專利名稱：大棗葉提取物及其在制備防治肝損傷藥物及保健食品中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物提取物的提取技術及其應用，具體涉及大棗葉提取物的提取技術及其在制備防治肝損傷藥物或保健品中的應用。
背景技術：
肝臟是機體最重要的臟器之一，肝臟疾病是臨床上較為常見的疾病。因此，肝臟疾病一直是醫學科學重點研究的對象之一。肝損傷是多種肝臟疾病共有的一種特點突出的病理狀態，嚴重威脅著人類健康。各種有害因素諸如藥物、病毒、酒精、生物等可能致使肝功能有不同程度的損害，從而使肝臟的解毒、排泄功能及貯備和再生能力降低，肝血流量減少，代謝負荷加重，從而發生內環境紊亂，肝細胞壞死和凋亡，進而造成肝損傷。全世界有數十億人曾經或正忍受著肝損傷的痛苦。肝損傷的長期存在往往會導致肝纖維化，是進而誘發肝硬化、肝功能衰竭、甚至肝癌的重要始動因素。因此預防和治療肝細胞損傷是臨床上肝病治療的重要環節之一，是抑制肝纖維化、肝壞死、肝硬化以及肝癌等疾病發生和發展的基礎。因此研究肝損傷防治藥物具有重要臨床意義。目前臨床常用的保肝藥物，或因為價格昂貴，或因使用不便，或具有較大副作用，使用受到限制。因此，進一步尋找用于預防和治療肝損傷的有效藥物仍然是當今藥理學工作者的努力方向。大棗葉系鼠李科棗屬植物棗(Ziziphus jujuba Mill.)的干燥葉。本草大棗葉作為藥用可用于治療小兒發熱、瘡癤、熱痱、爛腳、燙火傷等癥。關于大棗葉的現代研究較少，除少量作為茶飲原料開發應用外，較少被利用，多作為廢棄資源丟棄。目前尚未見以大棗葉為原料制備活性提取物的技術，也未見以大棗葉為主要組成組分應用于防治肝損傷的藥品或保健食品的報道。

發明內容
發明目的:本發明的目的是為了克服現有技術的不足，在大棗葉原有用途的基礎上，開發其新的臨床用途，提供大棗葉在防治肝損傷中的應用，實驗結果表明，其具有很好的防治肝損傷的作用。本發明的另一個目的在于公開一種大棗葉提取物的制備方法。技術方案:為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為:一種大棗葉提取物，它是通過以下步驟制備得到:(I)取大棗葉揀選、洗凈、干燥后放入提取罐中，加6 12倍量的50% 95%乙醇，加熱回流I 3次，過濾、合并提取液，濃縮至無醇味后，得大棗葉的醇提物備用；(2)取步驟(I)得到的大棗葉醇提物，加I 5倍量水，上大孔樹脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為60% 95%的乙醇洗脫，收集60% 95%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到大棗葉活性部位粗提物 ，備用；(3)取步驟(2)得到的大棗葉活性部位粗提物干法上聚酰胺柱，先分別用水和20%乙醇洗脫，再用濃度為70% 95%乙醇洗脫，并收集70% 95%乙醇洗脫液，濃縮，經減壓干燥得到大棗葉活性部位精制提取物；(4)取步驟(3)得到大棗葉活性部位提取物采用制備液相進一步富集得到精制大棗提取物，經檢測，總三萜和總黃酮含量>80%。作為優選方案，以上所述的大棗葉提取物，步驟(I)中提取條件為加10倍量濃度為80%的乙醇，加熱到80°C持續回流2小時。該方法可保證提取溶液和藥材之間達到足夠大的濃度差，增加目標成分的溶出率，因為乙醇濃度太低，大棗葉中的三萜酸類活性成分得率太低，乙醇濃度太高大棗葉中的黃酮苷類成分轉移率太低，且脂肪酸、葉綠素等雜質轉移率增加。因此本發明根據活性成分的性質，確定乙醇的濃度和用量，得到的提取物目標成分溶出率高，活性更強。作為優選方案，以上所述的大棗葉提取物，步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂。作為更優選方案，其中步驟(2)中所述的非極性大孔吸附樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂，收集濃度為90%乙醇洗脫液；步驟(3)中收集濃度為90%乙醇洗脫液。本發明以現代提取分離手段和藥理活性篩選相結合的方法確定大棗葉最佳防治肝損傷活性提取物，經大量實驗研究表明，通過非極性大孔吸附耦合聚酰胺柱色譜，采用不同濃度的乙醇洗脫，有利于大棗葉中的黃酮類和三萜類活性成分的富集，除去糖類、鞣質、葉綠素等雜質，得到高活性成分比例及活性更強的防治肝損傷活性提取物，經HPLC-ELSD及HPLC-DAD檢測該活性部位中三萜酸類和黃酮類成分部含量可達70%。作為優選方案，以上所述的大棗葉提取物，步驟(3)中所述的聚酰胺樹脂的粒徑為60-80目。作為優選方案，以上所述 的大棗葉提取物，步驟(4)中所述的制備液相富集的色譜條件為:色譜柱為安捷倫反相C18柱，流動相為甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，梯度洗脫的條件為:0至35分鐘，甲醇的含量由5%上升到45%，35至60分鐘甲醇的含量由45%上升到83%，檢測波長為285nm，流速為5ml/min，檢測器為二極管陳列檢測器。大棗葉及其提取物在制備防治肝損傷藥物或保健品中的應用。本發明經過大量實驗研究表明，大棗葉及其提取物能夠有效降低肝損傷模型動物血清ALT、AST活性及肝組織MDA含量，增強肝臟SOD活性，表明大棗葉具有明顯的肝臟保護作用，可應用于制備防治肝損傷的藥品或保健食品。本發明所述的大棗葉提取物在制備防治肝損傷的藥品或保健食品中的應用，將大棗提取物和藥學上可接受的載體制成片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物。本發明提供的大棗葉提取物制成膠囊劑時把大棗葉提取物和載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。將本發明提供的大棗葉提取物制成片劑時，把大棗葉提取物和乳糖或玉米淀粉，需要時加入潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。本發明提供的大棗葉提取物制成顆粒劑時，把大棗葉提取物和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。本發明提供的大棗葉提取物制成注射液時，取大棗葉提取物加入生理鹽水溶解然后加入活性碳，攪拌均勻，80°C加熱30分鐘，過濾，調節pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它濾器過濾至澄明，灌裝，在100至115°C滅菌30分鐘制成注射液。
本發明提供的大棗葉提取物制成其它劑型時，可按藥學常規方法制備得到。有益效果:本發明在大棗葉原有應用的基礎上進行新的用途開發，同時制備其活性提取物，和現現有技術相比具有以下優點:(I)本發明主要以生產大棗過程中產生的廢棄物大棗葉為原料，制備其活性提取物，開發其新用途，實現變廢為寶，提升了棗樹的可利用價值，實現了棗樹資源的綜合利用，具有很好的經濟效應。(2)本發明提供的大棗葉防治肝損傷活性提取物，實驗結果表明可顯著降低CCl4致肝損傷模型小鼠、乙醇致肝損傷模型小鼠、D-氨基半乳糖致肝損傷模型小鼠血清ALT、AST活性及肝組織MDA含量，增強肝臟SOD活性，表明該活性提取物不僅對化學性肝損傷、長期飲酒致肝損傷具有具有明顯的肝臟保護作用，同時對病毒性肝炎所致肝損傷也具有保護作用。因此大棗葉及其提取物有望開發成為新一代安全有效，用于防治多種類型肝損傷的藥物或保健品，同時也為大棗葉廢棄資源變廢為寶及棗樹資源綜合利用提供了途徑。(3)本發明提供的制備方法可操作性強，尤其是在分離過程中本發明首次采用大孔樹脂和聚酰胺樹脂聯用，并采用制備液相進一步富集純化，提取分離效率高，分離得到的大棗葉提取物活性成分含量高，抗肝損傷活性更強，不良反應更低，并且制備工藝中能量消耗少，生產成本低，對環境無污染。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，在閱讀了本發明之后，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。實施例1大棗葉防治肝損傷活性提取物，其通過以下方法制備得到:(I)取大棗葉揀選、洗凈、干燥后稱取10kg，放入提取罐中，加10倍量的80%乙醇，加熱回流3次，每次2h，過濾、合并提取液，濃縮至無醇味后，得大棗葉的醇提物(2L)備用；(2)取步驟(I)得到的大棗葉醇提物，加2倍量水，混勻后加入經活化的直徑為50厘米，高1.5米的DlOl大孔吸附樹脂層析柱中，預吸附12小時后，分別以水、10%乙醇和90%乙醇按2BV/h的速度洗脫，洗脫體積均為50L，收集90%乙醇洗脫液，濃縮至無醇味，得到大棗葉活性部位粗提物1L，備用；(3)取步驟(2)得到的大棗葉活性部位粗提物干法上經活化的直徑為20厘米，高1.5米的聚酰胺柱(60 80目)，先分別用20L的水和20%乙醇洗脫，再用濃度為90%乙醇洗脫，并收集90%乙醇洗脫液，濃縮，經減壓干燥得到大棗葉活性部位精制提取物610g ；(4)取步驟(3)得到大棗葉活性部位提取物采用制備液相進一步富集得到精制大棗提取物，經檢測，總三萜和總黃酮含量>80%。制備液相色譜條件為:色譜柱為安捷倫反相C18柱，流動相為甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，梯度洗脫的條件為:0至35分鐘，甲醇的含量由5%上升到45%，35至60分鐘甲醇的含量由45%上升到83%， 檢測波長為285nm，流速為5ml/min，檢測器為二極管陳列檢測器。實施例2大棗葉防治肝損傷活性提取物，其通過以下方法制備得到:
(I)取大棗葉揀選、洗凈、干燥后稱取10kg，放入提取罐中，加10倍量的70%乙醇，加熱回流3次，每次2h，過濾、合并提取液，濃縮至無醇味后，得大棗葉的醇提物(2.5L)備用；(2)取步驟(I)得到的大棗葉醇提物，加1.5倍量水，混勻后加入經活化的直徑為50厘米，高1.5米的AB-8大孔吸附樹脂層析柱中，預吸附12小時后，分別以水、10%乙醇和85%乙醇按2BV/h的速度洗脫，洗脫體積均為50L，收集85%乙醇洗脫液，濃縮至無醇味，得到大棗葉活性部位粗提物1L，備用；(3)取步驟(2)得到的大棗葉活性部位粗提物干法上經活化的直徑為20厘米，高1.5米的聚酰胺柱(60 80目)，先分別用20L的水和20%乙醇洗脫，再用濃度為80%乙醇洗脫，并收集80%乙醇洗脫液，濃縮，經減壓干燥得到大棗葉活性部位精制提取物570g ；(4)取步驟(3)得到大棗葉活性部位提取物采用制備液相進一步富集得到精制大棗提取物，經檢測，總三萜和總黃酮含量>80%。制備液相色譜條件為:色譜柱為安捷倫反相C18柱，流動相為甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，梯度洗脫的條件為:0至35分鐘，甲醇的含量由5%上升到45%，35至60分鐘甲醇的含量由45%上升到83%，檢測波長為285nm，流速為5ml/min，檢測器為二極管 陳列檢測器。實施例3大棗葉防治肝損傷活性提取物，其通過以下方法制備得到:(I)取大棗葉揀選、洗凈、干燥后稱取10kg，放入提取罐中，加8倍量的90%乙醇，加熱回流2次，每次2h，過濾、合并提取液，濃縮至無醇味后，得大棗葉的醇提物(1.6L)備用；(2)取步驟(I)得到的大棗葉醇提物，加3倍量水，混勻后加入經活化的直徑為50厘米，高1.5米的HP-20大孔吸附樹脂層析柱中，預吸附12小時后，分別以水、10%乙醇和95%乙醇按2BV/h的速度洗脫，洗脫體積均為50L，收集95%乙醇洗脫液，濃縮至無醇味，得到大棗葉活性部位粗提物1L，備用；(3)取步驟(2)得到的大棗葉活性部位粗提物干法上經活化的直徑為20厘米，高
1.5米的聚酰胺柱(100目)，先分別用20L的水和20%乙醇洗脫，再用濃度為95%乙醇洗脫，并收集80%乙醇洗脫液，濃縮，經減壓干燥得到大棗葉活性部位精制提取物6050g ；(4)取步驟(3)得到大棗葉活性部位提取物采用制備液相進一步富集得到精制大棗提取物，經檢測，總三萜和總黃酮含量>81%。制備液相色譜條件為:色譜柱為安捷倫反相C18柱，流動相為甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，梯度洗脫的條件為:0至35分鐘，甲醇的含量由5%上升到45%，35至60分鐘甲醇的含量由45%上升到83%，檢測波長為285nm，流速為5ml/min，檢測器為二極管陳列檢測器。實施例4大棗葉提取物抗肝損傷的實驗研究一、實驗材料與藥物1.藥物和試劑AST, ALT,MDA, SOD試劑盒及考馬斯亮藍蛋白試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；四氯化碳(CCl4，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，使用時用花生油配制成0.1%的花生油溶液；氨基半乳糖苷(D-GalN，Sigma公司)，臨用前蒸餾水溶解稀釋成70mg/mL溶液；聯苯雙酯片(江蘇鵬鷂藥業有限公司)，臨用時碾成細粉加生理鹽水制成混懸液。2.實驗動物清潔級雄性ICR小鼠，體重18 22g，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號SCXK(浙)2008-0033。3.實驗儀器酶聯免疫儀(美國Bio-Tek公司);UV_2000型紫外分光光度計(北京萊柏泰科儀器有限公司)；BT125型電子 天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；AnkeGL-16GII型離心機(上海安亭科學儀器廠)。4.受試藥物及處理方法分別取實施例1 3制備得到的大棗葉提取物，加水稀釋制成所需濃度；陽性藥為聯苯雙酯，給藥前以蒸餾水溶解配制成所需濃度。二、實驗方法1.對CCl4致小鼠急性肝損傷的影響取60只小鼠，適應性喂養I周后，按體重隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組，CCl4至肝損傷模型組，實施例2制備得到的大棗葉提取物低劑量組(0.25g/kg/d)、中劑量組(0.5g/kg/d)和高劑量組(1.0g/kg/d),聯苯雙酯組(150mg/kg/d)。對照組及模型組給予同量的生理鹽水，給藥組連續灌胃10d，于末次給藥后lh，除正常組ip0.9%NaC110mL/kg外，其余各組均ip0.1%CC14花生油溶液10mL/kg。16h后，所有小鼠采用眼眶后靜脈叢采血，分離血清，測定血清中ALT及AST的活性。取血后處死小鼠，隨即取部分肝臟，用生理鹽水制備成10%的肝勻漿，按照試劑盒說明測定MDA含量及SOD活力。2.對D-GalN致小鼠急性肝損傷的影響取60只小鼠，適應性喂養I周后，按體重隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組，D-GalN致肝損傷模型組，實施例1制備得到的大棗葉提取物低劑量組(0.25g/kg/d)、中劑量組(0.5g/kg/d)和高劑量組(1.0g/kg/d),聯苯雙酯組(150mg/kg/d)。對照組及模型組給予同量的生理鹽水，給藥組連續灌胃10d，于末次給藥后lh，除正常組ip0.9%NaC110mL/kg外，其余各組均ipD_GalN700mg/kg。16h后，所有小鼠采用眼眶后靜脈叢采血，分離血清，測定血清中ALT及AST的活性。取血后處死小鼠，隨即取部分肝臟，用生理鹽水制備成10%的肝勻漿，按照試劑盒說明測定MDA含量及SOD活力。3.對乙醇致小鼠肝損傷的影響取60只小鼠，適應性喂養I周后，按體重隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組，乙醇致肝損傷模型組，實施例3制備得到的大棗葉提取物低劑量組(0.25g/kg/d)、中劑量組(0.5g/kg/d)和高劑量組(1.0g/kg/d)，聯苯雙酯組(150mg/kg/d)。除正常對照組(以等體積的蒸餾水灌胃)外，其余各組均按7mL/kg/次灌胃給予50%乙醇，2次/d，中間間隔6h，連續15d。自造模第I天起，每日灌胃給藥I次。正常對照組和模型對照組灌服等體積的蒸餾水，其余各組分別灌胃給予相應的大棗葉提取物及聯苯雙酯。最后I次灌胃6h后，所有小鼠采用眼眶后靜脈叢采血，分離血清，測定血清中ALT及AST的活性。取血后處死小鼠，隨即取部分肝臟，用生理鹽水制備成10%的肝勻漿，按照試劑盒說明測定MDA含量及SOD活力。4.統計學處理
所有實驗數據均采用SPSS11.5統計處理軟件進行統計學處理，結果以^±s表示，組間比較采用方差分析。三、實驗結果1.大棗葉提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷的影響CCl4肝損傷模型組與正常組比較，小鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平明顯升高(P〈0.01)，SOD活性明顯降低(P〈0.01);大棗葉、實施例2制備得到的大棗葉提取物各劑量組、聯苯雙酯組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠血清ALT、AST降低(P〈0.01);大棗葉提取物低劑量組有降低肝組織MDA水平，升高肝組織SOD水平的趨勢，但無顯著性差異(P>0.05);大棗葉提取物高、中劑量組和聯苯雙酯組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠肝組織MDA水平降低(P〈0.05)，SOD水平升高(P〈0.05)。具體實驗結果見表I。表I大棗葉提取物對CCl4致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝臟SOD、MDA的影響(mean土SD, n=10)
權利要求
1.一種大棗葉提取物，其特征在于，通過以下步驟制備得到: (I)取大棗葉揀選、洗凈、干燥后放入提取罐中，加6 12倍量的509Γ95%乙醇，加熱回流廣3次，過濾、合并提取液，濃縮至無醇味后，得大棗葉的醇提物，備用； (2)取步驟(I)得到的大棗葉醇提物，加廣5倍量水，上大孔吸附樹脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為60°/Γ95%的乙醇洗脫，收集60°/Γ95%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到大棗葉活性部位粗提物，備用； (3)取步驟(2)得到的大棗葉活性部位粗提物干法上聚酰胺柱，先分別用水和20%乙醇洗脫，再用濃度為709Γ95%乙醇洗脫，并收集709Γ95%乙醇洗脫液，濃縮，經減壓干燥得到大棗葉活性部位提取物； (4)取步驟(3)得到大棗葉活性部位提取物采用制備液相進一步富集得到精制大棗提取物。
2.根據權利要求1所述的大棗葉提取物，其特征在于，步驟(I)中提取條件為加10倍量濃度為80%的乙醇，加熱到80°C持續回流2小時。
3.根據權利要求1所述的大棗葉提取物，其特征在于，步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂。
4.根據權利要求3所述的大棗葉提 取物，其特征在于，所述的非極性大孔吸附樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。
5.根據權利要求1所述的大棗葉提取物，其特征在于，步驟(3)中所述的聚酰胺樹脂的粒徑為60-80目。
6.根據權利要求1所述的大棗葉提取物，其特征在于，步驟(4)中所述的制備液相富集的色譜條件為:色譜柱為安捷倫反相C18柱，流動相為甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，梯度洗脫的條件為:0至35分鐘，甲醇的含量由5%上升到45%，35至60分鐘甲醇的含量由45%上升到83%，檢測波長為285nm，流速為5ml/min，檢測器為二極管陳列檢測器。
7.權利要求1所述的大棗葉提取物在制備防治肝損傷藥物或保健品中的應用。
8.根據權利要求7所述的大棗葉提取物在制備防治肝損傷藥物或保健品中的應用，其特征在于，將大棗提取物和藥學上可接受的載體制成片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種大棗葉活性提取物及其在制備防治肝損傷藥物或保健品中的應用。本發明首次采用大孔樹脂耦合聚酰胺樹脂，然后通過制備液相制備大棗葉精制提取物，較傳統的分離純化方法分離效率更高，且分離得到的活性成分含量高，生物活性強，安全性高。經實驗研究表明，大棗葉提取物可顯著降低CCl4、D-GalN和乙醇所致肝損傷模型小鼠血清ALT、AST活性及肝組織MDA含量，增強肝臟SOD活性，對肝損傷具有很好的防治功效。因此大棗葉及大棗葉提取物有望開發成為新一代安全有效，用于防治肝損傷的藥物或保健品，同時也為大棗葉廢棄資源變廢為寶及棗樹資源綜合利用提供了途徑。
文檔編號A23L1/29GK103169788SQ20131013299
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月16日 優先權日2013年4月16日
發明者郭盛, 段金廒, 錢大瑋, 宿樹蘭 申請人:南京中醫藥大學