一種靈芝誘變株液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料生產(chǎn)多糖的方法
【專利摘要】一種靈芝多糖的生產(chǎn)方法，涉及食品微生物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。按照下述步驟進(jìn)行：稱取原料，米糠為1-5g/100mL，麩皮為1-4.5g/100mL，磷酸二氫鉀0.1-0.5g/100mL，硫酸鎂0.1-0.5g/100mL；加所需的水后，裝料，pH自然，121℃滅菌兼蒸煮30min；冷卻后接入同時(shí)發(fā)明得到的靈芝CCTCC?M2013287液體種子，接種量8-10％，發(fā)酵溫度25-30℃，發(fā)酵時(shí)間4-7d；發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)破壁熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖。該方法更好地實(shí)現(xiàn)了米糠麩皮經(jīng)液態(tài)發(fā)酵高效高值化轉(zhuǎn)化為靈芝多糖的目的。
【專利說明】一種靈芝誘變株液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料生產(chǎn)多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品微生物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用靈芝誘變新菌株液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料培養(yǎng)基中高產(chǎn)靈芝多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自從 Chihara 等人(參考文獻(xiàn):Chihara G, MaedaY, Hamuro J, et al.1nhibitionof mouse sarcomal80by polysaccharides from Lentinus edodes(Berk.) sing[J].Nature, 1969，222 (5194):687-688.)于1969年在《Nature》上發(fā)表論文，揭示香菇多糖具有抗腫瘤活性以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的藥用真菌達(dá)兩百多種，其中一部分還是食用真菌，如灰樹花、猴頭菌、靈芝等。這些食用菌的菌絲體、子實(shí)體、菌核或孢子中能產(chǎn)生諸如氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、多糖、苷類、黃酮類及抗生素等多種活性成分或富集微量元素硒、鋅等，具有提高人體免疫力、抗腫瘤、增強(qiáng)肝功能、抗氧化等多種功效。國內(nèi)市場已有食用菌保健食品如靈芝膠囊、灰樹花膠囊及冬蟲夏草膠囊等在熱銷。國際上新西蘭、日本、美國等均產(chǎn)有類似的產(chǎn)品。新西蘭的“GanoPoly”系列產(chǎn)品由靈芝、云芝等提取的多糖復(fù)合殼聚糖而成，主要用于提高免疫力、輔助抗腫瘤治療等方面。就靈芝多糖而言，針對其的研究表明:靈芝多糖具有良好的提聞免疫力、輔助抗腫瘤治療等療效，例如Huang、Seto等從靈芝菌體中提取靈芝多糖的藥效試驗(yàn)表明，靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用(參考文獻(xiàn)見①Huang S.Q.,Ning Z.X.Extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum andits immune enhancement activity[J].1nt J Biol Macromol，2010，47 (3):336 ~341 ;
②Seto S.ff., Lam T.Y, Tam H.L., et al.Novel hypoglycemic effects of Ganodermalueidum water-extract in obese/diabetic(db/+db)mice[J].Phytomedicine,2009,
(16):426 ~436 ;③ Hikino H, Konno C, Mirin Y, et al.1solation and hypoglycemicactivity of ganoderans A and B, glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies[J].Planta Med，1985， (12):339 ~340)
[0003]靈芝(Ganoderma Iuccidum)別名芝草、瑞草,是真菌門,擔(dān)子菌亞門,層菌綱,非裙菌目，靈芝菌科，靈芝屬真菌，主要分布于亞洲、澳洲、非洲和美洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)，少數(shù)也分布于溫帶地區(qū)，地處北半球溫帶的歐洲僅有靈芝屬的4種，而北美洲大約5種。中國地跨熱帶至寒溫帶，靈芝科種類多而分布廣，是世界靈芝屬真菌物種多樣性最豐富的國家之一。傳統(tǒng)上，靈芝的獲取方式主要是人工栽培或野外采集，以子實(shí)體或孢子粉入藥。但人工栽培靈芝周期長、生產(chǎn)效率低、勞動強(qiáng)度大，又受季節(jié)、環(huán)境等限制，易遭病蟲害，質(zhì)量與產(chǎn)量不穩(wěn)定，而野外采集靈芝數(shù)量有限，難以滿足大生產(chǎn)要求。食用菌液體深層發(fā)酵技術(shù)，比傳統(tǒng)的子實(shí)體栽培法具有明顯的優(yōu)勢。為高效生產(chǎn)靈芝多糖，研究人員十分重視對促進(jìn)工業(yè)化生產(chǎn)的液體培養(yǎng)方法的研究，獲得了許多研究成果。組曉艷、曾曉希等對靈芝液態(tài)培養(yǎng)的條件進(jìn)行了研究，此類研究的主要內(nèi)容涉及生產(chǎn)菌種、培養(yǎng)基成分和發(fā)酵工藝參數(shù)，將降低生產(chǎn)成本以及提高多糖產(chǎn)量作為研究重點(diǎn)。其中多數(shù)工藝采用如淀粉、馬鈴薯、葡萄糖等作為培養(yǎng)基成分，即便利用到農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)品如米糠或者麩皮，也是將其作為次要成分，仍是以糧食類原料、葡萄糖、或其他原料為主要碳源和氮源。
[0004]中國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)副產(chǎn)品來源豐富。米糠、麩皮作為稻谷和小麥加工的副產(chǎn)物，不但其營養(yǎng)成分豐富，而且價(jià)格低廉。米糠中富含淀粉、纖維素等物質(zhì)，而麩皮富含蛋白、纖維素等物質(zhì)。從理論上講，米糠和麩皮復(fù)合已經(jīng)具備了靈芝生長所需要的碳源和氮源物質(zhì)。在靈芝自身纖維素酶及其他酶的作用下，靈芝可將米糠和麩皮轉(zhuǎn)化成自身的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長，生產(chǎn)靈芝多糖。因此，運(yùn)用米糠、麩皮等廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品，完全替代葡萄糖等靈芝液體發(fā)酵所需的營養(yǎng)物質(zhì)，生產(chǎn)具有輔助腫瘤治療的靈芝糖，對低端原料的高值化應(yīng)用具有重要意義，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0005]根據(jù)本專利發(fā)明人劉偉民課題組多年的研究經(jīng)驗(yàn)，一些食用菌菌株在不添加葡萄糖或者其他糧食類原料的米糠或麩皮液態(tài)培養(yǎng)基上生長狀況并不太理想，需要作特殊處理如菌種誘變以獲得良好的生長。例如，劉偉民指導(dǎo)多名碩士研究生對食用菌灰樹花液態(tài)發(fā)酵米糠或麩皮進(jìn)行過深入的研究，獲得了一些成果，形成如下文獻(xiàn):(I)楊鎖華.灰樹花發(fā)酵米糠制備多糖[D].碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué).2006 ； (2)顧慧敏.灰樹花在米糠培養(yǎng)基中液態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)多糖和富集有機(jī)硒的研究[D].碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué).2009 ；
(3)張建.物理法誘變灰樹花液體發(fā)酵米糠麩皮產(chǎn)多糖的研究[D].碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2010 ; (4)郭春梅.灰樹花的菌種誘變、液體發(fā)酵米糠麩皮產(chǎn)多糖及富硒研究[D].碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2011 ; (5)李永轉(zhuǎn).轉(zhuǎn)化米糠和麩皮高產(chǎn)多糖的灰樹花菌株誘變和已有菌的發(fā)酵試驗(yàn)[D].碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2012 ; (6)劉偉民，張建，郭春梅，等.用于米糠和麩皮復(fù)合原料生產(chǎn)多糖的灰樹花菌株[P] ,10579078.5，2010 ； (7)劉偉民，張建，郭春梅，等.使用米糠麩皮復(fù)合原料和灰樹花誘變菌株生產(chǎn)多糖的方法[P] ,1010579048.4，2010 ; (7)劉偉民，郭春梅，張建，等.用于發(fā)酵米糠和麩皮提取液生產(chǎn)灰樹花多糖的菌株[P], 10150888.3,2011(申請)；(8)李亞楠.灰樹花菌種誘變及發(fā)酵和產(chǎn)物性能研究[D].碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2013 (該論文
【公開日】期為2013年6月，與本專利的申請?zhí)峤荒暝孪嗤?；(9)趙莉.灰樹花在米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基中液態(tài)發(fā)酵富集錳的研究[D].碩士學(xué)位`論文.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2012 ; (10)劉麗麗.高值轉(zhuǎn)化米糠麩皮的靈芝液體發(fā)酵及菌種誘變[D].碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2012 ;(11)郭天龍.靈芝菌種誘變及液態(tài)發(fā)酵高值化轉(zhuǎn)化全米糠麩皮研究[D].碩士學(xué)位論文.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2013 (該論文
【公開日】期為2013年6月，與本專利的申請?zhí)峤荒暝孪嗤?。
[0006]由上述參考文獻(xiàn)可知，本專利發(fā)明人劉偉民一直圍繞米糠麩皮高效高值化轉(zhuǎn)化為珍稀食用菌多糖這一專題進(jìn)行研究，實(shí)現(xiàn)多個(gè)發(fā)明創(chuàng)造設(shè)想，并提出了用靈芝進(jìn)行米糠麩皮全料液體發(fā)酵，高效高值化轉(zhuǎn)化米糠麩皮為靈芝多糖的研究思路，對原始菌株加以誘變處理,在劉麗麗誘變試驗(yàn)不成功(為負(fù)誘變,見劉麗麗碩士論文p46對表5.2的分析，劉麗麗的碩士論文全部采用米糠麩皮過濾取汁作培養(yǎng)基，不是本發(fā)明的米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基)的基礎(chǔ)上，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，指導(dǎo)郭天龍進(jìn)行系統(tǒng)的研究，得到了正誘變菌株，并新提出了誘變菌株液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料，高效高值化轉(zhuǎn)化米糠麩皮為靈芝多糖的方法，形成了本發(fā)明專利和同時(shí)申報(bào)的另一個(gè)發(fā)明專利的內(nèi)容。郭天龍的碩士論文
【公開日】期為2013年6月，與本專利的申請?zhí)峤荒暝孪嗤挥绊懕景l(fā)明的新穎性。
[0007]本發(fā)明的關(guān)鍵問題之一為:在得到一種靈芝新菌株的基礎(chǔ)上，本發(fā)明將給出此新菌株在米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基上有效生長并高效轉(zhuǎn)化米糠麩皮全料為靈芝多糖的方法。新菌株的建立及新菌株對米糠麩皮的新利用方式都需要?jiǎng)?chuàng)新，適合于新靈芝菌株的米糠和麩皮組成液體培養(yǎng)基的配比及液態(tài)發(fā)酵的工藝條件均需新研究得出，還未見報(bào)道，因此本發(fā)明具有獨(dú)特、創(chuàng)新和實(shí)用性，具備發(fā)明專利的基本特征。
[0008]特別說明:本發(fā)明所述的米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基特指將米糠和麩皮作為培養(yǎng)基中唯一的碳源、氮源，不添加其他碳源、氮源，并且米糠、麩皮加水呈液態(tài)狀，不過濾，即全料加以利用。
[0009]與本發(fā)明同時(shí)提交的另一個(gè)發(fā)明專利給出了通過紫外微波并行誘變的方法，以高產(chǎn)靈芝多糖為指標(biāo)，定向高效轉(zhuǎn)化米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選育得到高產(chǎn)的靈芝新菌株靈芝 CCTCC M2013287 (Ganoderma lucidum CCTCC M 2013287)。本發(fā)明利用與本發(fā)明同時(shí)提交的另一個(gè)發(fā)明專利所得到的新的靈芝CCTCC M2013287，在米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵，生產(chǎn)靈芝多糖，由此得到一種新的靈芝多糖生產(chǎn)方法。誘變菌株靈芝CCTCC M2013287是新菌株，產(chǎn)糖特性發(fā)生變化，產(chǎn)量更高。將此新菌株用于米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基，形成新的米糠麩皮利用方法，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)靈芝多糖的目標(biāo)，未見有文獻(xiàn)報(bào)道本發(fā)明的靈芝多糖生產(chǎn)方法和水平。所以，本發(fā)明在采用新誘變菌株、實(shí)現(xiàn)米糠麩皮全料液態(tài)發(fā)酵高效高值化轉(zhuǎn)化利用、給出新的靈芝多糖制造方法(新菌株加不同的米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝)、米糠麩皮作為培養(yǎng)基的液態(tài)發(fā)酵所得靈芝多糖(培養(yǎng)基不同，靈芝代謝產(chǎn)物靈芝多糖分子組 成可不同)產(chǎn)量高等方面具有獨(dú)特性、創(chuàng)新性和實(shí)用性，奠定了本發(fā)明專利的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明為了降低生產(chǎn)成本，高效高值化轉(zhuǎn)化米糠和麩皮，高產(chǎn)具有增強(qiáng)免疫力、輔助腫瘤等功效的靈芝多糖，通過紫外微波并行誘變篩選出適合發(fā)酵米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基的高產(chǎn)靈芝新菌種，利用此新菌種實(shí)現(xiàn)高效高值化發(fā)酵轉(zhuǎn)化米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基高產(chǎn)靈芝多糖的方法。
[0011]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下，在米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基上，用誘變所得的靈芝菌株發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖的方法按照下述步驟進(jìn)行:(I)將米糠和麩皮加水121°c滅菌兼蒸煮30min ;(2)將米糠和麩皮全料作為碳源、氮源直接用于靈芝CCTCC M2013287發(fā)酵培養(yǎng)基，米糠使用量為l_5g/100mL，麩皮的使用量為1-4.5g/100mL，添加磷酸二氫鉀0.1-0.5g/100mL，硫酸鎂0.1-0.5g/100mL, pH自然，搖瓶裝料量40 %，發(fā)酵罐裝料量70-80 %，接種量8-10 %，培養(yǎng)溫度25-30 V，搖床轉(zhuǎn)速150_180r/min或發(fā)酵攪拌漿轉(zhuǎn)速50-70r/min,發(fā)酵時(shí)間4_7d ； (3)將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液；(4)發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。
[0012]本發(fā)明步驟(2)中使用的靈芝菌株靈芝JSU6161314已經(jīng)于2013年6月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，菌株保藏編號為編號為CCTCC M 2013287，名稱為靈芝 CCTCC M2013287(拉丁名稱:Ganoderma lucidum CCTCC M2013287)，該菌株的發(fā)明專利申請與本發(fā)明專利申請?zhí)峤蝗掌谙嗤?br> [0013]本發(fā)明步驟(2)中搖瓶時(shí)的裝料量為搖瓶容積的40%，接種量為裝料體積的10%，轉(zhuǎn)速 150-180r/min，培養(yǎng)時(shí)間為 4_7d。
[0014]本發(fā)明步驟(2)中上罐發(fā)酵時(shí)裝樣量為發(fā)酵罐容積的80%，上罐時(shí)通風(fēng)量為裝罐液體體積/min，培養(yǎng)溫度25-30°C，攪拌速率50_70r/min，上罐發(fā)酵4_7d。
[0015]本發(fā)明的有益效果
[0016]發(fā)明人由現(xiàn)有的靈芝CFCC6043出發(fā)，進(jìn)行紫外和微波并行誘變，以生長速率、菌絲干重和胞外多糖為指標(biāo)進(jìn)行篩選，最終獲得靈芝CCTCC M2013287,在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基中生產(chǎn)靈芝產(chǎn)多糖，與原始菌株靈芝CFCC6043相比產(chǎn)量更高，由微波誘變菌株所得菌株靈芝CCTCC M2013287上罐發(fā)酵時(shí)菌絲干重和菌絲多糖產(chǎn)率產(chǎn)量為6.3g/100mL培養(yǎng)基和0.203mg/100mL培養(yǎng)基，出發(fā)菌株靈芝CFCC6043菌絲干重和菌絲多糖產(chǎn)量為5.12g/100mL培養(yǎng)基和0.14mg/100mL培養(yǎng)基，誘變菌株靈芝CCTCC M2013287發(fā)酵的菌絲干重和菌絲多糖產(chǎn)率比出發(fā)菌株靈芝CFCC6043的菌絲干重和菌絲多糖產(chǎn)量分別增加了 23.0%和45%。所得菌株的發(fā)酵能力強(qiáng)，靈芝多糖產(chǎn)量增加顯著，具有顯著的獨(dú)特性和創(chuàng)造性特征，推動了該領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步，獲得了有益的技術(shù)效果。
[0017]發(fā)明人用所述的新菌株靈芝CCTCC M2013287液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料培養(yǎng)基，高效高值化轉(zhuǎn)化米糠麩皮為靈芝多糖，并獲得高產(chǎn)的靈芝多糖。將低值的米糠麩皮轉(zhuǎn)化成高值的具有多種保健功能的靈芝多糖，對降低生產(chǎn)成本、低端資源高效合理高值化利用、保護(hù)大眾健康，都具有有益的社會效果。
[0018]本發(fā)明之前的靈 芝液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)多糖多采用糧食類原料，米糠和麩皮作為輔料使用，用量少，過濾取汁使用方式使得米糠麩皮的使用效率低。本發(fā)明則將米糠麩皮全料加以應(yīng)用，并作為培養(yǎng)基的惟一碳源和氮源，獲得較高的靈芝多糖產(chǎn)量，說明本發(fā)明所提供的利用所述的新菌株進(jìn)行米糠麩皮全料液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖的方法先進(jìn)，經(jīng)濟(jì)效益高，獲得有益的經(jīng)濟(jì)效果。
[0019]綜上所述，本發(fā)明已經(jīng)具備了發(fā)明專利的獨(dú)特性、創(chuàng)造性和實(shí)用性，產(chǎn)生了發(fā)明專利應(yīng)該具備的技術(shù)、經(jīng)濟(jì)和社會的有益效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明所采用的菌株靈芝CCTCC M2013287紫外微波并行誘變選育流程圖。【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明提供靈芝CCTCC M2013287(已經(jīng)同時(shí)另行申請專利)，可以在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基上相對于原有的靈芝菌株具有高生長速率和高多糖產(chǎn)量；該靈芝菌株靈芝CCTCC M2013287已經(jīng)于2013年6月25日保藏在中國武漢的武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株編號為CCTCC M2013287，名稱為靈芝CCTCC M2013287(拉丁名稱為 Ganoderma lucidum CCTCC M2013287)。本發(fā)明提供了采用誘變得到的菌株在Ganoderma lucidum CCTCC M2013287米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基上生產(chǎn)靈芝多糖的生產(chǎn)方法。
[0022]在【具體實(shí)施方式】中，將米糠和麩皮加水121°C滅菌兼蒸煮30min，作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵。所述菌絲為菌絲混合少量原料的菌絲。
[0023]實(shí)施例一[0024]靈芝菌株采用誘變菌株靈芝CCTCC M2013287。發(fā)酵罐裝樣量為發(fā)酵罐容積的80%，培養(yǎng)溫度為28°C，通風(fēng)量1:0.8v/v/mim，攪拌速度60r/min，罐表壓0.05MPa，接種量8%，培養(yǎng)時(shí)間5d，發(fā)酵培養(yǎng)基為米糠5g/100mL，麩皮3g/100mL，磷酸二氫鉀0.15g/100mL,硫酸鎂0.lg/100mL, pH自然。加水至所需的體積，121°C滅菌兼蒸煮30min，作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重6.3g/100mL,胞外多糖為436.0mg/1OOmL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為203.0mg/1OOmL培養(yǎng)液。
[0025]實(shí)施例二
[0026]靈芝菌株采用誘變得到的靈芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量為2.0g/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為 2.5g/100mL 培養(yǎng)基，添加 KH2PO40.25g/100mL, MgSO40.35g/100mL,pH自然，加水至所需的體積，121°C滅菌兼蒸煮30min，作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，搖瓶裝樣量為40%，接種量為10%，培養(yǎng)溫度251:，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間7d。將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重3.51g/100mL，胞外多糖為263.3mg/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為92.7mg/100mL 培養(yǎng)液。
[0027]實(shí)施例三
[0028]靈芝菌株采用誘變得到的靈芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量為2.5g/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為 3.5g/100mL 培養(yǎng)基，添加 KH2PO40.5g/100mL, MgSO40.15g/100mL,pH自然，加水至所需的體積，121°C滅菌兼蒸煮30min，作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，搖瓶裝樣量為40%,接種量為10%，培養(yǎng)溫度28°C，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間4d。將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重4.92g/100mL，胞外多糖為357.6mg/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為138.3mg/100mL 培養(yǎng)液。
[0029]實(shí)施例四
[0030]靈芝菌株采用誘變得到的靈芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量為3.0g/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為 4.5g/100mL 培養(yǎng)基，添加 KH2PO40.20g/100mL, MgSO40.5g/100mL,pH自然，加水至所需的體積，121°C滅菌兼蒸煮30min，作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，搖瓶裝樣量為40%，接種量為10%，培養(yǎng)溫度261:，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間5d。將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重5.91g/100mL，胞外多糖為428.7mg/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為173.2mg/100mL 培養(yǎng)液。[0031]實(shí)施例五
[0032]靈芝菌株采用誘變得到的靈芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量為4.5g/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為 2.0g/100mL 培養(yǎng)基，添加 KH2PO40.40g/100mL, MgSO40.45g/100mL,pH自然，加水至所需的體積，121°C滅菌兼蒸煮30min，作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，搖瓶裝樣量為40%,接種量為10%，培養(yǎng)溫度280°C，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間7d。將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重4.92g/100mL，胞外多糖為324.3mg/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為149.7mg/1OOmL 培養(yǎng)液。
[0033]實(shí)施例六
[0034]靈芝菌株采用誘變得到的靈芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量為5.0g/100mL培養(yǎng)基，麩皮的使用量為 3.0g/100mL 培養(yǎng)基，添加 KH2PO40.10g/100mL, MgSO40.25g/100mL,pH自然，加水至所需的體積，121°C滅菌兼蒸煮30min，作為培養(yǎng)基用于發(fā)酵，搖瓶裝樣量為40%,接種量為10%，培養(yǎng)溫度30°C，轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時(shí)間6d。將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重6.0g/100mL,胞外多糖為416.6mg/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為179.5mg/100mL 培養(yǎng)液。
[0035]實(shí)施例七
[0036]靈芝菌株采用誘變菌株靈芝CCTCC M2013287。發(fā)酵罐裝樣量為發(fā)酵罐容積的80%，培養(yǎng)溫度為28°C，通風(fēng)量1:0.8v/v/mim，攪拌速度60r/min，罐表壓0.05MPa，接種量8%，培養(yǎng)時(shí)間5d，發(fā)酵培養(yǎng)基為米糠20g/L，麩皮25g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，硫酸鎂3.5g/L, pH自然。將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重3.34g/100mL，胞外多糖為241.3mg/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為123.8mg/100mL培養(yǎng)液。
[0037]實(shí)施例八
[0038]靈芝菌株采用誘變菌株靈芝CCTCC M2013287。發(fā)酵罐裝樣量為發(fā)酵罐容積的70 %，培養(yǎng)溫度為28 V，通風(fēng)量1:0.8v/v/mim,攪拌速度70r/min，罐表壓0.05MPa,接種量10 %，培養(yǎng)時(shí)間6d，發(fā)酵培養(yǎng)基為米糠30g/L，麩皮45g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L,硫酸鎂5.0g/L, pH自然。將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、 離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重5.7g/100mL，胞外多糖為400.4mg/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為192.9mg/100mL培養(yǎng)液。
[0039]實(shí)施例九[0040]靈芝菌株采用誘變菌株靈芝CCTCC M2013287。發(fā)酵罐裝樣量為發(fā)酵罐容積的80%，培養(yǎng)溫度為25°C，通風(fēng)量1:0.8v/v/mim,罐表壓0.05MPa,接種量10%，培養(yǎng)時(shí)間5d，發(fā)酵培養(yǎng)基為米糠45g/L，麩皮20g/L，磷酸二氫鉀4.0g/L,硫酸鎂4.5g/L，pH自然。將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重5.lg/100mL，胞外多糖為364.3mg/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為158.7mg/100mL培養(yǎng)液。
[0041]實(shí)施例十
[0042]靈芝菌株采用誘變菌株靈芝CCTCC M2013287。發(fā)酵罐裝樣量為發(fā)酵罐容積的70%，培養(yǎng)溫度為30°C，通風(fēng)量1:0.8v/v/mim，罐表壓0.05MPa，接種量10%，培養(yǎng)時(shí)間7d，發(fā)酵培養(yǎng)基為米糠50g/L，麩皮20g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂1.0g/L,pH自然。將液體培養(yǎng)所得的含少量的米糠麩皮的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水洗滌，菌絲體破壁后用70°C熱水浸提3h，過濾取清液。發(fā)酵物離心分離液或菌絲經(jīng)熱水浸提后的離心分離液，經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后分別得到胞外多糖和菌絲多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖和胞外多糖中的多糖含量。結(jié)果為菌絲干重5.3g/100mL，胞外多糖為377.4mg/100mL培養(yǎng)液，胞內(nèi)多糖為178.5mg/100m L培養(yǎng)液。
【權(quán)利要求】
1.一種靈芝誘變株液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料生產(chǎn)多糖的方法，其特征在于利用誘變得到的靈芝菌株，用米糠麩皮全料液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖，按照下述步驟進(jìn)行:(I)稱取原料米糠為l-5g/100mL，麩皮為1-4.5g/100mL,磷酸二氫鉀0.1-0.5g/100mL,硫酸鎂0.1-ο.5g/100mL(2)加所需的水后，裝料，pH自然，121°C滅菌兼蒸煮30min，冷卻后接入同時(shí)發(fā)明得到的靈芝CCTCC M2013287液體種子，進(jìn)行液體發(fā)酵；接種量8_10 %，發(fā)酵溫度25-30°C，發(fā)酵時(shí)間4-7d ;(3)將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后，用水清洗，得菌絲物；(4)菌絲破壁后用70°C熱水浸提3h，離心分離，取上清液脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后得到菌絲多糖；(5)發(fā)酵物過濾液經(jīng)脫蛋白、醇沉、離心分離、真空干燥后得到胞外多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靈芝誘變株液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料生產(chǎn)多糖的方法，其特征在于其中所使用的新誘變得到的菌株靈芝CCTCC M2013287(Ganoderma lucidum CCTCCM2013287)，該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏菌株編號為CCTCC M2013287。
3.權(quán)利要求1或2所述的一種靈芝誘變株液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料生產(chǎn)多糖的方法，其特征在于將米糠和麩皮全料加水作為液態(tài)培養(yǎng)基使用即全料使用。
4.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的一種靈芝誘變株液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料生產(chǎn)多糖的方法，其特征在于搖瓶發(fā)酵時(shí)，接種量8-10%，裝樣量為40 %，發(fā)酵溫度25-30°C，搖床轉(zhuǎn)速150-180r/min，發(fā)酵時(shí)間 4_7d。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靈芝誘變株液態(tài)發(fā)酵米糠麩皮全料生產(chǎn)多糖的方法，其特征在于上罐發(fā)酵時(shí)，接種量8-10%，裝樣量為70-80%，發(fā)酵溫度25-30°C，攪拌漿轉(zhuǎn)速50-70r/min，發(fā)酵時(shí)間 4_7d。
【文檔編號】C12N13/00GK103555786SQ201310275061
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】劉偉民, 沈國棟, 郭天龍, 周文彪, 張笑飛, 趙杰文, 馬海樂, 陳靜 申請人:江蘇大學(xué)