專利名稱：海參硫酸多糖在制備抗ii型糖尿病藥物或制品中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于保健食品和藥品領域，具體涉及海參硫酸多糖在預防、改善或治療II型糖尿病方面的應用。
背景技術：
糖尿病是一種以長期高血糖為主要特征的慢性內分泌代謝性疾病，其主要誘因是胰島素分泌絕對或相對不足以及(或)胰島素生物作用缺陷而引起的糖、脂肪代謝紊亂，是繼心腦血管疾病及癌癥之后的第三大致殘和致死性疾病。糖尿病分為I型糖尿病(胰島素依賴性糖尿病)和II型糖尿病(非胰島素依賴性糖尿病)。近年來，隨著經濟的發展、生活水平的提高和居民生活模式的改變，糖尿病的患病率呈現出全球性的上升趨勢，其中II型糖尿病占整個糖尿病的93.7%以上。胰島素抵抗(Insulin Resistance)是指胰島素的革巴器官對胰島素作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產生低于正常生物學效應的一種狀態，是II型糖尿病的主要特征，在II型糖尿病的發生、發展中起著至關重要的作用。因此，提高胰島素敏感性，改善患者的胰島素抵抗狀態，對II型糖尿病及其并發癥的治療具有重要意義。海參為棘皮動物門海參綱楣手目動物，是海洋中重要的食物和藥物資源。海參硫酸多糖是海參體壁的重要功效成分之一，主要包括海參硫酸軟骨素和海參巖藻聚糖硫酸酯兩種組分。其中，海參硫酸軟骨素是一類具有硫酸巖藻糖支鏈的類硫酸軟骨素，其單糖組成主要含有葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和巖藻糖等三種單糖，硫酸根含量約為35%。海參巖藻聚糖硫酸酯是一類主要由巖藻糖組成的直鏈硫酸多糖，其硫酸根含量約為32%。與已報道的海藻巖藻聚糖硫酸酯相比較，其化學結構差異較大但相對簡單，硫酸根含量較高。有關海參硫酸多糖的應用，國內外主要集中在抗凝血、抗血栓、抗腫瘤和免疫調節、防治高尿酸血癥等方面(文章例如 J Biol Chem, 2007，282: 14984-14991 ;食品科學，2012，33 (7): 251-255 ;營養學報，2011，33(6): 597-601。專利例如 CN031123457、CN2003101127139、CN2006101554645、CN2008101987443、CN2011100788764、CN201110345962.7)。但還沒有海參硫酸多糖在治療糖尿病方面的相關報道。

發明內容
本發明的目的在于提供海參硫酸多糖的一種新用途。海參硫酸多糖可顯著降低患者的空腹血糖，顯著改善胰島素抵抗，對預防、改善或治療II型糖尿病具有顯著的效果，同時無任何毒副作用，從而彌補現有技術的不足。為了解決上述技術 問題，本發明提供了一種海參硫酸多糖在制備預防、改善或治療II型糖尿病的藥物、保健食品或功能食品中的應用。其特征在于:所述的海參硫酸多糖為海參硫酸軟骨素、海參硫酸軟骨素低聚糖、海參巖藻聚糖硫酸酯、海參巖藻聚糖硫酸酯低聚糖中的任一種或幾種；其中海參硫酸軟骨素低聚糖和海參巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的分子量大于20KD。
所述海參硫酸多糖根據制備不同的藥物，加入常規的賦形劑、崩解劑、粘合劑、增溶劑等制成片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液。這些劑型是按照本領域的技術人員所熟知的方法制備。本發明提供了一種含有上述海參硫酸多糖的藥物，所述藥物制備成的藥劑可以是膠囊制劑、口服液制劑、片劑、顆粒劑或散劑。本發明提供了一種含有上述海參硫酸多糖的保健食品本發明提供了一種含有上述海參硫酸多糖的功能食品本發明提供了上述藥物、保健食品、功能食品在預防、改善或治療II型糖尿病中的應用。本發明有益的技術效果在于:本發明海參硫酸多糖在預防、改善或治療II型糖尿病的食品或藥品的應用中，動物實驗結果表明，海參硫酸多糖能顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖、提高葡萄糖耐量，降低空腹胰島素含量和胰島素抵抗指數，顯著上調和激活胰島素介導的PI3K/PKB/Glut4信號轉導通路。另外，海參硫酸多糖還能顯著協同噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物的降血糖和改善胰島素抵抗作用，同時消除該類降糖藥物的副作用。對胰島素抵抗和預防、治療II型糖尿病具有顯著的效果。本發明中海參硫酸多糖的制備方法成本低，工藝步驟簡單，可開發成安全有效地預防、改善或治療II型糖尿病的食品或藥品。


圖1:本發明的海參硫酸軟骨素對II型糖尿病小鼠骨骼肌中Glut4蛋白表達的影響。其中，T-Glut4和M-Glut4分別代表總Glut4和細胞外膜Glut4。##P〈0.01與正常對照組比較；#P〈0.01與模型對照組比較；*P〈0.05,**P<0.01與陽性對照組比較。

圖2:本發明的海參巖藻聚糖硫酸酯對II型糖尿病小鼠骨骼肌中葡萄糖轉運體4蛋白表達的影響。
具體實施例方式下面結合實施例來詳細說明本發明的實施方式，借此對本發明如何應用技術技術手段達成技術效果的過程充分理解和據以實施。本發明所用到的海參硫酸軟骨素、海參硫酸軟骨素低聚糖、海參巖藻聚糖硫酸酯、海參巖藻聚糖硫酸酯低聚糖可以為市售的產品，其一種制備方法如下:實施例1海參硫酸多糖的制備方法:1、海參硫酸軟骨素和海參巖藻聚糖硫酸酯的制備:將干海參去泥沙、粉碎，于95%乙醇中中脫脂24h，室溫下晾干。向IOOg干物中加入3L 0.1M乙酸鈉緩沖溶液(pH6.0)、IOg木瓜蛋白酶、2.92g EDTA溶液和1.21 g半胱氨酸溶液，于60°C水浴下攪拌反應24h之后，反應混合物離心(4000g，15min)。向上清液加入160mL 10%的CPC溶液，室溫下放置24h后，離心(3000g，15min)，棄去上清液。沉淀溶解于1.5L 3mol/L NaCl:乙醇(100:15v/v)溶液中，再加入3L 95%乙醇溶液，4°C放置24h，離心(3000g，15min)，沉淀用3L 80%和95%乙醇洗兩到三次。最后將沉淀于60°C干燥2h，蒸餾水溶解，用截流分子量為6000Da的中空纖維膜超濾并脫鹽，濃縮，凍干，得海參粗多糖。海參取4g海參粗多糖溶于IOOmL 25mmol/L NaH2PO4-NaOH (pH6.3)緩沖鹽溶液中，過DEAE-52陰離子交換柱，采用0-1.4mol/L NaCl緩沖鹽溶液進行梯度洗脫，流速為
0.5mL/min，每IOmin收集一管，于280nm處測吸光值檢測蛋白含量，采用改良的苯酚-硫酸法檢測各管的多糖含量，并通過液相TSK4000柱子檢測組分單一的管。收集后透析，真空冷凍干燥，得海參硫酸軟骨素和巖藻聚糖硫酸酯的純品。2、海參硫酸軟骨素低聚糖的制備方法:將約50mg的海參硫酸軟骨素溶于ImL
0.05mol/L硫酸溶液中，80°C水解l_3h。水解液采用Ba(OH)2中和、離心。上清液采用Sephadex G_10脫鹽，真空冷凍干燥，得相對分子量為20KD以上的海參硫酸軟骨素低聚糖。3、海參巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的制備方法:將約50mg的海參巖藻聚糖硫酸酯溶于2mL 0.1 mol/L硫酸溶液中，80°C水解3_5h。水解液采用Ba(OH)2中和、離心、透析、真空冷凍干燥，得相對分子量為20KD以上的海參巖藻聚糖硫酸酯低聚糖。實施例2:海參硫酸軟骨素對II型糖尿病小鼠的預防和治療作用一.材料和方法:采用高糖高脂飼喂法建立II型糖尿病小鼠模型。將體重為19 - 21g的C57BL/6雄性小鼠，隨機分為6組:正常對照組、模型對照組、陽性對照組、海參硫酸軟骨素(SC-CHS)低、高劑量組，高劑量海參硫酸軟骨素與羅格列酮復配組，每組10只。正常對照組飼喂正常飼料，其配方中蛋白含量為20%，脂肪含量為5%，淀粉為65%，礦物質及維生素復合物均參照AIN-93配方；其他組別小鼠飼喂高糖高脂飼料，其配方中蛋白含量為20%，脂肪含量為25%，蔗糖為30%，礦物質及維生素 復合物均參照AIN-93配方。陽性對照組在高糖高脂飼料基礎上添加0.075g/kg羅格列酮(Rosiglitazon，RSG)，劑量組在高糖高脂飼料基礎上分別添加
0.4g/kg和1.2g/kg海參硫酸軟骨素,復配組分別添加0.075g/kg羅格列酮和1.2g/kg海參硫酸軟骨素。連續喂養60d，實驗期間小鼠自由飲水和進食，每天記錄食量，每三天記錄小鼠體重。于末次喂食后，測定小鼠空腹血糖及口服葡萄糖耐受量、空腹血清胰島素含量。剝離骨骼肌，測定骨骼肌中胰島素介導的葡萄糖轉運通路中相關基因的蛋白表達水平。1.空腹血糖測定:小鼠禁食不禁水8 h，尾靜脈取血20 μ L，加入到0.4 mL蛋白沉淀劑中，混勻、離心、取上清液，參照試劑盒方法測定。2.口服糖耐量的測定小鼠禁食不禁水8 h，經口給予葡萄糖2 g/kg，分別測定給葡萄糖后0、0.5和2 h的血糖值，并按照公式計算曲線下面積(area under the curve, AUC) =0.25X (Oh血糖值+4 X 0.5h血糖值+3 X 2h血糖值)3.空腹血清胰島素測定:小鼠禁食不禁水10h，摘眼球取血，常規分離血清，參照ELISA試劑盒方法測定血清胰島素含量，并計算胰島素抵抗指數(HOMA-1R) =HOMA-1R=空腹血糖濃度X空腹胰島素含量/22.5。4.Western blotting 方法檢測 PI3K、PKB 和 Glut4 的蛋白表達水平:用ImL Western及IP裂解液裂解骨骼肌或經胰島素刺激的骨骼肌，提取總蛋白，蛋白含量采用雙縮脲法測定。取50 μ g蛋白溶于5XSDS蛋白上樣緩沖液中煮沸變性5min，行20%SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉移到硝酸纖維素膜上，以5%牛血清白蛋白封閉2h。分別加入兔抗鼠 PI3K、pPI3K-p85、PKB、pPKBTyr3°8、pPKBSer473、Glut4 和 β -actin 等一抗，4°C孵育過夜，，4°C孵育過夜。BST洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1: 5000)，室溫孵育2h。TBST充分洗滌后，用化學發光試劑顯影、曝光。用Image J圖像分析軟件對條帶的灰度值進行分析，Glut4蛋白相對表達量用Glut4/ β -actin灰度比值表示。5.統計方法實驗結果用表示。數據分析采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析，并同時
進行LSD比較，以P〈0.05為具有統計學意義上的差異。二.實驗結果:1.不同劑量海參硫酸軟骨素均能顯著降低II型糖尿病小鼠的空腹血糖含量，顯著提高口服葡萄糖耐受量；顯著降低II型糖尿病小鼠血清胰島素含量，降低胰島素抵抗指數，具有顯著的降血糖和改善胰島素抵抗的作用。高劑量海參硫酸軟骨素的作用效果與羅格列酮的相當。當海參硫酸軟·骨素與羅格列酮復配，能顯著提高羅格列酮的療效(見表I)。表I海參硫酸多糖對II型糖尿病小鼠空腹血糖值、糖耐量、空腹胰島素含量的影響(n=10)
權利要求
1.海參硫酸多糖在制備抗II型糖尿病藥物或制品中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的海參硫酸多糖為海參硫酸軟骨素、海參硫酸軟骨素低聚糖、海參巖藻聚糖硫酸酯或海參巖藻聚糖硫酸酯低聚糖中的任一種或幾種。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的海參硫酸多糖為海參硫酸軟骨素和海參巖藻聚糖硫酸酯。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的海參硫酸軟骨素低聚糖和海參巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的分子量大于20KD。
5.海參硫酸多糖在制備治療II型糖尿病藥物佐劑中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述的治療II型糖尿病藥物為噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物。
7.海參硫酸多糖 在制備治療II型糖尿病食品中的應用。
8.如權利要求5或7所述的應用，其特征在于所述的海參硫酸多糖為海參硫酸軟骨素、海參硫酸軟骨素低聚糖、海參巖藻聚糖硫酸酯或海參巖藻聚糖硫酸酯低聚糖中的任一種或幾種。
全文摘要
本發明公開了海參硫酸多糖在制備預防、改善或治療II型糖尿病的藥物、保健食品或功能食品中的應用。其特征是所述的海參硫酸多糖為海參硫酸軟骨素和海參巖藻聚糖硫酸酯中的一種或2種。動物實驗表明，所述海參硫酸多糖能顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖含量，提高口服葡萄糖耐受量，降低胰島素抵抗指數，顯著上調和激活胰島素介導的PI3K/PKB/Glut4信號轉導通路。所述海參硫酸多糖還能顯著協同噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物的作用，同時消除該類降糖藥物的副作用。本發明所述海參硫酸多糖具有很好的降血糖和改善胰島素抵抗的效果，可用于開發安全有效的預防、改善或治療II型糖尿病的藥物和制品。
文檔編號A23L1/30GK103110659SQ20131006866
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月4日 優先權日2013年3月4日
發明者王靜鳳, 胡世偉, 常耀光, 龍騰騰, 石迪, 薛長湖, 王玉明 申請人:中國海洋大學