通過加強輔酶循環再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens 2，3-丁二醇產量的制作方法
【專利摘要】本發明從B.amyloliqefaciens?B10-127中克隆出參與2,3-丁二醇合成途徑中輔酶循環再生的關鍵酶基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(gapdh)和3-羥基-2-丁酮還原酶(acr)，并將該基因與穿梭表達質粒pMA5-HpaII連接，成功構建了攜帶基因gapdh和acr基因的穿梭表達質粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh，并轉入解淀粉芽孢桿菌B10-127中，獲得加強gapdh和acr基因表達的解淀粉芽孢桿菌pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh／B.amyloliquefaciens。原始菌株相比，重組菌2,3-丁二醇產量提高了14.7％，副產物如3-羥基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的積累分別降低65.6％、43.8％和42.4％，且發酵周期有所縮短。通過補料流加發酵，2,3-丁二醇產量達到121.3g／L。
【專利說明】通過加強輔酶循環再生速率提高Baci Ilusamy 1li quefac i ens 2，3-丁二酉孚產量
【技術領域】
[0001]通過加強輔酶循環再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇
產量，屬于基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]隨著能源資源的日益短缺和環境問題的日益嚴重，開發可再生的生物質資源為原料，經過化學、生物及其集成方法生產各種化學品、功能材料和能源物質的生物煉制技術越來越受到國內外的高度重視。2，3-丁二醇是重要的化工原料和液體燃料，廣泛應用于化工、食品、燃料及航空航天等領域。2，3- 丁二醇脫氫生成雙乙酰，是一種高價值食品風味劑，具有一定的抑菌效果；在脫氫酶的作用下，生成的3-羥基-2- 丁酮(乙偶姻)是一種應用廣泛的天然食用香料；脫水生成的甲乙酮可作為一種高價值的液體燃料添加劑，亦是重要的低沸點溶劑，應用于涂料、粘結劑、潤滑劑、燃料、油墨等行業；脫水生成的1，3_ 丁二烯可用于合成橡膠、ABS樹脂及SBS彈性體等；酯化產品是合成聚酯和聚氨酯的前體。而且2，3-丁二醇是一種極具價值的液體燃料，其燃燒值與甲醇(22.1kJ / g)、乙醇(29.0kJ / g)相當。由于2，3- 丁二醇的高辛烷值，它可作為汽油的辛烷值提升劑或航空燃料另外，2，3- 丁二醇及其衍生物亦可廣泛用于藥用載體、增塑劑、柔軟劑等的生產。
[0003]近年來用糖質原料發酵生產2，3_ 丁二醇取得了較好的實驗室研究結果，但生物法生產2，3- 丁二醇尚未實現工業化。目前報道的2，3- 丁二醇生產菌株多為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)腸桿菌屬(Enterobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)等，這些菌種具有潛在致病性，不符合符合工業化 安全生產的要求。因此，使用安全菌種利用葡萄糖發酵生產2，3-丁二醇具有良好的工業化前景。本發明人在前期研究中篩選得到一株安全菌株Bacillusamyloliquefaciens,該菌具有良好的2,3- 丁二醇生產潛力，但是發酵過程中積累較多的副產物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸等。葡萄糖代謝合成2，3- 丁二醇的過程也是一個氧化還原反應，該反應途徑中需要輔酶NADH和NAD+的參與。葡萄糖首先經過EMP途徑生產丙酮酸，此途徑中的關鍵酶3-磷酸甘油醛脫氫酶氧化3-磷酸甘油醛合成磷酸烯醇式丙酮酸，需要氧化型輔酶NAD+的參與；隨后丙酮酸經過三個關鍵酶催化合成2，3_ 丁二醇，而2，3-丁二醇的合成最后一步是乙偶姻還原酶催化還原乙偶姻合成2，3-丁二醇，此反應需要還原型輔酶NADH的參與。3-磷酸甘油醛脫氫酶和乙偶姻還原酶組成一個輔酶循環再生體系。為進一步提高該菌株2，3_ 丁二醇合成能力，并減少副產物的積累，發明人提出了一種通過加強輔酶循環再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇能力的方法。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種通過加強輔酶循環再生速率提高Bacillusamyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇能力的方法。[0005]本發明所使用菌種為Bacillus amyloliquefaciens B10-127 (已保藏于中國典型培養物保藏中心；保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學；保藏日期:2012年9月14日；保藏編號為:CCTCC NO:M2012349)。本發明首先從解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)B10-127中克隆出參與2, 3_ 丁二醇合成途徑中輔酶循環再生的關鍵酶基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(gapdh)和3-羥基-2-丁酮還原酶(acr)，并將該基因與穿梭表達質粒pMA5_HpaII連接，成功構建了攜帶基因gapA和acr基因的穿梭表達質粒pMA5-Hpa 11 -acr-Hap 11 -gap dh,并轉入解淀粉芽孢桿菌B10-127中，獲得加強gapdh和acr基因表達的解淀粉芽抱桿菌 pMA5-HpaI1-acr-HapI1-gapdh / B.amyloliquefaciens (重新命名為PAG)。并對原始菌及重組菌pAG進行2，3- 丁二醇發酵性能檢測，說明加強gapdh和acr基因的表達能夠提高2，3- 丁二醇產量，降低副產物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的積累。[0006]基于以上研究，對原始菌以及重組菌pAG進行發酵實驗，結果表明，與原始菌株相t匕，重組菌2，3- 丁二醇產量提高了 14.7%，副產物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的積累分別降低65.6%、43.8%和42.4%，且發酵周期有所縮短。為了進一步提高重組菌的發酵性能，我們采用補料流加，發酵48h，發酵液中2，3- 丁二醇積累量達到121.3g/L，這是現有技術所不能達到的結果。
[0007]本發明的有益效果:
[0008]本發明人所用菌株是一株安全菌株B.amyloliquefaciens,通過加強輔酶循環再生速率提高B.amyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇效率,并減少發酵過程中副產物如3-羥基-2-丁酮、乙酸、乳酸和丁二酸等的積累，這有利于提高生產效率，降低生產成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1 質粒 pMA5-HpaI1-acr_HapI1-gapdh 構建不意圖
[0010]圖2SDS-PAGE分析蛋白表達情況
【具體實施方式】
[0011]實施例1:目的基因的擴增及重組解淀粉芽孢桿菌的構建
[0012]質粒pMA5-HpaI1-acr_HapI1-gapdh構建示意圖如圖1所示,具體過程如下:
[0013]首先，以菌株B10-127的染色體DNA為模板，利用引物Pl和P2，通過PCR技術擴增得到一段901bp大小的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的acr基因，將純化后的acr基因經限制性內切酶NdeI和BamHI消化后，與同樣經過上述兩種限制性內切酶消化的質粒pMA5-HapII 連接(pMA5-HapII 序列如 SED ID NO:3 所示)，構建重組質粒 pMA5-HapII_acr，經雙酶切驗證后，表明該重組質粒構建成功。隨后，利用引物P3和P4通過PCR擴增得到核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示的基因gapdh，將純化后的acr基因經限制性內切酶MluI和BamHI消化后，與同樣經過上述兩種限制性內切酶消化的質粒pMA5_HapII連接，構建另一個重組載體pMA5-HapI1-gapdh ;然后以重組載體pMA5-HapI1-gapdh為模板，利用引物P4和P5通過PCR技術擴增出帶有啟動子HapII的基因片段HapI1-gapdh ;最后，將該基因片段通過限制性內切酶Mlu I處理后，與同樣經過Mlu I處理和去磷酸化處理的載體pMA5-HapI1-acr在T4DNA連接酶的作用下16°C過夜連接，將連接液轉化至大腸桿菌感受態E.coli JM109中，挑取陽性轉化子，提取轉化子中的質粒，經酶切驗證并確認重組質粒 pMA5-HapI1-acr_HapI1-gapdh 構建成功。將重組質粒 pMA5-HapI1-acr_HapI1-gapdh以電擊轉化的方法轉化至解淀粉芽孢桿菌，挑取陽性轉化子，即得到重組解淀粉芽孢桿菌pMA5-HpaI1-acr-HapI1-gapdh / B.amyloliquefaciens。對原始菌以及重組菌 pAG 胞內蛋白表達分析可以看出，基因gapdh和acr在重組菌pAG成功實現過量表達。
[0014]以B.amyloliquefaciens基因組總DNA為模板,設計兩條引物,PCR擴增引物設計如下:
[0015]Pl:5? -CGCATATGATGAAAGCGGCAAGATGGC-3’ (Nde I),
[0016]P2:5’ -CGGGATCCTTAATTCGGTTTTACTAAG-3’ (BamH I)。
[0017]P3:5， -CGGGATCCATGAAGGTAAAAGTAGC-3， (BamHI),
[0018]P4:5’ -CGACGCGTCTACACAGCTGACGGGTG-3’ (Mlu I),
[0019]P5:5’ -CGACGCGTTTTTGAGTGATCTTCTC-3’ (MluI)
[0020]實施例3:菌原始菌及重組菌的發酵性能驗證
[0021](I)種子培養
[0022]從活化平板上挑取單菌落接種于種子培養基中，種子培養溫度37°C，搖床轉速160r / min，培養時間為12h左右`，種子培養基組成:酵母提取物5g / L，胰蛋白胨IOg /L, NaCllOg / L0
[0023](2)發酵培養
[0024]初始發酵培養體積為2.5L，采用的發酵培養基成分如下:
[0025]發酵培養基成分:葡萄糖160g/L,玉米衆5g / L,尿素3g/L,檸檬酸鈉6g/L,K2HP044g / L，MgSO40.2g/L ;將上述發酵培養基用5mol / L的NaOH調節其pH至6.5，在121 °C下高溫滅菌30min。
[0026]發酵發酵條件:將上述培養好的種子液按4%接種量接種于發酵培養基中進行發酵培養，發酵溫度37°C，空氣流量為120m3 / h*m3培養基，攪拌轉速為350r / min。定時取樣測定細胞濃度、底物殘留量和3-羥基-2- 丁酮產量。發酵結束后，發酵液中產物2，3- 丁二醇和乙偶姻用氣相色譜測定(GC-1690J氣相色譜儀，杭州科曉化工儀器公司)。色譜條件如下:毛細管柱，30mX0.32mn色譜柱中固定液為AT.SE-30，，檢測器為FID，柱溫150°C，汽化室與檢測器的溫度均為250°C，載氣為N2，流速0.1Mpa,進樣量2 u L，采用外標法定量。利用液相色譜分析發酵液中有機酸含量。色譜條件:色譜柱為KC-811，流動相A為4mM高氯酸，流動相B為超純水，流動相梯度為0~7.5min25%~75% A，7.51~15min75% A，流動相流速為1.0mL / min，紫外檢測波長為210nn，進樣量為20iU，柱溫為60°C。結果如表I所示，與原始菌株相比，重組菌2，3- 丁二醇產量提高了 14.7%，副產物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的積累分別降低65.6%,43.8%和42.4%，且發酵周期有所縮短。
[0027](3)補料流加發酵培養
[0028]種子培養基發酵培養條件和實施例3(1)和3(2)相同，當發酵液中葡萄糖殘留濃度低于20g/L，通過補料泵一次性補加60-70g/L左右的葡萄糖，當葡萄糖消耗速率低于6g / L *h時停止補料，當殘留在發酵液中的葡萄糖被消耗完時結束發酵。通過補料流加發酵，2，3-丁二醇產量達到121.3g/L。
[0029]表1原始菌以及重組菌pAG發酵生產2，3- 丁二醇性能比較
【權利要求】
1.一種加強輔酶循環再生速率的重組解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens),其特征在于:將SEQ ID NO:1所示的3-羥基-2- 丁酮還原酶基因acr和SEQ ID NO:2所示的3-磷酸甘油醛脫羧酶基因gapdh共同克隆到穿梭載體pMA5-HpaII構建成為重組穿梭表達質粒pMA5-HpaI1-acr-HapI1-gapdh并轉化至保藏編號為CCTCC NO:M2012349的解淀粉芽孢桿菌中，從而提高解淀粉芽孢桿菌合成2，3- 丁二醇的能力。
2.將權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌用于2，3_丁二醇發酵上的應用，其特征是與原始的解淀粉芽孢桿菌相比，重組菌2，3_ 丁二醇產量提高了約14.7%，副產物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的積累分別降低65.6%、43.8%和42.4%，且發酵周期有所縮短。通過補料流加 發酵，2，3- 丁二醇產量達到121.3g/L。
【文檔編號】C12R1/07GK103602624SQ201310342415
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年8月8日 優先權日:2013年8月8日
【發明者】饒志明, 楊套偉, 張顯, 徐美娟, 滿在偉 申請人:江南大學