率[21_22]，非脅迫條件下該值變化極小，脅迫條件下該值有明顯下降[23]；
g Yield=OPSII=AFziFm' =(Fm/ -FVFm':PS II 實際光化學量子效率，反映了植物目前的實際光合效率；
I qN=(Fv-Fv' ) /Fv=1-(Fm' -Fo' )/(Fm-Fo)或 NPQ=(Fm-Fm' )/Fm' =Fm' -1:非光化學淬滅系數；
Rfd=Fd/Fs= (Fm-Fs )/Fs:此比值為葉片活力指標，反映葉片光合作用活力，即葉片潛在的光合作用量子轉化效率。
對不同處理下各苗木的原始熒光參數(Fm、Fv)和其他動力學葉綠素熒光參數(Fv/Fm、OPSI1、Rfd和NPQ)進行單因素方差分析，以檢驗其變化的顯著性，多重比較采用Duncan法，所有數據處理以及圖表制作均采用Excel和SPSS軟件處理。不同處理方式的水培苗Fm、Fv和Fv/Fm值
熒光分析當中，Fm和Fv均反映著光系統II的光化學活性。最大熒光(即Fm)是光系統II (即PS II )反應中心處于完全關閉狀態下的熒光產量，它既可以反映光系統II的電子傳遞情況，也能反映光是否受到抑制的情況(當Fm降低時)；可變熒光(即Fv)為Fm與Fo之差，反映著光系統II的電子受體一初級醌受體(即QA)的還原情況，研究發現，Fv值的變化程度反映著植物對周圍環境脅迫的忍耐能力[16]。從圖1中的Fm可以看出，木麻黃根際真菌7處理下的苗木，其Fm值與對照相比，差異達到顯著水平，較對照提高了 39.57%。從圖1中的Fv可以看出，木麻黃根際真菌7作用下，苗木的Fv值顯著高于對照植株，分別提高了 42.83%。熒光參數中，PS II的實際光化學效率(即Fv/Fm)是研究植物光合生理狀態的重要參數，反映著植物的潛在光合能力，同 時也是研究植物脅迫的重要參數，在非脅迫的環境條件下，植物的物種與生長條件對其影響不大，該參數值保持在0.75與0.85之間，一旦受到外界脅迫作用，Fv/Fm呈現明顯的下降趨勢，其值的減小意味著光系統II反應中心的光化學損害與光能熱耗散的增加[17]。圖2直觀地反映了不同接菌方式對木麻黃苗木Fv/Fm的影響。木麻黃根際真菌7的Fv/Fm值，與對照CK相比，增加了 2.32%。說明了接菌處理在一定程度上有利于提高苗木的潛在光合能力，增強其對外界條件的適應能力。不同處理方式水培苗ΦPSI1、Rfd和NPQ的值
OPSII能準確反映植物當前PSII反應中心的實際光合效率狀況，其值越大，光合結構電子傳遞能力越強，參與光化學反應的光能份額越大，越有利于提高植物的光合能力[18]。各接菌處理下，木麻黃根際真菌7的OPSII較對照增加了 31.52% ；
非光化學淬滅系數(NPQ)則為PS II天線色素吸收的光能以熱的形式耗散掉的份額，其值越大，則表示植物用于熱耗散的光能越多，植物光合作用的實際光能相應減少，從而降低植物的光合效率[17_18]。本試驗結果顯示，通過木麻黃根際真菌7的回接處理，接菌苗木的NPQ值較對照相比有下降的趨勢，減少了 22.1%。表I P接菌方式不同處理下木麻黃水培苗葉綠素熒光參數的特征值
1 ^菌株處理~'''
FungiΦΡ8ΠKPQ
treatment
0-SS3=0.120J3S=0-03 abc bcdefCK0.25^0..03 d1 133邊15 ab
*在表中的同一列數值中，有不同小寫字母者表示差異顯著(P < 0.05)本發明發現一株能促進木麻黃光合作用的內生真菌,將該株木麻黃內生真菌菌株采用蘸根或菌液澆施的方法接種于木麻黃幼苗。通過接種后植株的葉綠素熒光試驗，得出菌株的光合作用能力均較大程度高于對照，表明其對于促進植株的光合作用效能具有很大功用，從而進一步證實得到該株內生真菌能促進木麻黃光合作用。
參考文獻
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權利要求
1.一株促進木麻黃光合作用的內生真菌，其特征在于:所述內生真菌為曲霉{Aspergillus sp.)木麻黃根際真菌7,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6305。
2.一種如權利要求1所述的內生真菌的應用菌液，其特征在于:所述應用菌液的制備方法，是將所述的曲霉sp.)木麻黃根際真菌7接入液體培養基,搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值 6.4±0.2。
3.—種如權利要求2所述的應用菌液的用途，其特征在于:所述應用菌液用于林地澆根或苗木栽植前期 蘸根。
全文摘要
本發明涉及一株促進木麻黃光合作用的內生真菌。所述內生真菌為曲霉(Aspergillussp.)木麻黃根際真菌7，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.6305。將木麻黃根際真菌7接種于木麻黃水培苗，根據光合作用的各項指標綜合評判，進一步證實其對光合作用具有促進作用，尋找到對促進光合作用有益的功能內生真菌可應用于生產。通過菌液澆施的方法接種于木麻黃幼苗，表明其對于促進植株的光合作用和增加木麻黃的干物質積累具有極顯著效果。
文檔編號C12R1/66GK103173362SQ20131006879
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者洪偉, 吳承禎, 謝安強, 林燕青, 李鍵 申請人:福建農林大學