專利名稱：一種青蛤多糖提取物的提取方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生化藥物領域，具體涉及一種青蛤多糖提取物的提取方法，本發明還涉及前述方法提取得到的青蛤多糖提取物的應用。
背景技術：
青蛤sinensis)為軟體動物門瓣鰓綱簾蛤目簾蛤科動物，是我國南北沿海習見和主要的食用雙殼貝類，是我國灘涂養殖貝類的主要品種，有著很大的開發潛力。青蛤營養成分分析表明，軟體中含有豐富的糖類、蛋白質(肽)等成分，含有亮氨酸、蛋氨酸等10多種人體必需的氨基酸，還含有酪氨酸和胱氨酸等非必需氨基酸，不飽和脂肪酸含量大大高于飽和脂肪酸，EPA和DHA的含量較高。因此，青蛤以其肉味鮮美、營養豐富、蛋白質含量高等諸多優點，逐漸成為人們喜愛的海產品。此外，傳統醫學認為，青蛤具有軟堅散結、清熱化痰的功效，主治虛癥、咳嗽氣喘等有一定療效。青蛤肉提取液中含有多種藥理活性物 質，在提高機體免疫力方面也有重要作用。目前對青蛤的研究主要集中在繁殖、增養殖技術和食品初加工等方面，但有關青蛤生物活性大分子提取物，如多糖和蛋白質的研究報道較少。目前市場上未見關于青蛤提取物的藥物和保健品。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提出一種工藝合理、可操作性強、有效提取青蛤多糖成份的青蛤多糖提取物的提取方法。本發明所要解決的另一個技術問題是提供了前述方法提取得到的提取物在制備抗氧化保健品中的應用。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種青蛤多糖提取物的提取方法，其特點是，其步驟如下
(1)取青蛤軟體部位為原材料，洗凈、絞碎后，加水煎煮1-3次，每次煎煮2-4小時，煎煮時水與青蛤軟體原材料的質量比為5-20:1 ；
(2)濾過，合并煎煮液，然后將煎煮液在3000-8000轉/分下離心，收集上清液，濃縮后，向濃縮液中加入蛋白酶，在4°C下靜置12-24小時進行脫蛋白處理，收集脫蛋白后的水溶液；
(3 )向脫蛋白后的水溶液中加入無水乙醇以沉淀多糖，無水乙醇在攪拌狀態下加入，所加無水乙醇在沉淀體系中的體積百分含量為60-80% ;濾過，得沉淀物，干燥得青蛤多糖提取物。本發明所述的青蛤多糖提取物的提取方法技術方案中，進一步優選的技術方案或者技術特征是
I.在步驟(2)中煎煮液離心時的轉速優選為5000轉/分。2.在步驟(2)中，所述的蛋白酶可以為常用的蛋白酶，優選為木瓜蛋白酶。3.步驟(3)中所述的干燥方法優選為將沉淀物于50_70°C烘箱中干燥30_35小時。或者優選為將沉淀物置于冷凍干燥機中，_25°C凍干48小時。本發明方法所制得的青蛤多糖提取物的成份主要由多糖和蛋白質組成，經按常規方法檢測，其中多糖含量占70%以上，蛋白質和其他成分含量低于30%。本發明所述的提取方法所提取得到的青蛤多糖提取物可以用來制備抗氧化保健品。本發明方法制得的青蛤多糖提取物具有一定的抗氧化的活性。本發明通過體外藥效學實驗對上述青蛤多糖提取物的抗氧化活性進行了驗證，結果證實青蛤多糖提取物具有較強的還原能力和總抗氧化能力，對DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基的清除活性隨濃度升高而增大，表現出較強的抗氧化活性。與現有技術相比，本發明方法原料易得，操作簡單方便，可操作性強，該方法可以有效地提取得到具有較強抗氧化能力的青蛤多糖成份。



圖I為青蛤多糖提取物的還原能力測定 圖2為青蛤多糖提取物的總抗氧化能力測定 圖3為青蛤多糖提取物清除DPPH自由基能力的測定 圖4為青蛤多糖提取物清除羥自由基能力的測定 圖5為青蛤多糖提取物清除超氧陰離子自由基能力的測定圖。
具體實施例方式以下實施方式視為本發明的一些舉例，以使本技術領域的技術人員進一步的理解本發明，而不應視為是對本發明的限定。實施例1，一種青蛤多糖提取物的提取方法，其步驟如下
(1)取青蛤軟體部位為原材料，洗凈、絞碎后，加水煎煮I次，每次煎煮2小時，煎煮時水與青蛤軟體原材料的質量比為5:1 ；
(2)濾過，合并煎煮液，然后將煎煮液在3000轉/分下離心，收集上清液，濃縮后，向濃縮液中加入蛋白酶，在4°C下靜置12小時進行脫蛋白處理，收集脫蛋白后的水溶液；
(3 )向脫蛋白后的水溶液中加入無水乙醇沉淀多糖，無水乙醇在攪拌狀態下加入，所加無水乙醇在沉淀體系中的體積百分含量為60% ;濾過，得沉淀物，干燥得青蛤多糖提取物。實施例2，一種青蛤多糖提取物的提取方法，其步驟如下
(1)取青蛤軟體部位為原材料，洗凈、絞碎后，加水煎煮3次，每次煎煮4小時，煎煮時水與青蛤軟體原材料的質量比為20:1 ；
(2)濾過，合并煎煮液，然后將煎煮液在8000轉/分下離心，收集上清液，濃縮后，向濃縮液中加入蛋白酶，在4°C下靜置24小時進行脫蛋白處理，收集脫蛋白后的水溶液；
(3 )向脫蛋白后的水溶液中加入無水乙醇沉淀多糖，無水乙醇在攪拌狀態下加入，所加無水乙醇在沉淀體系中的體積百分含量為80% ;濾過，得沉淀物，將沉淀物置于冷凍干燥機中，-25°C凍干48小時，得青蛤多糖提取物。實施例3，一種青蛤多糖提取物的提取方法，其步驟如下
(I)取青蛤軟體部位為原材料，洗凈、絞碎后，加水煎煮1-3次，每次煎煮2-4小時，煎煮時水與青蛤軟體原材料的質量比為10:1 ；(2)濾過，合并煎煮液，然后將煎煮液在5000轉/分下離心，收集上清液，濃縮后，向濃縮液中加入木瓜蛋白酶，在4°C下靜置18小時進行脫蛋白處理，收集脫蛋白后的水溶液；
(3 )向脫蛋白后的水溶液中加入無水乙醇沉淀多糖，無水乙醇在攪拌狀態下加入，所加無水乙醇在沉淀體系中的體積百分含量為70% ;濾過，得沉淀物，將沉淀物于50-70°C真空箱中干燥30-35小時，得青蛤多糖提取物。實施例4，參照圖1，實施例3制得的青蛤多糖提取物進行的還原能力測定實驗。于試管中分別加入1.0 mL不同質量濃度的青蛤多糖提取物水溶液，再分別加入
I.O mL磷酸緩沖溶液(O. 2 mol/L, pH6. 6)及I. O mL鐵氰化鉀水溶液(1%)，50°C水浴20min后取出快速冷卻,加入I. O mL三氯乙酸水溶液(10%),搖勻，5000 rpm/min離心5 min。取I. O mL上清液，依次加入I. O mL蒸餾水，O. 5 mL三氯化鐵水溶液(O. 1%)，充分混勻，10min后，在700 nm波長處測定吸光度，吸光度越大，則說明還原能力越強。實驗結果見圖1，由圖可見青蛤多糖提取物具有一定的還原能力，隨著多糖提取物濃度提高，還原力呈上升 趨勢。實施例5，參照圖2，實施例3制得的青蛤多糖提取物進行的總抗氧化力測定實驗。總抗氧化力的測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，在520 nm處測定樣品的吸光度。一個單位的總抗氧化力定義為37°C時每毫升待測樣品液每分鐘吸光度增加0.01。總抗氧化能力(TAC)是由下面的公式描述TAC (U/ml) = [C4s- A0)/(O. 01*30)]*Kt*Ks*C，其中，Js表示樣品的吸光度·Λ)表示對照組吸光度A表示反應液總體積(ml) ;KS表示樣品液體積(ml) K表示樣品的稀釋倍數。結果如圖2所示，隨著青蛤多糖提取物濃度的提高，總抗氧化能力呈明顯上升趨勢。實施例6，參照圖2，實施例3制得的青蛤多糖提取物清除DPPH自由基活性的測定實驗。取100 μ I待測液及50 μ I的2X1(T4 mol/L DPPH溶液加入96孔板中，搖勻。20min后用相應溶劑作參比在517 nm下測定其吸光度<，同時測定2X 10_4 mol/L DPPH溶液與等體積相應溶劑混合液的吸光度尤，以及待測液與等體積無水乙醇混合液的吸光度根據以下公式計算清除率7=( A- A1+ 4) *100/ 4，結果如圖3所示，從圖中可以看出，當青蛤多糖提取物水溶液的濃度從I. 25 mg/mL增加到20. O mg/mL，其清除DPPH自由基的能力從(52. 44 土 I. 12)%升高到(83.01 土 3. 84)%，說明青蛤多糖提取物具有顯著的DPPH自由基清除活性。實施例7，參照圖2，實施例3制得的青蛤多糖提取物清除羥自由基活性的測定實驗。取不同濃度提取液50 μ L, 50 μ L 9 mmol/L硫酸亞鐵與50 μ L 8. 8 mmol/ LH2O2于96孔酶標板充分混合后,分別加入50 μ L 10 mmol/ L水楊酸的乙醇溶液,搖勻,靜置20 min，以蒸餾水為參比，在508 nm處測定吸光度⑷)。按照上述操作，用蒸餾水代替樣品液，測定得疋，用蒸餾水代替H2O2溶液，測定得名。根據以下公式計算清除率7=( A-A1+ 4) *100/ ^，結果如圖4所示，從圖中可以看出青蛤多糖提取物對羥自由基的清除效應隨濃度的增加而升高，呈現良好的濃度依賴曲線。當青蛤多糖提取物濃度從5. O mg/mL增加到40. O mg/mL，其清除羥自由基的能力從(17. 53 + 1. 24)%升高到(85. 99 + 3. 36)%。實施例8，參照圖2，實施例3制得的青蛤多糖提取物清除超氧陰離子自由基活性的測定實驗。采用鄰苯三酚自氧化法測定。取濃度為O. I mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7. 3，內含2 mmol/L EDTA) 100 yL，超純水50 μ L加入96孔酶標板中，于25°C保溫20 min后加入預熱過的60 mmol/L的鄰苯三酹50 μ L (以10 mmol/L HCl溶液配制)，迅速搖勻,在319 nm波長處每隔50 s測一次，測定啟動后5 min內鄰苯三酚自氧化的速率，記作八義。加入50 UL樣品液，相應減少同體積水，測定啟動后5 min內樣品抑制鄰苯三酚自氧化的速率Λ木。根據以下公式計算清除率7=( AA0- AAS)*100/ Λ次，結果如圖5所示，從圖 中可以看出青蛤多糖提取物具有較強的超氧陰離子自由基清除活性，隨著多糖濃度提高，其對超氧陰離子自由基的清除活性呈上升趨勢。
權利要求
1.一種青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，其步驟如下 (1)取青蛤軟體部位為原材料，洗凈、絞碎后，加水煎煮1-3次，每次煎煮2-4小時，煎煮時水與青蛤軟體原材料的質量比為5-20:1 ； (2)濾過，合并煎煮液，然后將煎煮液在3000-8000轉/分下離心，收集上清液，濃縮后，向濃縮液中加入蛋白酶，在4°C下靜置12-24小時進行脫蛋白處理，收集脫蛋白后的水溶液； (3 )向脫蛋白后的水溶液中加入無水乙醇以沉淀多糖，無水乙醇在攪拌狀態下加入，所加無水乙醇在沉淀體系中的體積百分含量為60-80% ;濾過，得沉淀物，干燥得青蛤多糖提取物。
2.根據權利要求I所述的青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，步驟(2)中煎煮液離心時的轉速為5000轉/分。
3.根據權利要求I所述的青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶。
4.根據權利要求I所述的青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的干燥方法為將沉淀物于50-70°C烘箱中干燥30-35小時。
5.根據權利要求I所述的青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的干燥方法為將沉淀物置于冷凍干燥機中，_25°C凍干48小時。
6.權利要求1-5任何一項所述的提取方法所提取得到的青蛤多糖提取物在制備抗氧化保健品中的應用。
全文摘要
一種青蛤多糖提取物的提取方法，取青蛤軟體部位為原材料，洗凈、絞碎后，加水煎煮1-3次，每次煎煮2-4小時，煎煮時水與青蛤軟體原材料的質量比為5-20:1；濾過，合并煎煮液，然后將煎煮液在3000-8000轉/分下離心，收集上清液，濃縮后，向濃縮液中加入蛋白酶，在4℃下靜置12-24小時進行脫蛋白處理，收集脫蛋白后的水溶液；向脫蛋白后的水溶液中加入無水乙醇以沉淀多糖，無水乙醇在攪拌狀態下加入，所加無水乙醇在沉淀體系中的體積百分含量為60-80%；濾過，得沉淀物，干燥得青蛤多糖提取物。本發明方法原料易得，操作簡單方便，可操作性強，該方法可以有效地提取得到具有較強抗氧化能力的青蛤多糖成份。
文檔編號C08B37/00GK102887961SQ201210333998
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者郭雷, 姚東瑞, 許福泉, 王淑軍, 張敬敏, 董志國 申請人:淮海工學院