專利名稱：一株具有延緩后酸化作用保加利亞乳桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
一株具有延緩后酸化作用保加利亞乳桿菌菌株及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株利用硫酸新霉素誘變、篩選得到的具有延緩后酸化作用的保加利亞乳桿菌菌株，以及該菌株的篩選方法及其在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳酸菌在發(fā)酵乳糖過(guò)程中能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，這些乳酸菌及其生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物不僅具有平衡腸道菌群、降低膽固醇、抗腫瘤、免疫以及延緩衰老等生理功能，還賦予產(chǎn)品良好的口感和風(fēng)味。我國(guó)使用的酸奶發(fā)酵劑主要有嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。一般認(rèn)為，保加利亞乳桿菌在低PH環(huán)境下能繼續(xù)發(fā)酵乳糖，是引起酸奶后酸化現(xiàn)象的主要菌株。目前，控制酸奶后酸化的方法主要有:調(diào)整酸奶發(fā)酵劑保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例；在發(fā)酵乳中添加nisin等細(xì)菌素控制保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)和代謝能力；改變細(xì)胞膜的通透性，抑制保加利亞乳桿菌的代謝等。其中，降低保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)和能量代謝是控制后酸化現(xiàn)象的有效方法。H+-ATPase酶是控制乳酸菌能量代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶。H+-ATPase位于乳酸菌細(xì)胞膜上，既能催化ATP的合成與水解也能調(diào)節(jié)跨膜的質(zhì)子梯度，其活性隨pH的降低而增強(qiáng)，其數(shù)量也隨著pH值的下降而增多。當(dāng)外界環(huán)境中pH降低時(shí)，H+-ATPase能通過(guò)水解ATP釋放出自由能，推動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子泵出胞外，形成膜PH梯度差，從而使細(xì)胞內(nèi)pH維持在中性附近，使細(xì)胞內(nèi)酶的活力不受影響。很多乳酸菌含有H+-ATPase,如短乳桿菌、乳酸乳球菌、乳酸鏈球菌和嗜熱鏈球菌等。 硫酸新霉素(neomycin)是一種能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素,利用硫酸新霉素能篩選出具有低H+-ATPase活力的菌株。其原理在于硫酸新霉素進(jìn)入細(xì)胞是一個(gè)耗能的過(guò)程，需要H+-ATPase的協(xié)助，因此只有低H+-ATPase活力的菌株才能在含有硫酸新霉素的篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。目前，已有一些關(guān)于利用硫酸新霉素篩選具有低H+-ATPase活力菌株的報(bào)道，包括乳酸乳球菌、瑞士乳桿菌、酒類酒球菌等，這些誘變菌株對(duì)低PH環(huán)境敏感，具有改變的細(xì)胞膜通透性以及降低生長(zhǎng)和能量代謝能力。本發(fā)明針對(duì)“酸奶后酸化”這一乳品加工業(yè)的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，以從我國(guó)青海的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選出來(lái)的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06為出發(fā)菌株，利用硫酸新霉素誘變、篩選出一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，并進(jìn)一步研究了其在脫脂乳培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸能力，可從根本上解決產(chǎn)品后酸化問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容為了解決保加利亞乳桿菌在酸奶儲(chǔ)存期間引起的后酸化現(xiàn)象，本發(fā)明使用硫酸新霉素誘變、篩選出一株H+-ATPase缺陷型保加利亞乳桿菌，該菌株在脫脂乳培養(yǎng)基中具有弱的產(chǎn)酸能力，作為弱后酸化酸奶發(fā)酵劑使用。本發(fā)明所述的具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌菌株是利用硫酸新霉素誘變德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06 (L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND06)后篩選獲得的，其中原始的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06)該菌株已于2013年I月15日保存在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCCN0.7133，篩選獲得的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種的分類命名為 Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2,德氏乳桿菌保加利亞亞種 NDO6-2 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2)已于 2Ol3 年 I 月15日保存于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCCN0.7134。本發(fā)明還涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在制備發(fā)酵乳、發(fā)酵食品中的應(yīng)用，所述菌株在42°C培養(yǎng)72h后，發(fā)酵乳pH值從6.44降至4，發(fā)酵乳PH值的下降幅度明顯低于出發(fā)菌株pH值的下降幅度，具有弱后酸化作用。所述菌株在42°C發(fā)酵后，在室溫25°C儲(chǔ)藏21d期間，pH值的變化范圍在4.57 4.07的范圍內(nèi)。所述菌株在42 °C發(fā)酵后，在室溫儲(chǔ)藏21d期間，pH值下降了 0.5pH單位。本發(fā)明還涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌作為酸奶發(fā)酵劑的用途。另一方面，本發(fā)明還涉及包含權(quán)利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌的發(fā)酵乳、發(fā)酵食品，所述發(fā)酵食品可以是酸奶。本發(fā)明提供了一種控制酸奶后酸化的方法，該方法是利用硫酸新霉素誘變出具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種。本發(fā)明通過(guò)改變野生菌株的H+-ATPase活性來(lái)改變菌種生理特性，降低菌株的生長(zhǎng)、代謝和產(chǎn)酸能力，同時(shí)避免了基因工程改良菌種帶來(lái)的外緣DNA問(wèn)題，具有一定的安全性，能緩解酸奶的后酸化現(xiàn)象，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，利用硫酸新霉素誘變具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌的方法是向MRS培養(yǎng)基中添加硫酸新霉素，硫酸新霉素在MRS培養(yǎng)基中的添加濃度為50-500 μ g/mL。硫酸新霉素的濃度對(duì)于控制酸奶后酸化起著非常重要作用，當(dāng)MRS培養(yǎng)基中硫酸新霉素的濃度過(guò)低時(shí)，對(duì)控制平板上的耐硫酸新霉素菌落的數(shù)量不明顯，當(dāng)硫酸新霉素濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)抑制耐硫酸新霉素菌落的生長(zhǎng)。利用硫酸新霉素篩選出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2，其在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后，H+-ATPase活性為0.44 μ mol/mg.min，和出發(fā)菌株相比H+-ATPase活力降低了 44%，具有弱的H+-ATPase活性。利用硫酸新霉素篩選出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2作為發(fā)酵劑使用時(shí)，421:培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，發(fā)酵乳的pH值高于出發(fā)菌株ND06發(fā)酵乳的pH值。利用硫酸新霉素篩選出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2作為發(fā)酵劑使用時(shí)，42°C培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，發(fā)酵乳的乳酸、乳糖和和半乳糖的代謝能力均低于出發(fā)菌株ND06。利用硫酸新霉素篩選出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌作為發(fā)酵劑使用時(shí)，42°C發(fā)酵后，在室溫(25°C)儲(chǔ)藏期間，發(fā)酵乳的pH值高于出發(fā)菌株ND06發(fā)酵乳的pH值。利用硫酸新霉 素篩選出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌作為發(fā)酵劑使用時(shí)，42°C發(fā)酵后，在室溫(25°C)儲(chǔ)藏期間，發(fā)酵乳的乳酸含量明顯低于出發(fā)菌株發(fā)酵乳的乳酸含量。一種具有弱H+-ATPase活力的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2的制備方法:①菌種活化將_70°C保存的ND06菌株接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h后，在MRS培養(yǎng)基中傳代2 3次。②硫酸新霉素溶液的配制硫酸新霉素溶液配制濃度為0.1 g/mL,經(jīng)0.22 μ m膜過(guò)濾滅菌后，_20°C儲(chǔ)存。③硫酸新霉素誘變將活化后的ND06菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)8h，使用PBS緩沖液(pH7.2)稀釋后，取100 μ L涂布于含有硫酸新霉素的MRS平板上，其中，硫酸新霉素的濃度為50、100、150、200、250、300、350、400、450 和 500 μ g/mL。37°C培養(yǎng) 72h 后，選取菌落數(shù)在 30 300之間的平板，挑選單個(gè)菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，檢測(cè)OD66tl和pH值，挑選OD660〈l和pH > 4.8的菌株。④硫酸新霉素誘變菌株的純化將挑選出的誘變菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，適當(dāng)稀釋后，涂布于MRS平板上，繼續(xù)培養(yǎng)48h，挑選單個(gè)菌落，-80°C保存。⑤ND06-2菌株的低溫冷凍真空保存

將步驟④篩選出的具有弱H+-ATPase活性的ND06-2菌株接種到MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗2遍后，加入凍干保護(hù)劑低溫凍干保存。另一方面，本發(fā)明提供了一種酸奶的制備方法，該方法的具體操作步驟如下:①均質(zhì):以牛奶為主要原料，將牛奶升溫至60°C，20MPa條件下均質(zhì)；②殺菌:95°C條件下滅菌IOmin;③接種，發(fā)酵:殺菌后的原料降溫至42°C，發(fā)酵劑的接種量為1.0X107cfU/mL，發(fā)酵時(shí)間為4 5h，待發(fā)酵乳的pH值降至4.5時(shí)，終止發(fā)酵，將發(fā)酵乳降溫灌裝，然后在常溫儲(chǔ)藏。綜上所述，本發(fā)明利用含有硫酸新霉素的MRS培養(yǎng)基篩選得到的可以作為弱后酸化發(fā)酵劑使用的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2,分類命名為L(zhǎng)actobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06-2,其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏登記號(hào)為CGMCCN0.7134。該菌株的H+-ATPase活力只有出發(fā)菌株的44%，在脫脂乳培養(yǎng)基中乳酸、乳糖和半乳糖的代謝能力明顯低于出發(fā)菌株，可以作為弱后酸化的酸奶發(fā)酵劑使用。在我國(guó)的許多地區(qū)，酸奶在運(yùn)輸、存儲(chǔ)和銷售過(guò)程中的冷鏈系統(tǒng)并不完備，因此在市場(chǎng)終端常出現(xiàn)后酸化等質(zhì)量問(wèn)題。使用具有弱tf-ATPase活性的保加利亞乳桿菌作為酸奶發(fā)酵劑，可以使酸奶的后酸化程度弱化，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。


圖1磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考實(shí)施例2圖2蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考實(shí)施例2圖3ND06及其誘變菌株ND06-2的H+-ATPase活性。參考實(shí)施例2
圖4ND06及其誘變菌株ND06-2在42 °C條件下發(fā)酵乳中半乳糖含量的變化。參考實(shí)施例5圖5ND06及其誘變菌株ND06-2在42°C條件下發(fā)酵乳中乳酸含量變化。參考實(shí)施例5圖6ND06及其誘變菌株ND06-2在42°C條件下發(fā)酵乳中乳糖含量變化。參考實(shí)施例5圖7ND06及其誘變菌株ND06-2在室溫(25°C )儲(chǔ)藏期間乳酸含量的變化。參考實(shí)施例具體實(shí)施方式
:下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1:一種具有弱H+-ATPase活力的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2的篩選方法所述具有弱H+-ATPase活力的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2菌株是利用硫酸新霉素誘變保加利亞乳桿菌ND06 (L.delbrueckiisubsp.bulgaricusND06)后篩選獲得的，該菌株已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCN0.7134，篩選獲得該菌株的方法如下:1.菌種活化將_70°C保存的保加利亞ND06菌株接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h后，在MRS培養(yǎng)基中傳代2 3次。2.硫酸新霉素溶液的配制硫酸新霉素溶液配制濃度為0.1 g/mL,經(jīng)0.22 μ m膜過(guò)濾滅菌后，_20°C儲(chǔ)存。3.硫酸新霉素誘變將活化后的ND06菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)8h，使用PBS緩沖液(pH7.2)稀釋后，取100 μ L涂布于含有硫酸新霉素的MRS平板上，其中，硫酸新霉素的濃度為50、100、150、200、250、300、350、400、450 和 500 μ g/mL。37°C培養(yǎng) 72h 后，選取菌落數(shù)在 30 300之間的平板，挑選單個(gè)菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，檢測(cè)OD66tl和pH值，挑選OD660〈l和pH > 4.8的菌株。4.硫酸新霉素誘變菌株的純化將挑選出的誘變菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，適當(dāng)稀釋后，涂布于MRS平板上，繼續(xù)培養(yǎng)48h，挑選單個(gè)菌落，-80°C保存。5.ND06-2菌株的低溫冷凍真空保存將步驟4篩選出的具有弱H+-ATPase活性的ND06-2菌株接種到MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗2遍后，加入凍干保護(hù)劑在低溫凍干保存，所述的凍干保護(hù)劑的配方為:脫脂乳10%，谷氨酸鈉0.1%，無(wú)菌水90%。實(shí)施例2:具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2的H+-ATPase活性檢測(cè)測(cè)定本申請(qǐng)說(shuō)明書實(shí)施例1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2的H+-ATPase活性，具體檢測(cè)方法及檢測(cè)結(jié)果如下:
1.建立磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線參考Ongol等報(bào)道的方法建立了磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用KH2PO4分別配制成PO43-濃度為 0mol/mL、0.2mol/mL、0.4mol/mL、0.6mol/mL、0.8mol/mL、L Omol/mL、L 2 μ mol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。從上述標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別量取350 μ L溶液，加入815 μ L染料，混合后在18°C培養(yǎng)15min，測(cè)定OD66tl值，建立磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。其中，染料由5N硫酸、25g/L鑰酸銨、10g/L甲氨基苯酚硫酸鹽、30g/L亞硫酸鈉以及蒸餾水(I:1:1:1:4)混合而成。2.H+-ATPase 酶粗提將出發(fā)菌株ND06及其誘變菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18h，離心收集菌體(3500 X g, IOmin, 4°C )，加入 250 μ L 濃度為 75mMTris_HCl 緩沖液(IOmMMgSO4, pH7.0),混勻后加入25 μ L甲苯，37°C水浴5min。細(xì)胞的凍融是在_80°C的乙醇和37°C水浴鍋中進(jìn)行的，凍融循環(huán)反復(fù)進(jìn)行2次后，12，000 Xg離心lOmin，棄去上清液，加入上述含有MgSOJATris-HCl緩沖液200 μ L后，震蕩混勻，用液氮迅速凍結(jié)，_80°C保存。3.H+-ATPase 活性測(cè)定從上述細(xì)胞粗提取物中取出25 μ L，添加到ImL濃度為50mMTris-maleate緩沖液(IOmMMgSO4, pH6.0)中。該混合液在37°C水浴鍋中水浴5min后，添加50 μ LATP (TaKaRa,
0.1Μ)，在水浴鍋中繼續(xù)反應(yīng)15min，然后加入600 μ L的0.1NHCl終止反應(yīng)，反應(yīng)物置冰上迅速冷卻后，離心(5000 X g，IOmin, 4°C )，收集上清液。吸取350 μ L上清液中加入815 μ L染料中，18°C反應(yīng)15min后,測(cè)定反應(yīng)物的OD66c!值,根據(jù)磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)物中無(wú)機(jī)磷酸鹽的含量。采用Bradford方法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。吸取270 μ LTris-maleate緩沖液與酶粗提物的混合液，加入15 μ L10%SDS和15 μ LlONNaOH,煮沸l(wèi)Omin，在冰上迅速冷卻后，測(cè)定反應(yīng)溶液中蛋白質(zhì)的含 量。H+-ATPase的活性用μ mol/mg.η η來(lái)表示,其中每個(gè)活力單位定義為ImgH+-ATPase的粗提取物在Imin內(nèi)分解ATP形成I μ mo I的無(wú)機(jī)磷酸鹽。4.H+-ATPase活性的測(cè)定結(jié)果在pH6的條件下測(cè)定的ND06及其誘變菌株ND06-2的H+-ATPase酶活，結(jié)果如圖3(ρ〈0.05)所示。ND06及其誘變菌株ND06-2的H+-ATPase活力分別為0.99和0.44 μ mol/mg.π η，誘變菌株ND06-2的H+-ATPase活力和出發(fā)菌株相比降低了 44%，和出發(fā)菌株相比，誘變菌株ND06-2具有明顯較弱的H+-ATPase活性。實(shí)施例3-6說(shuō)明實(shí)施例1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2菌株在乳品加工業(yè)中的應(yīng)用，尤其是其在脫脂乳培養(yǎng)基中的弱后酸化作用。實(shí)施例3:ND06及其誘變菌株ND06-2在42°C培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵乳pH值的變化將ND06 及其誘變菌株 ND06-2 在 42°C培養(yǎng) 0、4、8、12、16、20、24、36、48 和 72h 后，對(duì)比發(fā)酵乳PH值的變化。具體步驟如下:1.主要操作步驟:將ND06和誘變菌株ND06-2以1.0 X 107cfu/mL分別接種于12%的脫脂乳培養(yǎng)基中，42°C培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后發(fā)酵后，檢測(cè)發(fā)酵乳pH值的變化。2.發(fā)酵乳pH值的測(cè)定ND06及其誘變菌株ND06-2在42°C培養(yǎng)0_72h時(shí)發(fā)酵乳pH值的變化如表I所示。ND06-2及其出發(fā)菌株ND06在42°C發(fā)酵16h時(shí)，pH值均降到4.5左右，在發(fā)酵20、24、36、48和72h時(shí)，ND06-2發(fā)酵乳的pH值分別為4.4、4.13、4.1、4.08和4，和出發(fā)菌株ND06發(fā)酵乳的PH值相比，分別高出0.1,0.12,0.3,0.43和0.49，誘變菌株發(fā)酵乳pH值的下降幅度明顯低于出發(fā)菌株發(fā)酵乳PH值的下降幅度，可見(jiàn)誘變菌株ND06-2在發(fā)酵乳中的產(chǎn)酸能力要低于出發(fā)菌株。表1ND06及其誘變菌株ND06-2在42 V培養(yǎng)0_72h時(shí)發(fā)酵乳的pH值
權(quán)利要求
1.一種具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種，其特征在于所述具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌菌株是利用硫酸新霉素誘變德氏乳桿菌保加利亞亞種 ND06 (LactobaciIlusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06)后篩選獲得的，德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06，于2013年01月15日保藏在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0.7133。
2.一種具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株，其特征在于所述具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株的分類命名為(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricusND06_2),該菌株已于 2013 年 01 月 15 日保存于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0.7134。
3.權(quán)利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在制備發(fā)酵乳、發(fā)酵食品中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在制備發(fā)酵乳、發(fā)酵食品中的應(yīng)用，其特征在于:所述菌株在42 V培養(yǎng)72h后，發(fā)酵乳pH值從6.44降至4，發(fā)酵乳pH值的下降幅度明顯低于出發(fā)菌株pH值的下降幅度，具有弱后酸化作用。
5.權(quán)利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在制備發(fā)酵乳、發(fā)酵食品中的應(yīng)用，其特征在于:所述菌株在42°C發(fā)酵后，在室溫25°C儲(chǔ)藏21d期間，pH值的變化范圍在4.57 4.07的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求3所述的具有弱H +-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在制備發(fā)酵乳、發(fā)酵食品中的應(yīng)用，其特征在于:所述菌株在42 °C發(fā)酵后，在室溫儲(chǔ)藏21d期間，pH值下降了 0.5pH單位。
7.權(quán)利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌作為酸奶發(fā)酵劑的用途。
8.包含權(quán)利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌的發(fā)酵乳、發(fā)酵食品。
9.權(quán)利要求6所述的包含權(quán)利要求1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌的發(fā)酵乳、發(fā)酵食品，其特征在于所述發(fā)酵食品是酸奶。
10.利用權(quán)利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株ND006-2制備酸奶的方法，該方法的具體操作步驟如下: ①均質(zhì):以牛奶為主要原料,將牛奶升溫至60°C，20MPa條件下均質(zhì)； ②殺菌:95°C條件下滅菌IOmin; ③接種，發(fā)酵:殺菌后的原料降溫至42°C，發(fā)酵劑的接種量為1.0X107cfU/mL，發(fā)酵時(shí)間為4 5h，待發(fā)酵乳的pH值降至4.5時(shí)，終止發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌及其篩選方法和應(yīng)用，所述的保加利亞乳桿菌分類命名為L(zhǎng)actobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2，保藏登記號(hào)為CGMCC No.7134，可以作為弱后酸化發(fā)酵劑使用。本發(fā)明利用含有硫酸新霉的MRS平板篩選，得到一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，該菌株在脫脂乳中乳酸、乳糖和半乳糖的代謝能力明顯低于出發(fā)菌株，可以作為弱后酸化的酸奶發(fā)酵劑在工業(yè)生產(chǎn)中使用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103215199SQ20131007932
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者張和平, 丹彤 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)