涉及三萜合成的酶的制作方法
【專利摘要】本發明公開了涉及三萜合成的酶。具體地，涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼由羧肽酶類蛋白、甲基轉移酶和葡糖基轉移酶組成的酶，所述酶涉及植物和種子中的β-香樹素衍生的三萜的生物合成。本發明也涉及重組DNA構建體的構建，所述構建體包含全部或部分本發明的分離多核苷酸，所述多核苷酸以有義或反義方向可操作地連接至少一個調控序列。
【專利說明】涉及三萜合成的酶
[0001]本申請是申請日為2007年6月25日的中國專利申請200780053491.4“涉及三萜合成的酶”的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及植物分子生物學領域。更具體地講，本發明涉及編碼植物和種子中^-香樹素衍生的三萜生物合成中涉及的酶的多核苷酸。本發明也包括轉基因植物，其中本發明多核苷酸的表達水平改變導致(6-香樹素衍生的三萜(包括皂苷)的水平或結構改變。
【背景技術】
[0003]萜類化合物也稱為類異戊二烯，它們組成了最大的天然產物家族，該類產物已有超過22，000種單獨化合物被描述。三萜或萜類化合物(半萜、單萜、倍半萜烯、二萜、三萜、四萜、聚異戊烯醇等)在植物中起到各種不同的功能，如激素、光合作用色素、電子載體、多糖組分調節劑、和膜結構組分。植物萜類化合物主要存在于樹脂、膠乳、蠟和油中。
[0004]三萜系化合物與多種植物特性相關，包括動物嗜食性、以及對病原體和掠食者的抗性。三萜主要儲存在植物根部，儲存形式為它們的配醣，皂苷(參見Price K.R.等人，1987，CRC Crit.Rev.Food Sc1.Nutr.26:27—133)。因此，例如，二倍體燕麥的突變體，黑燕麥，它缺乏主要的燕麥根皂苷，燕麥根皂苷A-1 (所謂的皂苷缺乏或“Sad”突變體)，已經證明缺乏疾病抗性(Papadopoulou K.等人，1999, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.96: 12923一12928)。這些突變體更易于受到許多不同的根感染真菌的侵害，包括小麥全蝕病菌，它對燕麥來說通常是非致病的。遺傳分析表明疾病易感性提高和燕麥根皂苷水平降低有因果關系。此外，當接種小麥全蝕病菌時,燕麥根皂苷水平降低的sad突變體(約為野生型水平的15% )與其它完全缺乏燕麥根皂苷的突變體相比僅有有限的疾病癥狀，這進一步將燕麥根皂苷水平和疾病抗性聯系起來。
[0005]有累積的數據表明飲食中的皂苷可能是有益的(參見例如Shi，J.A.等人(2004)J.Med.Food7:67-78 和 Vis, E.H.等人(2005)Nutr.Cancer 51:37-44)。同樣的，已經證明大豆膳食皂苷對預防大鼠血膽脂醇過多和動脈粥樣硬化有益(Oakenfull等人(1984)，Nutr.Rep.1nt.29:1039—1046)。因為皂苷在從大豆到大豆分離物的過程中僅有輕微損失,大豆中的皂苷水平提高將導致分離物中的皂苷水平提高(Berhow，M.A.等人(2002)Phytochem.Anal.13:343— 348 ；Hu J.等人(2002)，J.Agric.Food Chem.50:2587-2594)。因此提高大豆中的皂苷水平將是提高人類飲食中皂苷量的有效方法。此外，皂苷水平的提高可為藥物開發中使用的化合物提供來源。
[0006]三萜以及留醇經由類異戊二烯途徑合成。在此途徑中，兩分子的焦磷酸法尼酯頭-頭相連形成角鯊烯，這是一種三萜。角鯊烯然后轉化為2，3-環氧角鯊烯。多種環氧角鯊烯環化酶催化2，3-環氧角鯊烯環化形成多種多環骨架，包括一種或多種環阿屯醇、羊毛甾醇、羽扇豆醇、 異復合精油醇(isomultif1renol)(—種三職化合物)、^ -香樹素、a _香樹素、和擬南芥醇(thalianol)(—種三萜化合物)。該由環氧角鯊烯環化酶催化的環化事件在留醇和三萜皂苷生物合成途徑之間形成形成分枝點。多種環氧角鯊烯環化酶是進化相關的(Kushiro, T.等人(1998)，Eur.J.Biochem.256 =238-244)并產生多種三環、四環、和五環結構，該結構能進行進一步修飾。
[0007]三萜系化合物皂苷經由類異戊二烯途徑，通過環化2，3-環氧角鯊烯形成五環三萜系化合物，主要是齊墩果烷-香樹素)或達瑪烷骨架合成。三萜系化合物主鏈隨后經受多種修飾(氧化、取代、和糖基化)，所述修飾由細胞色素P450依賴型單氧酶、糖基轉移酶(GT)、和其它酶介導。通常關于皂苷生物合成中涉及的酶和生物化學途徑了解的不多。盡管在此類重要的天然產物中存在可觀的商業利益，產生此重要的植物次級代謝產物家族所需的遺傳機制很大程度上仍然是未知的。這可能是部分由于分子的復雜性以及缺乏用于生物化學研究的途徑中間體。然而，目前已經了解了在皂苷生物合成中的第一個關鍵步驟，它通過環氧角鯊烯環化酶(6-香樹素合酶(Sadl基因的產物)進行，最近已經克隆了該基因并描述了其特征(Haralampidis K.等人，2001, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.98:13431一13436)。另一個關鍵步驟由細胞色素P450酶AsCYP51H10介導(由Sad2基因編碼)，最近已經受到研究(Qi X.等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A103:18848-18853) oAsCYP51H10(SAD2)是燕麥根皂苷合成所需要的。AsCYP51H10的精確生物化學功能是未知的。然而Sad2突變體積累P -香樹素，因此AsCYP51H10可能是在一個或多個位點(C12、C13、C16、C21和/或C30)氧化P -香樹素(或其衍生物)所必需的(圖1)。
[0008]結構比較(圖1)預測除細胞色素P450之外的其它類的酶也將是把P -香樹素轉化成燕麥根皂苷A-1所需要的。這些酶包括糖基轉移酶(GT)、酰基轉移酶、和甲基轉移酶(MT)。糖基轉移酶屬于一個大的酶家族，該家族的酶將糖單元從活化供體分子轉移到廣譜潛在受體分子上。潛在受體包括蛋白質、脂質、多糖和小分子，它們可涉及各種不同的細胞過程如細胞壁合成和信號轉導(Coutinho PM等人，2003，J.Mol.Biol.，328:307-317)。在具有代表性的跨越全部區域的七`十七個GT家族中，GT家族I是其中最大的一個(CoutinhoPM 和 Henrissat B, 1999:Carbohydrate active enzymes website http: / / afmb.cnrs-mrs.fr / CAZY / )家族I由經由糖轉移的反轉催化機制運作的GT組成,通常作用于低分子量受體分子(Vogt T 和 Jones P，2000，Trends Plant Sc1.5:380-386 ；Lim E-K和Bowles DJ, 2004,EMBO J23:2915-2922)。通過與其它糖基化小分子的類比，預測燕麥根皂苷A-1的支鏈化糖鏈通過連續將糖單位加到糖苷配基組分上合成，最可能的通過三個不同的糖基轉移酶(GT)活性合成。糖基化的第一個步驟涉及將L-阿拉伯糖加到糖苷配基的C3羥基上，由阿糖胞苷轉移酶介導。此后加入兩個D-葡萄糖分子，一個在阿拉伯糖的C2位點，另一個在C4位點，由一個(或可能兩個)葡糖基轉移酶介導(Townsend B等人,2006,Phytochemistry Revs.5: 109—114)。
[0009]酰基是植物來源的天然產物的常見部分，并能改變它們的化學和物理特性。因此可能影響天然產物在生態相互作用中的生物效應，并影響其它關鍵過程如亞細胞交換和螯合作用(例如通過作用于液泡攝入或駐留標記)。最近已經發現了一類新的植物酰基轉移酶。這些酶-絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶-與肽酶具有同源性，但缺乏肽酶活性，相反能夠酸化天然產物(Milkowski C&Strack D, (2003), Phytochemistry65:517 ；Fraser CM 等人(2005)Plant Physi0l0gyl38:1136)。雖然其它植物酰基轉移酶一般使用輔酶硫酯作為酰基供體，這些SCPL使用酰基葡萄糖供體。SCPL酰基轉移酶家族的特征描述最佳的成員是番茄酶GAC-Lp，該酶催化葡萄糖聚酯的形成，所述葡萄糖聚酯有助于野生番茄中的昆蟲抗性(Li AX&Steffens JC，2000，PNAS97:6902);擬南芥酶SNGl，它是合成苯基丙酸類芥子酰蘋果酸酯(一種UV保護劑)所必需的(Landry LG等人，1995, Plant Physiologyl09:1159 ;LehfeIdt C 等人，2000，Plant Celll2:1295);第二擬南芥酶 SNG2，它涉及合成種子中的芥子酰膽堿(Shirley AM等人，2001，Plant J28:83);和甘藍型油菜酰基轉移酶BnSCT,它催化芥子酸酯的形成，該酯與苦味、收斂性和種子油萃取問題有關(Milkowski C等人，2004, Plant J.38:80 ；Baumert A 等人，2005, Phytochemistry66:1334)。雖然在這些修飾中涉及的酶和基因仍未能了解其特征，許多其它重要的植物來源的天然產物通過生物化學分析已知如何通過葡萄糖-酯-依賴性的酰基轉移酶反應進行制備。實例包括在甘薯(Ipomoea batatas)中的抗氧化劑綠原酸、在野生胡蘿卜(Daucus carota)中的花青苷、在橡樹(Quercus robur)中的沒食子單寧酸和在蕓苔(Milkowski C&Strack D(2003)Phytochemistry65:517 ；Fraser CM 等人(2005)Plant Physiologyl38:1136)中的芥子酰-和苯甲酰-酯化的芥子油苷。有四種不同的結構相關的燕麥根皂苷[14]。燕麥根皂苷A-1 (存在于燕麥根部的主要燕麥根皂苷)和B-1用N-甲基鄰氨基苯甲酸進行酰化，而燕麥根阜苷A-2和B-2用苯甲酸進行酸化(Hostettmann K和Marston A, 1995, Saponins,Cambridge University Press, Cambridge, UK)。
[0010]s-腺苷-L-甲硫氨酸-依賴性的甲基轉移酶涉及許多植物天然產物的0-甲基化(Frick S.等人,2001,Phytochemistry56:1—4)。這些酶在木質素前體和其它植物防御所需的化合物合成中起到重要作用(Gang DR等人，2002，Plant Celll4:505— 519。

【發明內容】

[0011]本發明涉及編碼三萜合成中涉及的酶的分離多核苷酸。具體地講，本發明涉及編碼新的絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、新的甲基轉移酶、和新的葡糖基轉移酶家族I的分離多核苷酸。這些分離自黑燕`麥的新酶稱為AsSCPLI (絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶)、AsMTl (甲基轉移酶)和AsGT2 (葡糖基轉移酶)。
[0012]編碼負責多種谷物中三萜合成的酶的基因鑒定將允許它們的操縱。三萜合成操縱將引起三萜皂苷水平或結構的改變。皂苷產量的提高將引起植物抗害蟲能力的提高。來源于具有高三萜水平的植物的食物被認為具有降低膽固醇的效應，然而三萜水平降低據信會使得食物具有更好的風味。因此，具有改變的三萜水平的轉基因植物可對害蟲產生抗性，而用三萜水平或結構發生改變的種子制備的食物將具有提高的營養價值或更好的風味。
[0013]在另一個實施方案中，本發明涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨基酸序列當與SEQ ID N0:2比較時，基于Clustal V比對方法具有至少95%的序列同一性；或編碼甲基轉移酶多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨基酸序列當與SEQ ID NO:4比較時，基于Clustal V比對方法具有至少95%的序列同一性；或編碼葡糖基轉移酶的核苷酸序列，所述酶的氨基酸序列當與SEQID NO:6比較時，基于Clustal V比對方法具有至少95%的序列同一性；或包含(a)、(b)或(C)的全長互補序列的核苷酸序列。
[0014]在另一個實施方案中，本發明涉及包含本發明分離多核苷酸的載體。[0015]在另一個實施方案中，本發明涉及重組DNA構建體，該構建體包含編碼三萜途徑的第一種酶的本發明的多核苷酸的至少一部分，所述部分可操作地連接至少一種調控序列上。
[0016]在另一個實施方案中，本發明涉及重組DNA構建體，該構建體包含編碼三萜途徑的第一種酶的本發明的多核苷酸的至少一部分，所述部分可操作地連接至少一種調控序列上，還包含至少第二多核苷酸的至少一部分，所述第二多核苷酸編碼調節三萜途徑至少第二種酶的表達的多肽。
[0017]在另一個實施方案中，本發明涉及包含本發明的重組DNA構建體的分離宿主細胞。該宿主細胞可以是酵母細胞、細菌細胞、或植物細胞。
[0018]本發明也包括包括植物和植物部分的組合物，所述組合物包含本發明的分離多肽或多核苷酸。本發明也包括轉化過的植物，所述植物來源于高等植物和種子或谷物的轉化過的宿主細胞，它們來源于此類轉化過的植物。此類轉基因植物包括那些具有水平改變的^ -香樹素衍生的三萜、或具有改性三萜的植物。
[0019]在另一個實施方案中，本發明涉及包含本發明重組體的轉基因植物，其中調節序列是異源啟動子，其中轉基因植物當與野生型植物的三萜水平相比時具有改變的三萜水平。
[0020]本發明也涉及改變植物細胞中多肽表達水平的方法，所述方法包括:用來自至少一部分本發明的分離多核苷酸的核酸片段轉化植物組織，其中所述多核苷酸能夠改變天然絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶；將所述植物組織再生到轉基因植物中；并評估當與具有對應的天然絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的野生型表達水平的植物比較時，所述轉基因植物的絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的表達水平改變。
[0021]本發明也涉及產生對至少一種真菌具有抗性的植物的方法，所述方法包括:用至少一個本發明編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未受所述重組DNA構建體轉化過的植物比較時，對至少一種真菌的抗性提高情況。重組構建體還可包含至少一個第二多核苷酸，所述多核苷酸編碼調節三萜途徑至少一個第二種酶表達的多肽，期望該多核苷酸包括但不限于本發明的多核苷酸以及編碼途徑中前兩個步驟的酶的核苷酸序列，所述酶為環氧角鯊烯環化酶(6-香樹素合酶(Sadl基因的產物；Haralampidis K.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.98:13431—13436)和 /或細胞色素 P450 酶 CYP51H10 (由 Sad2 基因編碼；Qi X.等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.103:18848—18853)。
[0022]本發明也涉及生產具有改變水平的絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的植物的方法，所述方法包括:用至少一種權利要求5所述的編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的量比較時，步驟(b)的轉基因植物的絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的表達水平改變。
[0023]本發明也涉及用于生產具有改變的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括:用至少一個本發明編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平變化。重組構建體還可包含至少一個第二多核苷酸的至少一部分，所述多核苷酸編碼調節三萜途徑中至少一個第二種酶表達的多肽，期望該多核苷酸包括但不限于本發明的多核苷酸(酰基轉移酶、甲基轉移酶和葡糖基轉移酶)、Sadl和Sad2。
[0024]本發明也涉及用于生產具有提高的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括:用至少一種權利要求5的編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平提高。重組構建體還可包含至少一個第二多核苷酸，所述多核苷酸編碼調節三萜途徑中至少一個第二種酶表達的多肽，期望該多核苷酸包括但不限于本發明的多核苷酸(酰基轉移酶、甲基轉移酶和葡糖基轉移酶)、Sadl和Sad2。
[0025]本發明也涉及用于生產具有降低的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括:用至少一個本發明編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平降低。重組構建體還可包含至少一個第二多核苷酸的至少一部分，所述多核苷酸編碼調節三萜途徑中至少一個第二種酶表達的多肽，期望該多核苷酸包括但不限于本發明的多核苷酸(酰基轉移酶、甲基轉移酶和葡糖基轉移酶)、Sadl和Sad2。
[0026]本發明也包括來自本發明轉基因植物的谷物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]根據以下的詳細描述和附圖以及序列清單，可以更全面地理解本發明，以下的詳細描述和附圖以及序列清單形成本申請的一部分。
[0028]圖1圖示了 P -香樹素和燕麥根皂苷A-1的結構，說明必然發生了多個修飾以從前者衍生出后者。
[0029]圖2圖示了一個317kb的基因組DNA序列，該序列包含五個來自黑燕麥的預測的生物合成酶的基因((6-香樹素合酶(Sadi)、細胞色素P450CYP51H10(Sad2)、t、絲氨酸羧肽酶樣蛋白AsSCPL1、甲基轉移酶AsMTl和葡糖基轉移酶AsGT2。
[0030]圖3對五個預測的生物合成酶的Northern印跡分析(P -香樹素合酶(SADl)、細胞色素P450CYP51H10(SAD2)、絲氨酸羧肽酶樣蛋白AsSCPLl、甲基轉移酶AsMTl、葡糖基轉移酶AsGT2和GAPDH對照)，所述酶位于燕麥的根芽、葉和花組織中。
[0031]序列描述概要說明了后附的序列列表。此序列列表中以單個字母表示核苷酸，以單獨的3字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Researchl3:3021— 3030 (1985)和Biochemical Journal219 (2):345— 373 (1984)所描述的 IUPAC — IUB 標準中所規定的。
[0032]SEQ ID NO:1是編碼來自黑燕麥(AsSCPLl)的絲氨酸羧肽酶樣多肽的cDNA核苷酸序列。
[0033]SEQ ID NO:2是衍生自SEQ ID NO:1中顯示的cDNA片段或SEQ ID NO:7中顯示的基因組片段的AsSCPLI氨基酸序列。
[0034]SEQ ID NO:3是編碼來自黑燕麥(AsMTl)的酰基甲基轉移酶的cDNA核苷酸序列。
[0035]SEQ ID NO:4是衍生自SEQ ID NO:3中顯示的cDNA片段或SEQ ID NO:8中顯示的基因組片段的AsMTl氨基酸序列。
[0036]SEQ ID NO:5是編碼來自黑燕麥(AsGT2)的葡糖基轉移酶的cDNA核苷酸序列。
[0037]SEQ ID NO:6是衍生自SEQ ID NO:5中顯示的cDNA片段或SEQ ID NO:9中顯示的基因組片段的AsGT2氨基酸序列。
[0038]SEQ ID NO:7是編碼AsSCPLI多肽的基因組片段的核苷酸序列。
[0039]SEQ ID NO:8是編碼AsMTl的基因組片段的核苷酸序列。
[0040]SEQ ID NO:9是編碼AsGT2的基因組片段的核苷酸序列。
【具體實施方式】
[0041]本文中所列出的每篇參考文獻的公開內容均全文以引用方式并入本文。
[0042]如本文所用的并在所附的權利要求書中的單數形式“一個”和“所述”包括復數涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵義包括多株此類植物，“一個細胞”的涵義包括一個或多個細胞及其本領域的技術人員已知的等同物，等等。
[0043]在此公開的上下文中使用了許多術語和縮寫。給出了如下定義。
`[0044]“開放閱讀框”縮寫為0RF。
[0045]“聚合酶鏈反應”縮寫為PCR。
[0046]代謝途徑或生物合成途徑在生物化學意義上可以認為是發生于細胞內由酶催化的一系列化學反應，用以實現待細胞使用的或待細胞貯存的代謝產物的形成，或啟動另一代謝途徑(因而稱作流量產生步驟)。很多此類途徑都很精細，并涉及對起始物質的逐步修飾以使之形成具有期望的精確化學結構的產物。
[0047]本文所用的“核酸”意指多核苷酸，并包括單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基聚合物。核酸也可以包括片段和經修飾的核苷酸。因此，術語“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用，并且是作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)可以用如下它們的單字母名稱指代:“A”表示腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別針對RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，“N”表示任何核苷酸。
[0048]術語“分離的”多核苷酸是一種已經被大體上分開或從其中天然產生多核苷酸的生物中通過常規的核酸純化方法純化的其它多核苷酸，即，其它染色體和染色體外的DNA及RNA。該術語也涵蓋重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。本發明的分離多核苷酸可包括全部或部分分離多核苷酸，例如包含選自以下核苷酸序列的多核苷酸:SEQ ID NO=USEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 或此類核苷酸序列的全長互補序列。
[0049]三萜系化合物皂苷經由類異戊二烯途徑，通過環化2，3-環氧角鯊烯形成五環三萜系化合物，主要是齊墩果烷-香樹素)或達瑪烷骨架合成。三萜系化合物主鏈隨后經受多種修飾，包括氧化、酰基化、甲基化、糖基化和其它取代，所述修飾由細胞色素P450依賴型單氧酶、糖基轉移酶、酰基轉移酶、甲基轉移酶和其它酶介導。
[0050]三萜，也稱為三萜系化合物，包括但不限于皂苷和甾醇。
[0051]“皂苷”指植物中天然積累的環化三萜的配醣綴合物。環化三萜包括但不限于羊毛留醇、環阿屯醇、P _香樹素、a -香樹素、羽扇豆醇、isomultifiorenol、和thalianol。“三萜皂苷”指環化三萜的配糖綴合物，除了那些來源于羊毛留醇或環阿屯醇之外的三萜。“甾族皂苷”指來源于羊毛留醇或環阿屯醇配醣綴合物。皂草精醇是經由體外酸水解獲取的三萜皂苷，對它們的測量為從中提取皂苷的組織中存在的三萜皂苷的量提供了一個相對值。 [0052]三萜皂苷的水平可通過測量造成皂草精醇進行測定。皂草精醇的測量值直接關聯于三萜皂苷的水平。皂草精醇是經由體外酸水解獲取的三萜皂苷，對它們的測量為從中提取皂苷的組織中存在的三萜皂苷的量提供了一個相對值，該值直接關聯于三萜皂苷的量。
[0053]三萜皂苷水平可使用本領域已知的技術進行測量。例如，可使用具有光散射檢測器的 HPLC-MS 或 HPLC 進行測量(參見例如 Rupasinghe, H.P.等人，(2003)，J.Agr1.FoodChem.51 =5888-5894)。作為另外一種選擇，可使用具有UV檢測器的HPLC進行測量(HubertJ 等人，(2005), J.Agric.Food Chem.53:3923-3930)。其它方法包括使用 GC-FAB。(參見例如Gee等人，(1993)，J Sci Food Agric.63 =201-209)。其它方法涉及使用薄層色譜法(TLC)結合密度計量學分離皂苷(參見例如Oleszek WA.(2002) J.Chromatogr.A967:147-162.；Gurfinkel DMjPRao AV (2002) J.Agric.Food Chem.50:426-430。
[0054]使用其它方法測量三萜皂苷也是可能的。例如，使用多種免疫測定方法(例如放射性免疫測定或ELISA)也是合適的(Wang CC, Prasain JK，和Barnes S.(2002)J.Chromatogr.B Analyt.Technol.Biomed.Life Sc1.777:3-28, Ahamed A 等人，(2003),Biochem.Biophys.Res.Commun.302:587-592)。
[0055]“提高的三萜皂苷水平，”對于本發明而言指三萜皂苷水平高于那些存在于相同物種的非轉化植物中的三萜皂苷水平，水平提高是由于轉化了本發明的核酸片段。例如，“提高的三萜皂苷水平，”可以指三萜皂苷水平高于那些存在于相同物種植物中的三萜皂苷水平，該植物不具有本發明的包含編碼環氧角鯊烯環化酶的多核苷酸的重組DNA分子。“提高的三職阜苷水平”可以是提高至少IOOppm, 250ppm, 500ppm, 750ppm, 1000ppm, 1250ppm,1500ppm, 3000ppm, 6000,或任何它們的整數。
[0056]“改變的水平”或“改變的表達”指轉基因生物中產生的基因產物的量或比例不同于正常生物或非轉化生物。
[0057]“改變的三萜皂苷水平，”對于本發明而言指三萜皂苷水平的量或比例不同于那些存在于相同物種的沒有轉化本發明的核酸片段的非轉化植物中的三萜皂苷水平。
[0058]“降低的三萜皂苷水平，”對于本發明而言指三萜皂苷水平低于那些存在于相同物種的沒有轉化本發明的核酸片段的非轉化植物中的三萜皂苷水平。
[0059]術語“具有相當功能的亞片段”和“功能上相當的亞片段”在本文中可互換使用。這些術語是指分離的核酸片段的一個部分或亞序列，其中無論所述片段或亞片段是否編碼有活性的酶，其都保留著改變基因表達或導致某種表型的能力。例如，所述片段或亞片段可以被用于設計嵌合基因，以在轉化后的植物中產生所期望的表型。可以通過將核酸片段或亞片段以相對于植物啟動子序列有義或反義的方向與所屬啟動子序列連接，從而設計出用于抑制的嵌合基因，其中所述核酸片段或亞片段無論是否編碼有活性的酶均可。
[0060]術語“保守結構域”或“基序”指進化上相關的蛋白質的比對序列中在特定位置保守的一組氨基酸。雖然同源蛋白質之間在其它位置的氨基酸可以發生變化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示對蛋白質的結構、穩定性或活性來說是必需的氨基酸。因為它們可通過它們在蛋白質同源物家族的比對序列中的高度保守來鑒定，所以它們可用作識別標記或“簽名”來確定具有新的測定序列的蛋白質是否屬于以前鑒定的蛋白質家族。
[0061]術語“同源性”、“同源的”、“大體上類似的”和“大體上對應的”在本文中可互換使用。它們指其中一個或多個核苷酸堿基的變化不會影響核酸片段介導基因表達或產生某種表型的能力的核酸片段。這些術語也指本發明的核酸片段的修飾(例如缺失或插入一個或多個核苷酸)，相對于初始的未經修飾的核酸片段，基本上不會改變所得核酸片段的功能特性。因此，正如本領域技術人員應該理解的，本發明不僅僅涵蓋這些具體的示例性序列。[0062]此外，技術人員認識到，本發明所涵蓋的大體上類似的核苷酸序列也由它們在中等嚴格條件(如0.5X SSC, 0.1% SDS, 600C )下，與本文所示例的序列雜交的能力，或雜交至本文所公開的核苷酸序列的任何部分以及雜交至與本文所公開的任何核苷酸序列功能相當的序列的能力所限定。可以調節嚴格性條件以篩選中度相似的片段例如來自遠緣生物的同源序列，到篩選高度相似的片段例如從近緣生物復制功能性酶的基因。雜交后的洗滌確定嚴格性條件。
[0063]術語“選擇性雜交”包括指在嚴格雜交條件下，核酸序列與特定核酸靶序列以比其與非靶核酸序列的雜交更高的可檢測程度(例如至少2倍于背景)雜交，并指基本排除了非靶核酸。選擇性雜交的序列通常彼此具有約至少80%的序列同一性，或90%的序列同一性，最多并包括100%的序列同一性(即完全互補)。
[0064]術語“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”包括指探針將選擇性雜交至其靶序列的條件。嚴格條件是序列依賴性的并將因不同的環境而異。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑒定與探針100%互補的靶序列(同源探測)。作為另一種選擇，可調節嚴格條件以允許序列中的一些錯配，以便檢測到更低程度的相似性(異源探測)。通常，探針的長度少于約1000個核苷酸,任選長度少于500個核苷酸。
[0065]通常，嚴格條件將是如下那些條件:在pH7.0至8.3下鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，并且對于短探針(例如10至50個核苷酸)溫度為至少約30°C，而對于長的探針(例如多于50個核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴格條件也可以通過加入諸如甲酰胺之類的去穩定劑來實現。示例性的低嚴格條件包括在37°C于含有30至35%甲酰胺、IM NaCl、l% SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液中雜交，以及在50至55°C用IX至2X SSC (20X SSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)洗滌。示例性的中等嚴格條件包括在37°C于40至45%甲酰胺、IM NaClU % SDS中雜交，以及在55至60°C下用0.5X至IX SSC洗滌。示例性的高嚴格條件包括在37°C于50%甲酰胺、IM NaCl、I % SDS中雜交，以及在60至65°C用0.1X SSC洗滌。
[0066]特異性通常取決于雜交后洗滌，最后的洗滌溶液的離子強度和溫度是關鍵因素。對于 DNA-DNA 雜交體，Tni 可以用 Meinkoth 等人，Anal.Biochem.138:267-284(1984) =T111 =81.5°C +16.6 (log M) +0.41(% GC) -0.61(% form) -500/L ;其中 M 是單價陽離子的體積摩爾濃度，％ GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以堿基對表示的雜交體的長度。^是(在確定的離子強度和pH下)50%的互補靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。每出現1%的錯配，Tffl降低約1°C ;因此，可調節Tm雜交和/或洗滌條件以與具有期望同一性的序列雜交。例如，如果要尋求具有>90%同一性的序列，則可將Tm降低10°C。通常，在確定的離子強度和pH下，嚴格條件選擇為比特定序列及其互補序列的熔解溫度CU低約5°C。然而，極嚴格條件可采用在比熔解溫度(Tffl)低1、2、3或4°C的溫度下雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可采用在比熔解溫度(Tm)低6、7、8、9或10°C的溫度下雜交和/或洗滌；低嚴格條件可采用在比熔解溫度(Tm)低11、12、13、14、15或20°C溫度下雜交和/或洗滌。利用所述等式、雜交和洗滌組合物以及理想的Tm，本領域技術人員將會理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的變化已經在本質上得以描述。如果所需的錯配程度導致Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優選增加SSC的濃度以便能使用更高的溫度。對核酸雜交的詳盡指導可在以下文獻中找到=Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization withNucleic Acid Probes,第 I 部分，第 2章“Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assays，，, Elsevier, New York (1993);以及CurrentProtocols in Molecular Biology,第 2 章，Ausubel 等人編輯，Greene Publishing andffiley-1nterscience, New York (1995)。雜交和 / 或洗漆條件可進行至少 10、30、60、90、120或240分鐘。
[0067]在核酸或多肽序列上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指兩序列中的核酸堿基或氨基酸殘基當在指定比較窗口中比對最大匹配時是相同的。
[0068]因此，“序列一致性百分比”是指通過在一個比對窗口上比較兩段最大化匹配的序列所決定的值，其中在所述比對窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分與(不包含附加或缺失)的參考序列相比可以包含附加或缺失(即間隙)，以獲得兩段序列之間的最大匹配。所述百分比的計算方法是，統計相同的核酸堿基或氨基酸殘基在兩段序列中同時出現的位點的數量以得到匹配位點數，`將此匹配位點數除以比對窗口中的總位點數，再將結果乘以100，從而得到序列一致性百分比。序列一致性百分比的可用的例子包括但不限于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%和 95%，或者從 50%至 100% 的任意整數百分比。上述一致性可以利用本文所述的任意程序來確定。
[0069]序列對比和百分比同一性或類似性可以用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來確定，這些方法包括(但不限于)LASERGENE生物信息計算包(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的MegAlig?程序。在本專利申請案的上下文中應當理解，使用序列分析軟件進行分析時，除非另外指明，否則分析結果將基于所參考程序的“默認值”。在此所用的“默認值”是指在首次初始化軟件時軟件最初加載的任何值或參數集。
[0070]“Clustal V 比對方法”對應于稱為 Clustal V(在 Higgins 和 Sharp, CAB10S，5:151-153(1989) ；Higgins, D.G.等人(1992)Comput.Appl.Biosc1.8:189-191)，并存在于LASERGENE 生物信息學計算軟件包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的 MegAlign? 程序中。對于多重比對，默認值對應于缺口罰分(GAP PENALTY) =10和缺口長度罰分(GAP LENGTHPENALTY) =IO0用Clustal方法進行成對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默認參數為KTUPLE=U空位罰分=3、窗口(WINDOW) =5和DIAGONALS SAVED=5。而對于核酸，這些參數為KTUPLE=2，空位罰分=5，窗口 =4和DIAGONALS SAVED=4。用Clustal V程序比對序列后，可通過查看同一程序中的“序列距離”表來獲得“百分比同一性”。
[0071]“BLASTN比對方法”是由國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information, NCBI)提供的用以采用默認參數比較核苷酸序列的算法。
[0072]本領域的技術人員非常清楚，多種程度的序列同一性可用于從其他物種中鑒定多肽，其中這類多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用的實例包括但不限于 50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 % 或 95 %、或 50 % 至 100 %之間的任何整數百分比。實際上，50%至100%之間的任何整數氨基酸同一性可用于描述本發明，諸如 51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%,67%, 68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96 %、97 %、98 %或99 %。此分離核苷酸片段的任何全長或部分互補的序列也是有用的。
[0073]“密碼子簡并性”指允許核苷酸序列在不影響所編碼的多肽的氨基酸序列的情況下發生變化的遺傳密碼的趨異度。因此，本發明涉及任何包含編碼所有或主要部分的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸片段，所述氨基酸序列編碼如SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、和SEQ ID N0:6示出的AsSCPLUAsMH和AsGT2蛋白。技術人員熟知由特定宿主細胞使用指定給定氨基酸的核苷酸密碼子表現出的“密碼子偏倚”。因此，當合成多核苷酸用于改善宿主細胞中的特定基因表達時，希望設計該多核苷酸使得其密碼子使用頻率接近宿主細胞使用的優選密碼子的頻率。
[0074]如本文所用的，“合成核酸片段”可由使用本領域技術人員已知的方法化學合成的寡核苷酸構件裝配而成。將這些構件相連接并進行退火以形成更大的核酸片段，然后可將其酶催化進行裝配以構建完整的所需核酸片段。與核酸片段有關的“化學合成”指在體外對組分核苷酸進行裝配。可以采用完善建立的方法來完成核酸片段的手工化學合成，或者可使用許多種可商業獲得的機器中的一種來完成自動化學合成。因此，基于最優化核苷酸序列以反映宿主細胞的密碼子偏倚性，可以定制核酸片段用以最優化基因表達。如果密碼子使用偏向于宿主偏好的那些密碼子，則技術人員會理解成功的基因表達的可能性。優選的密碼子的確定可基于對來源于宿主細胞的基因(其中序列信息可獲得)的檢測。
[0075]“基因”是指能夠表達特定蛋白質的核酸片段，其包括編碼序列前的調控序列(5'非編碼序列)和編碼序列后的調控序列(3'非編碼序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的調控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情況下不是一起存在的調節序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包括源于不同來源的調控序列和編碼序列，或者包括源于同一來源但以不同于天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。“外來基因”指正常情況下不存在于宿主生物中的基因，它通過基因轉移導入宿主生物。外來基因可以包含插入到非天然生物體內的天然基因，或嵌合基因。“轉基因”是通過轉化方法導入基因組內的基因。
[0076]在應用于植物細胞時，術語“基因組”不僅包括在細胞核內發現的染色體DNA，并且還包括在細胞的亞細胞成分(例如線粒體、質體)內發現的細胞器DNA。
[0077]“經密碼子最優化的基因”是其密碼子使用頻率經設計用以模仿宿主細胞優選的密碼子使用頻率的基因。
[0078]“等位基因”是染色體上占據給定位點的基因的幾種供選擇替代形式中的一種。當染色體上給定位點處存在的所有等位基因相同時，植物在該位點是純合子。如果染色體上給定位點處存在的等位基因不同的話，植物在該位點是雜合子。
[0079]“編碼序列”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。“調控序列”指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)，并且影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性或者翻譯的核苷酸序列。調控序列可包括，但不限于:啟動子、翻譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點和莖環結構。
[0080]“啟動子”指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。啟動子序列由近側和較遠端上游元件組成，后者經常指增強子。因此，“增強子”是能刺激啟動子活性的DNA序列，它可以是啟動子的天然元件，或插入以增強啟動子水平或組織特異性的異源元件。啟動子可以整個源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的啟動子的不同元件組成，或者甚至包括合成的DNA片段。本領域內的技術人員應當理解，不同的啟動子可以在不同的組織或細胞類型中，或者在不同的發育階段，或者響應不同的環境條件而引導基因的表達。還應認識到，由于在大多數情況下還不能完全確定調控序列的確切范圍，一些變型的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。在多數情況下引起基因在大多數細胞型中表達的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。目前不斷在發現可用于植物細胞中的不同類型的新啟動子；在以下文獻中可以發現多個實例:0kamuro, J.K.and Goldberg, R.B.編輯的BiochemistryofPlantsl5:1-82(1989)。
[0081]“翻譯前導序列”指位于基因啟動子序列和編碼序列之間的多核苷酸序列。翻譯前導序列存在于翻譯起始序列的經完全加工后的mRNA上游。翻譯前導序列可影響mRNA的初級轉錄過程、mRNA穩定性或翻譯效率。已經描述了翻譯前導序列的實例(Turner, R.和Foster, G.D., Mol.Biotechnol.3:225-236(1995))。
[0082]“3’非編碼序列”，“轉錄終止子”或“終止序列”是指位于編碼序列下游并且包括能夠影響mRNA加工或基因表達的`多腺苷酸化識別序列和其他序列編碼調節信號的DNA序列。多腺苷酸化信號通常表征為影響多腺苷酸片添加到mRNA前體的3’末端。Ingelbrecht,1.L.等人例示了不同3’非編碼序列的用途Plant Celll:671-680 (1989)。
[0083]“ RNA轉錄物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的轉錄所產生的產物。當RNA轉錄物與DNA序列拷貝完全互補時，它指初級轉錄物。當RNA轉錄物是來源于轉錄后加工的初級轉錄物的RNA序列時，它指成熟的RNA。“信使RNA”或“mRNA”指無內含子并且可以由細胞翻譯成蛋白質的RNA。“cDNA”指與mRNA模板互補并用反轉錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈，或使用DNA聚合酶I的Klenow片段轉化成雙鏈。“有義”RNA指包含mRNA并且能在細胞內或體外翻譯成蛋白質的RNA轉錄物。
[0084]“反義RNA”指與全部或部分靶初級轉錄物或mRNA互補，并阻止靶基因表達的RNA(美國專利5，107，065)。反義RNA可以與特定基因轉錄物的任何部分，即5’非編碼序列、3’非編碼序列、內含子、或編碼序列互補。“功能性RNA”指反義RNA、核酶RNA或其它不能翻譯但是對細胞過程有影響作用的RNA。術語“互補的”和“反向互補的”對mRNA轉錄來說可互換使用，并且用以定義信使反義RNA。
[0085]術語“可操作地連接”指單個核酸片段上的核酸序列的關聯，使得其中一個核酸序列的功能受到另一個核酸序列的調控。例如，當啟動子能夠調節編碼序列的表達(即，該編碼序列受到該啟動子的轉錄控制)時，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以以有義或反義的取向可操作地連接至調控序列。在另一個例子中，本發明的互補RNA區域，無論直接或間接連接、5 ’端與目標mRNA或3 ’端與目標mRNA連接、或者位于目標mRNA內、或者第一互補區域以5’端而其互補體以3’端與目標mRNA連接，均可構成可用的連接。
[0086]本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻中有更全面的描述:Sambrook, J., Fritsch, E.F.and Maniatis, T., Molecular Cloning:ALaboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory: Co Id Spring Harbor,NY(1989)。轉化方法為本領域的技術人員所熟知，并描述于下文。
[0087]“PCR”或“聚合酶鏈反應”是用于合成大量的特定DNA片段的技術，其包括一系列重復的循環(Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT)。典型地，雙鏈 DNA 被熱變性，兩種與目標片段的3’端區域互補的引物在較低溫度下與之退火，然后在中間溫度下得到延伸。一組的上述三個連續的步驟被稱為一個“循環”。
[0088]術語“重組”指例如通過化學合成或者通過用基因工程技術操縱分離的核酸片段來實現的兩個原本分離的序列片段的人工組合。
[0089]術語“質粒”、“載體”和“盒”指通常攜帶有不屬于細胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件，并且常常是環狀雙鏈DNA片段的形式。這類元件可以是源自任何來源的自主復制序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線性或環狀)，其中多個核苷酸序列已連接或重組進入一種獨特構建體中，該獨特構建體能夠將所選基因產物的啟動子片段和DNA序列與相應的3’末端非翻譯序列一起引入細胞中。“轉化盒”指含有外來基因并且除了該外來基因外還含有有利于轉化特定宿主細胞轉化的元件的特定載體。“表達盒”是指包含外來基因，并具有能令所述基因在宿主中增強表達的所述基因以外的元件的特定載體(即指可將核酸序列或片段移入其中的不連續的核酸片段)。
[0090]術語“重組構建體”、“表達構建體”、“嵌合構建體”、“構建體”和“重組DNA構建體”本文可互換使用。重組構建體包括人造的核酸片段組合，例如天然條件下不一起存在的調控序列和編碼序列。例如嵌合構造可包括源于不同來源的調控序列和編碼序列，或者包括源于同一來源但以不同于天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。此類構建體可獨自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于用以轉化宿主細胞的方法，該宿主細胞是本領域的技術人員所熟知的。例如可以使用質粒載體。技術人員熟知為了成功地轉化、篩選和繁殖包括本發明任何分離的核酸片段的宿主細胞，必須存在于載體上的遺傳元件。技術人員還將認識到，不同的獨立轉化事件將導致不同水平和模式的表達(Jones 等人，EMBO J.，4:2411-2418 (1985) ;DeAlmeida 等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86 (1989))，因此，必須篩選多次事件以獲得顯示期望表達水平和模式的品系。這樣的篩選可以通過DNA的Southern印跡分析、mRNA表達的Northern印跡分析、蛋白表達的免疫印跡分析或表型分析等完成。
[0091]本文所用術語“表達”是指功能性終產物(例如，mRNA或蛋白質(既可以是前體也可以是成熟形式))的生產。
[0092]術語 “導入”是指將核酸(例如表達構建體)或蛋白提供至細胞中。導入包括指將核酸整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸可以整合進細胞的基因組內，以及包括指將核酸或蛋白暫時提供給細胞。導入包括指穩定的或暫時性的轉化方法以及有性雜交。因此，將核酸片段(例如重組DNA構建體/表達構建體)插入細胞內的情況下的“導入”意指“轉染”或“轉化”或“轉導”，并且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸片段可以整合進細胞的基因組(如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)內、轉變成自主的復制子或瞬時表達(例如轉染的mRNA)。
[0093]“成熟”蛋白質指經翻譯后加工的多肽(即已經去除了存在于初始翻譯產物中的任何前肽或肽原的多肽)。“前體”蛋白質指mRNA的初級翻譯產物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是(但不限于)細胞內定位信號。 [0094]“信號肽”是一種與蛋白協同翻譯并將蛋白導向分泌器官體系的氨基酸序列(Chrispeels, M.(1991) Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42:21-53)。如果將所述蛋白導向液泡，可另外加上液泡靶向信號(同上)，或者如果將所述蛋白導向內質網，可加上內質網駐留信號(同上)。如果將蛋白導向細胞核，將移除任何存在的信號肽并用以核定位信號替代(Raikhel, N.(1992)Plant Phys.100:1627-1632)。“葉綠體轉運肽”是與蛋白協同翻譯并將蛋白導向葉綠體或在其中制備蛋白的細胞中存在的其它質體類型。“葉綠體轉運序列”指編碼葉綠體轉運肽的核苷酸序列。
[0095]“穩定轉化”指將核酸片段轉入宿主生物的基因組以產生穩定的遺傳特性，該基因組包括核基因組和細胞器基因組。相反“瞬時轉化”指將核酸片段轉入宿主生物的核中或包含DNA的細胞器中，在無整合或無穩定的遺傳特性的情況下引起基因表達。含有轉化核酸片段的宿主生物被稱為“轉基因”生物體。
[0096]如本文所用的“轉基因”是指其基因組內含有異源多核苷酸的植物或細胞。優選的是，異源多核苷酸被穩定地整合進基因組中，使得該多核苷酸能傳遞至連續的世代。異源多核苷酸可以單獨地或作為表達構建體的部分整合進基因組中。本文所用的轉基因包括因異源核酸存在而已經改變了基因型的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括初始進行此類改變的轉基因以及從初始的轉基因通過有性雜交或無性繁殖產生的那些轉基因。如本文所用的術語“轉基因”不涵蓋通過常規植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發突變之類的自然發生事件導致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。
[0097]術語“抑制”指當與植物中天然酶的可檢測的酶活性水平比較時，轉基因植物中可檢測的酶活性水平的降低。植物中天然酶的酶活性水平本文稱為“野生型”活性。術語“抑制”包括降低、減少、下調、減弱、抑制、消除和阻止。該降低可能是由于降低了天然mRNA翻譯成天然酶的水平。也可能是由于天然DNA轉錄成mRNA的量降低和/或天然mRNA的降解加快。術語“天然酶”指所需細胞中天然產生的酶。
[0098]植物中的酶抑制可通過本領域已知的多種方法完成，包括以下方法。“共抑制”是指產生能抑制相同的或充分相似的天然基因表達的有義RNA轉錄本(美國專利5，231，020)。此前，已通過著眼于以有義方向過表達與內源mRNA具有同源性的核酸序列(其導致與過表達的序列具有同源性的所有RNA減少)設計出了植物中的共抑制構建體(參見 Vaucheret 等人，1998, Plant J., 16:651-659 ；以及 Gura, 2000, Nature404:804-808)。“反義抑制”指產生能夠抑制靶蛋白表達的反義RNA轉錄物。可將植物病毒序列用于引導對近端mRNA編碼序列的抑制(于1998年8月20日公開的PCT專利公開W098/36083)。已經描述了 “發夾”結構以互補方向整合mRNA編碼序列的全部或部分，導致已表達的RNA形成潛在的“莖-環”結構(于1999年10月21日公開的PCT專利公開W099/53050)。在這種情況下，莖由對應相對于啟動子以有義或反義方向插入的相關基因的多核苷酸形成，并且環由一些相關基因的多核苷酸形成，在構建體中該多核苷酸不具有互補序列。這增加了獲得的轉基因植物中的共抑制或沉默頻率。關于發夾抑制的綜述，參見Wesley, S.V.等人，2003, Methods in Molecular Biology, Plant Functional Genomics:Methods and Protocols236:273_286。其中莖由至少30個來自待抑制基因的核苷酸形成而環由任意的核苷酸序列形成的構建體也已經有效地用于抑制(于1999年12月2日公開的W099/61632)。使用聚-T和聚-A序列產生莖-環結構中的莖已經有所描述(于2002年I月3日公開的W002/00894)。然而另一種變型涉及使用合成的重復序列來促進莖-環結構中的莖的形成。用這種重組DNA片段產生的轉基因生物體顯示由形成莖環結構的核苷酸片段編碼的多核苷酸的水平降低，如于2002年I月3日公開的PCT專利公開W002/00904中所述。已經描述了產生dsRNA構建體的用途。在這些構建體中共啟動子引導誘導基因抑制的基因特異性有義和反義RNA的轉錄(參見例如Shi，H.等人(2000) RNA6:1069-1076 ；Bastin,P.等人(2000) J.Cell Sc1.113:3321-3328 ；Giordano,E.等人(2002)Geneticsl60:637-648 ；LaCount,D.J.和 Donelson，J.E.美國專利申請 20020182223，公布于2002年12月5日；Tran,N.等人(2003)BMC Biotechnol.3:21 ;和 申請人:的美國臨時申請60/578，404，提交于2004年6月9日)。
[0099]用于酶抑制的其它方法包括但不限于使用可形成催化RNA或可具有核酶活性的多核苷酸(美國專利公開4，987，071，公布于1991年I月22日)，以及小RNA(也稱為miRNA)干涉(Javier 等人(2003)Nature425:257-263)。
[0100]用于抑制的多核苷酸片段序列與需被抑制的基因中存在的多核苷酸片段序列并非100%相同。例如，使用來源于編碼a亞基(美國專利公開6，362，399)的基因部分的多核苷酸已經成功抑制了所有大豆種子貯藏蛋白(6-大豆伴球蛋白的亞基。(6-大豆伴球蛋白是一種異質糖蛋白，由三個高負電亞基(鑒定為a、a’和(6)的多樣化組合組成。編碼a和a ’亞基的多核苷酸序列彼`此約85%相同，然而編碼0亞基的多核苷酸序列與a和a ’亞基分別為約75%至約80%相同。因此，與需抑制的靶多核苷酸區域至少約75%相同的多核苷酸已經顯示對抑制所需靶有效。所述多核苷酸可以與所需靶序列至少約80%相同，至少約90%相同，至少約95%相同，或約100%相同。
[0101]天然基因“能夠抑制表達的部分”指分離的核酸片段的一個部分或亞片段，其中無論所述片段或亞片段是否可以被翻譯成有活性的酶，其都保留著改變基因表達或導致某種表型的能力。例如，所述片段或亞片段可以被用于設計嵌合基因或重組DNA片段，以在轉化后的植物中產生所期望的表型。可以通過將核酸片段或亞片段以相對于植物啟動子序列有義或反義的方向與所屬啟動子序列連接，從而設計出用于抑制的嵌合基因，其中所述核酸片段或亞片段無論是否翻譯成有活性的酶均可。可將重組DNA片段設計成包含能夠促進莖-環結構形成的核酸片段。在莖-環結構中環或莖包含一部分需被抑制的基因。核酸片段應具有至少約20個鄰接核苷酸的延伸部分，該延伸部分與需被抑制的基因相同。鄰接核苷酸的延伸部分可以是任何數目，從至少約20，或約32，至需被抑制的整個基因的大小。
[0102]術語“植物”包括整個植株、植物器官、植物組織、種子和植物細胞，種子以及同一植株的子代。植物細胞包括但不限于得自下列物質的細胞:種子、懸浮培養物、胚、分生區域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。[0103]“子代”包括植物的任何后續世代。
[0104]“對至少一種真菌有抗性的植物”指包含本發明的重組DNA構建體的植物，當用真菌感染該植物時，相對于無本發明的重組DNA構建體的植物，它能抗感染或在更大程度上忍受感染，導致損害減少、健康程度增加以及產量少損失或不損失。真菌通常是病原體。“病原體”或“真菌病原體”指在不包括本發明重組DNA構建體的條件下將引起植物疾病的真菌。包含本發明的重組DNA構建體的轉基因植物通常是比無本發明重組DNA構建體的相同物種植物對至少一種真菌更具有抗性的植物。
[0105]植物表達系統、表達盒和載體、以及轉化 [0106]啟動子是引導植物細胞機制從啟動子的鄰接編碼序列下游(3’)產生RNA的DNA序列。所述啟動子區域影響著基因的RNA轉錄物合成的速率、合成時的發育階段和細胞類型。所述RNA轉錄物被加工為mRNA，后者作為用于將RNA序列翻譯為所編碼多肽的氨基酸序列的模板。5’端非翻譯前導序列是mRNA上位于蛋白質編碼區域上游的區域，其可能對mRNA翻譯的起始和進行發揮作用。3’轉錄終止/多聚腺苷酸化信號是位于蛋白質編碼區域下游的非翻譯區域，其在植物細胞中的作用是導致RNA轉錄的終止和多聚腺苷酸向RNA3’端的添加。
[0107]用于驅動編碼序列表達的啟動子的來源并不重要，只要它具有足夠的轉錄活性以通過在適當的時間、在所期望的宿主組織內表達所期望的核酸片段的可翻譯的mRNA，從而達到本發明的目的即可。異種的或非異種的(即內源的)啟動子均可用于實施本發明。例如，適當的啟動子包括但不限于4大豆伴球蛋白啟動子的a引發亞單位、庫尼茲(Kunitz)胰蛋白酶抑制劑3啟動子、膜聯蛋白啟動子、大豆球蛋白Gyl啟動子、0大豆伴球蛋白啟動子的P亞單位、P34/Gly Bd m30K啟動子、白蛋白啟動子、Leg Al啟動子和LegA2啟動子。
[0108]上述膜聯蛋白或P34啟動子描述于PCT專利公布W004/071178 (公布于2004年8月26日)。上述膜聯蛋白啟動子的活性水平與任何已知的強啟動子相當，所述強啟動子如:(l)CaMV35S 啟動子(Atanassova 等人，Plant Mol.Biol.37:275-285(1998)；Battraw and Hall, Plant Mol.Biol.15:527-538(1990) ；Holtorf 等人，Plant Mol.Biol.29:637-646(1995) Jefferson 等人，EMBO J.6:3901-3907(1987) ；ffilmink等人，Plant Mol.Biol.28:949-955(1995)) ; (2)擬南芥油質蛋白(oleosin)啟動子(Plant 等人，Plant Mol.Biol.25: 193-205(1994) ；Li, Texas A&M UniversityPh.D.dissertation, pp.107-128 (1997)) ； (3)擬南芥泛素延伸蛋白啟動子(Callis 等人，J Biol.Chem.265(21):12486-93(1990)) ； (4)番茄泛素基因啟動子(Rollfinke 等人，Gene.211(2):267-76(1998)) ； (5)大豆熱激蛋白啟動子(Schoffl 等人，Mol GenGenet.217(2-3):246-53(1989));以及(6)玉米 H3 組蛋白基因啟動子(Atanassova 等人，Plant Mol Biol.37(2):275-85(1989))。
[0109]上述膜聯蛋白啟動子的另一有用特性是其在發育種子中的表達譜。上述膜聯蛋白啟動子在早期(授粉后10天以內)的發育中種子中最為活躍，而在隨后的時期基本保持沉默。上述膜聯蛋白啟動子的表達譜與許多種子特異性啟動子的都不同，后者如通常在發育后期表現出最高活性的種子貯藏蛋白啟動子(Chen等人，Dev.Genet.10:112-122(1989)；Ellerstrom 等人，Plant Mol.Biol.32:1019-1027 (1996) ；Keddie 等人，Plant Mol.Biol.24:327-340(1994) ;Plant等人，(同上)；Li,(同上))。上述膜聯蛋白啟動子具有更加常規的表達譜，不過仍與其他已知的種子特異性啟動子不同。因此，當希望在早期發育階段過表達或抑制一個基因時，上述膜聯蛋白啟動子是一個很有吸引力的選擇。例如，可能希望過表達一個調控早期胚胎發育的基因或一個在種子成熟之前參與代謝的基因。
[0110]在鑒定出適合表達編碼序列的適當啟動子之后，利用為本領域的技術人員所熟知的傳統方法，將所述啟動子以有義方向進行可操作地連接。
[0111]本文所用的標準的重組DNA和分子克隆技術為本領域所熟知，并且Sambrook，J.等人在 Molecular Cloning:A Laboratory Manual ;第二版；Cold Spring HarborLaboratory Press:Cold Spring Harbor, New York, 1989 (以下簡稱 “Sambrook 等人，1989”)或 Ausubel, F.M.，Brent, R.，Kingston, R.E.，Moore, D.D.，Seidman, J.G.，Smith,J.A.and Struhl, K.,編輯，；在 Current Protocols in Molecular Biology ；John Wileyand Sons:New York, 1990 (以下簡稱“Ausubel等人，1990”)中有更加詳盡的描述。
[0112]在構建了重組構建體之后，可以通過為本領域的普通技術人員所熟知的方法(例如轉染、轉化和電穿孔)，將其導入植物細胞。[0113]也可將本發明的重組構建體導入一種植物細胞；或者也可將每一重組構建體導入至不同的植物細胞。
[0114]如前所述，在植物細胞中的表達方式可以是暫時性的也可以是穩定的。
[0115]植物部分包括分化和未分化的組織，包括但不限于下列部分:根、莖、芽、葉、花粉、種子、腫瘤組織和多種形式的細胞和培養物(例如單個細胞、原生質體、胚和愈傷組織)。植物組織可存在于植株或植物器官、組織或細胞培養物中。
[0116]術語“植物器官”是指構成植株的形態和功能不同部分的植物組織或組織群。術語“基因組”是指:(1)存在于生物體的每一個細胞或者病毒或細胞器中的全套遺傳物質(基因和非編碼序列)；和/或(2)作為(單倍體)單位從一個親本遺傳的全套染色體。
[0117]用于轉化雙子葉植物(主要利用根癌農桿菌)并獲得轉基因植物的方法，已與其他方法一起公布于下列文獻:棉花(美國專利5，004, 863 ;美國專利5，159，135);大豆(美國專利5，569，834 ;美國專利5，416，011);用于蕓苔屬植物(Brassica)的那些(美國專利 5,463，174);花生(Cheng 等人，Plant Cell Rep.15:653-657(1996) ;McKently 等人 Plant Cell Rep.14:699-703 (1995));番木瓜果(Ling, K.等人 Bio / technology9:752-758(1991));以及豌豆(Grant 等人 Plant Cell R印? 15:254-258 (1995))。對植物轉化的其他常用方法的綜述參見Newell，C.A.(Mol.Biotechnol.16:53-65 (2000)) ?這些轉化方法之一利用了發根土壤桿菌(Tepfler, M.and Casse-Delbart, F.Microbiol.Sc1.4:24-28 (1987))。已公布的利用直接輸送DNA進行的大豆轉化，有利用PEG融合(PCT專利公布 TO92 / 17598)、利用電穿孔(Chowrira, G.M.等人，Mol.Biotechnol.3:17-23 (1995)；Christou, P.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.84:3962-3966 (1987))、利用顯微注射和利用基因槍轟擊(McCabe, D.E 等人,Bio / Technology6:923(1988) ;Christou 等人，PlantPhysiol.87:671-674(1988))進行的。
[0118]存在多種用于從植物組織再生植物的方法。再生的具體方法將取決于起始植物組織以及待再生的具體植物物種。從單植物原生質體轉化體或從多種經轉化的外植體再生、發育和培育植物是本領域所熟知的(Weissbach和Weissbach (編輯)，載于:Methods forPlant Molecular Biology, (Eds.) ,Academic:San Diego, CA (1988))。該再生和生長方法通常包括如下步驟:選擇轉化的細胞和培養這些單獨化的細胞通過胚發育的通常階段以及通過生根小植株階段。轉基因胚以及種子以類似的方式再生。隨后將所得的轉基因的生根小苗種植在諸如土壤之類的合適植物生長培養基中。優選地，將再生的植物進行自花授粉以產生純合的轉基因植物。或者，將得自再生植物的花粉與農學上重要的品系的產生種子的植株進行雜交。相反，將來自這些重要品系的植物用于給再生植物授粉。利用本領域技術人員所熟知的方法培育含有所需多肽的本發明的轉基因植物。
[0119]除以上所討論的程序以外，專業人員亦熟悉描述了用于下列目的的特定條件和程序的標準源資料:大分子的構建、操作和分離(例如DNA分子、質粒等等)；重組DNA片段和重組表達體的構建；以及克隆的篩選和分離。例如參見:Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor:NY(1989) ;Maliga 等人，Methodsin Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor:NY(1995) ；Birren 等人，GenomeAnalysis !Detecting Genes,第 I 卷,Cold Spring Harbor:NY(1998) ;Birren等人,GenomeAnalysis !Analyzing DNA,第 2 卷，Cold Spring Harbor:NY(1998) ；Plant MolecularBiology:A Laboratory Manual，編輯，Clark, Springer:NY(1997)。
[0120]本發明涉及編碼絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的分離多核苷酸。如本文所用，“多核苷酸”指編碼新絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的多核苷酸，所述酶涉及植物中3 -香樹素衍生的三萜或具有改變修改形式的三萜的生物合成。這些分離自黑燕麥的酶稱為AsSCPLI (絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶)、AsMTl (甲基轉移酶)和AsGT2 (葡糖基轉移酶)。
[0121]Sad7突變體不能產生燕麥根皂苷，也不能積累在正-氨茴酸甲酯(燕麥根皂苷A-1和B-1)或苯甲酸鹽(燕麥根皂苷A-2和B-2)酰基位點具有羥基的三萜配醣(Qi X等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.101:8233)。因此，它們不發生三萜酰化。已經鑒定了四個具有Sad7表型的突變體`(表1)。它們中的每一個都具有對本發明的多核苷酸有損害，將導致多核苷酸不能表達編碼功能蛋白的功能mRNA。這些數據與本文提供的生物化學數據一起表明本發明非突變的多核苷酸編碼來自黑燕麥的(ASCPLl)絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶，該酶負責三萜主鏈的酰化，而該酰化過程在Sad7突變體中不發生。公開了編碼AsSCPLI 的 cDNA 基因組片段(SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:7)。
[0122]表1:表征Sad7突變體。顯示的發生改變的堿基位置(上標第2列)基于突變體DNA序列與SEQ ID NO:1的比較。
[0123]
【權利要求】
1.分離的多核苷酸，所述多核苷酸由以下序列組成: (a)編碼甲基轉移酶多肽的核苷酸序列，所述多肽由SEQID NO:4的氨基酸序列組成；或 (b)由(a)的全長互補序列組成的核苷酸序列。
2.權利要求1的多核苷酸，其中所述編碼甲基轉移酶的核苷酸序列由SEQID N0:3或8中的一種組成。
3.包含權利要求1的多核苷酸的載體。
4.重組DNA構建體，所述構建體包含權利要求1的編碼三萜途徑的第一種酶的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接至少一種調控序列。
5.權利要求4的重組DNA構建體，所述構建體還包含至少第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽，其中所述第二種酶是P -香樹素合酶或 CYP51H10。
6.用于轉化細胞的方法，所述方法包括用權利要求4或權利要求5的重組DNA構建體轉化細胞。
7.用于生產轉基因植物的方法，所述方法包括用權利要求4或權利要求5的重組DNA構建體轉化植物細胞并 從所述轉化過的植物細胞再生轉基因植物。
8.包含權利要求4的重組DNA構建體的分離宿主細胞，其中所述宿主細胞不是植物細胞。
9.權利要求8的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自酵母細胞和細菌細胞。
10.改變植物細胞中多肽表達水平的方法，所述方法包括: a)用來自權利要求1的分離多核苷酸的核酸片段轉化植物組織，其中所述多核苷酸能夠改變天然甲基轉移酶的表達； b)將所述植物組織再生成轉基因植物；以及 c)評估當與具有對應的天然甲基轉移酶的野生型表達水平的植物比較時，所述轉基因植物的甲基轉移酶的表達水平改變。
11.生產對至少一種真菌具有抗性的植物的方法，所述方法包括: a.用至少一種權利要求4的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞； b.在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及 c.評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未受所述重組DNA構建體轉化過的植物比較時，對至少一種真菌的抗性提高； 其中所述植物是單子葉植物。
12.權利要求11的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽，其中所述第二種酶是P -香樹素合酶或CYP51H10。
13.權利要求11的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼選自P -香樹素合酶和CYP51H10的酶。
14.生產具有改變水平的甲基轉移酶的植物的方法，所述方法包括: a)用權利要求4的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；b)在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及 c)評估當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的甲基轉移酶的量比較時，步驟(b)的轉基因植物的甲基轉移酶的水平改變； 其中所述植物是單子葉植物。
15.權利要求14的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽。
16.權利要求14的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼選自P -香樹素合酶和CYP51H10的酶。
17.用于生產具有改變的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括: 1.用至少一種權利要求4的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞； 2.在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及 3.評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平改變， 其中所述植物是單子葉植物。
18.權利要求17的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽，其中所述第二種酶是P -香樹素合酶或CYP51H10。
19.權利要求17的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼選自P -香樹素合酶和CYP51H10的酶。
20.用于生產具有提高的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括: a)用至少一種權利要求4的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞； b)在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及 c)評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平提高； 其中所述植物是單子葉植物。
21.權利要求20的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽，其中所述第二種酶是P -香樹素合酶或CYP51H10。
22.權利要求20的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼選自P -香樹素合酶和CYP51H10的酶。
23.用于生產具有降低的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括: a)用至少一種權利要求4的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞； b)在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及 c)評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平降低； 其中所述植物是單子葉植物。
24.權利要求23的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶表達的多肽，其中所述第二種酶是P -香樹素合酶或CYP51H10。
25.權利要求23的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼選自P -香樹 素合酶和CYP51H10的酶。
【文檔編號】C12N5/10GK103602691SQ201310373364
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2007年6月25日 優先權日:2007年6月25日
【發明者】A.奧斯伯恩, X.齊 申請人:植物生物科學有限公司