一種提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的復性方法
【專利摘要】一種提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的復性方法，屬于生物醫藥【技術領域】。本發明的基本過程為將變性蛋白通過凝膠過濾柱，在洗脫的過程中逐漸降低尿素的濃度，進而蛋白可以正確折疊而形成天然活性蛋白。本發明的方法不僅操作簡便，可以獲得高純度的蛋白并保持很高的蛋白或收率，而且可以顯著提高蛋白的生物活性。
【專利說明】一種提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的復性方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥【技術領域】,涉及牛蛇抗血栓酶kfpase的復性方法。

【背景技術】
[0002]血栓栓塞性疾病嚴重影響人類的健康，是導致死亡率最高的病因之一。在過去的幾十年中，已經開發了針對血液凝固、血小板激活和聚集、血栓溶解的不同步驟而起作用的基礎和臨床藥物，但是很多抗血栓藥物經常被包括低血壓、出血等系統性的副作用所限制，因此，需要開發新型的更具潛力和特異性的抗血栓藥物。
[0003]牛虻抗血栓酶kfpase為一種單鏈蛋白，其表觀分子量為27kDa。實驗表明牛虻抗血栓酶kfpase具有明顯的抗靜脈血栓的作用。該工作對有潛力開發成為新型單組份抗血栓藥物的牛虻抗血栓酶kfpase進行了較為系統的理化性質研究，為該酶的進一步開發和研究奠定了基礎。
[0004]原核表達系統作為一種成熟的蛋白表達系統，因其表達量高，操作簡便和成本較低一直以來都受到工業化生產的青睞。因此借助大腸桿菌系統進行基因工程重組表達具有成本低，大規模發酵容易等優點，但重組蛋白在大腸桿菌系統中基本以包涵體形式表達，表達產物不具有生物活性，往往需要進行繁瑣的蛋白質復性實驗才能獲得部分活性。蛋白質在折疊復性中存在一個難以調和的矛盾，那就是蛋白質的折疊和聚集是個競爭過程。當疏水基團的結合發生在在蛋白質內時即為折疊，發生在分子間時就為聚集。后者是個不可逆的過程，往往形成不溶性沉淀。蛋白質的折疊是單分子的一級反應，聚集是雙分子或者多分子反應，通常為二級乃至更高級的反應，因此隨著蛋白質濃度的提高聚集的傾向將大于折疊的傾向。基因工程的產業化首先要求能在高濃度下復性，蛋白濃度過低無疑會增加后處理的繁瑣，提高成本；其次，要保證高的活性收率，即復性的產物與天然結構完全相同；再次，需要高的蛋白收率，盡量減少蛋白質折疊過程中的聚集沉淀。
[0005]蛋白質復性的經典方法一般采用稀釋和透析法，前者將變性蛋白直接加入復性緩沖液，高蛋白濃度下往往形成大量沉淀，因而復性時要求很低的蛋白質濃度，而后者操作繁瑣，不利于放大。超濾法復性時可以講變性劑用復性緩沖液連續置換，使變性劑濃度緩慢降低，而蛋白濃度不會明顯降低，而且便于自動化操作，但剪切力可能導致復性好的蛋白重新變性而降低活性收率。其他改進的經典復性方法還有脈沖復性、滴加復性和膜管流加復性，它們均不能從根本上解決聚集沉淀的問題。
[0006]近年來，固相復性和層析復性的方法被提出且逐漸受到重視，因為它有如下優越性:減少蛋白質互相聚集的機會，提高蛋白質復性濃度；便于去除變性劑；打破復性變性反應平衡，使復性反應持續進行；使復性和純化同時進行；便于自動化、規模化生產。
[0007]凝膠過濾層析是一種在蛋白分離純化領域常用的技術，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。也叫做分子排阻層析。一種利用帶孔凝膠珠作基質，按照分子大小分離蛋白質或其它分子混合物的層析技術。一般是大分子先流出來，小分子后流出來。


【發明內容】

[0008]本發明的目的在于克服稀釋復性和透析復性的缺點，為了提高蛋白的活性同時又提高了蛋白的收率，而且變性蛋白在高濃度下復性，不易產生沉淀的目的，從而提供一種操作簡單、利用凝膠過濾層析復性蛋白的方法。
[0009]本發明的方法利用凝膠過濾層析復性蛋白的，包括如下步驟實現的:
[0010](I)柱平衡:用流動相I平衡凝膠過濾柱；泵入5% -10%柱體積的流動相II ;其中流動相I為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TriS-HCl) 20-50mmol / L，pH8.0-9.5，L-精氨酸200-500mmol / L，還原型谷胱甘肽l-3mmol / L，氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol / L，流動相
II為尿素 6-8mol / L，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) 20-50mmoI / L，ρΗ8.0-9.5，L-精氨酸200_500mmol / L,還原型谷胱甘肽l_3mmol / L,氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol /L ；
[0011](2)上樣:泵入變性蛋白；
[0012](3)洗脫:繼續用流動相I洗脫凝膠過濾柱，蛋白在通過凝膠過濾柱時，逐漸將尿素的濃度降低，進而蛋白有足夠的時間折疊成天然的形態。
[0013]整個復性過程是在AKTA上運行的，所有的流動相使用之前都通過了 0.22 μ m的膜進行過濾，凝膠過濾所選的介質為Superdex75、Superose6或者Sephacryl S-200,步驟(I)中的柱體積為400ml。
[0014]本發明的步驟⑴中，泵入5% -10%柱體積的流動相II，其目的是為了變性樣品上樣后，不會因為環境突然改變而發生沉淀。在這個過程中，尿素的濃度會逐漸的降低，使蛋白有一個逐漸適應的過程，從而給蛋白足夠的時間進行折疊，最后形成接近天然的形態。
[0015]凝膠過濾后收集的蛋白樣品透析后，進行抗血小板聚集實驗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為牛蛇抗血栓酶kfpase的Superdex75層析的色譜圖，箭頭所指為目的蛋白峰
[0017]圖2為牛蛇抗血栓酶kfpase的Superdex75層析的SDS-PAGE檢測結果

【具體實施方式】
[0018]實施例1:牛蛇抗血栓酶kfpase在Superdex75柱上進行復性
[0019]牛蛇抗血栓酶kfpase基因工程菌發酵后，取30g菌泥，用裂解液(20mmol / LTris-HCl，ρΗ8.0，500mmol / L NaCl，5%甘油，lmmol / L EDTA)重懸，在固液比為 I:30 的條件下，混合成均一的懸液，倒入高壓破碎儀(ATS)中進行破碎，繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品。
[0020]將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,500mmol / LNaCl)和緩沖液 B(20mmol / L Tris-HCl,pH8.0,500mmol / L NaCl，2mol / L Urea)依次洗滌，得到高純度包涵體。
[0021]取5g高純度包涵體，以固液比1:40的比例用溶解液(20mmol / LTris-HCl,pH8.0,5mmol / LDTT, 6mol / LUrea)溶解，室溫溫和攪拌1_2小時，離心得上清液200ml，并用Lowry法測定蛋白濃度。
[0022]將400ml 的 Superdex75 層析柱用流動相 I (20mmol / L Tris_HCl,pH8.0, 2mmol /L GSH,0.4mmol / L GSSG, 250mmol/L L-Arg)平衡，泵入 30ml 的流動相 II(6mol / LUrea, 20mmol / LTris-HCl,pH8.0,2mmol / L GSH,0.4mmol / L GSSG,250mmol / L L-Arg)。將溶解的變性牛蛇抗血栓酶kfpase在AKTA prime plus上泵入層析柱,上樣結束后,繼續用流動相I進行洗脫。
[0023]將洗脫獲得的樣品進行透析，透析液為(20mmol / L Tris-HCl，ρΗ8.0)。
[0024]進行抗血小板聚集實驗，抑制率與透析復性的樣品9%相比，提高了 5.6倍，為51%。
[0025]實施例2:牛蛇抗血栓酶kfpase在Superose6柱上進行復性
[0026]牛蛇抗血栓酶kfpase基因工程菌發酵后，取30g菌泥，用裂解液(20mmol / LTris-HCl，ρΗ8.0，500mmol / L NaCl，5%甘油，lmmol / L EDTA)重懸，在固液比為 1:30 的條件下，混合成均一的懸液，倒入高壓破碎儀(ATS)中進行破碎，繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品。
[0027]將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,500mmol /LNaCl)和緩沖液 B(20mmol / L Tris-HCl, ρΗ8.0，500mmol / L NaCl，2mol / L Urea)依次洗滌，得到高純度包涵體。
[0028]取5g高純度包涵體，以固液比1:40的比例用溶解液(20mmol / L Tris-HCl,pH8.0,5mmol / LDTT,6mol / L Urea)溶解，室溫溫和攪拌1_2小時，離心得上清液200ml，并用Lowry法測定蛋白濃度。
[0029]將400ml的 Superose6層析柱用流動相 I (20mmol / L Tris_HCl,pH8.0, 2mmol / LGSH,0.4mmol / L GSSG, 250mmol / L L-Arg)平衡，泵入 30ml 的流動相 II (6mol / L Urea,20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,2mmol / L GSH,0.4mmol / L GSSG,250mmol / L L-Arg)。將溶解的變性牛蛇抗血栓酶kfpase在AKTA prime plus上泵入層析柱,上樣結束后,繼續用流動相I進行洗脫。
[0030]將洗脫獲得的樣品進行透析，透析液為(20mmol / LTris-HCl，ρΗ8.0)。
[0031]進行抗血小板聚集實驗，抑制率與透析復性的樣品9%相比，提高了 5倍，為45%。
[0032]實施例3:牛蛇抗血栓酶kfpase在Sephacryl S-200柱上進行復性
[0033]牛虻抗血栓酶kfpase基因工程菌發酵后，取30g菌泥，用裂解液(20mmol / LTris-HCl，ρΗ8.0，500mmol / L NaCl，5%甘油，lmmol / L EDTA)重懸，在固液比為 I:30 的條件下，混合成均一的懸液，倒入高壓破碎儀(ATS)中進行破碎，繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品。
[0034]將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,500mmol / LNaCl)和緩沖液 B(20mmol / L Tris-HCl,pH8.0,500mmol/L NaCl，2mol / L Urea)依次洗滌，得到高純度包涵體。
[0035]取5g高純度包涵體，以固液比1:40的比例用溶解液(20mmol / L Tris-HCl,pH8.0,5mmol / L DTT, 6mol / L Urea)溶解，室溫溫和攪拌1-2小時，離心得上清液200ml，并用Lowry法測定蛋白濃度。
[0036]將400ml 的 S印hacryl S-200 層析柱用流動相 I (20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,2mmo1 / L GSH, 0.4mmo1 / L GSSG, 250mmol / L L-Arg)平衡，泵入 30ml 的流動相II(6mol / L Urea, 20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,2mmol / L GSH,0.4mmol / L GSSG,250mmol / L L-Arg)。將溶解的變性牛蛇抗血栓酶kfpase在AKTA prime plus上泵入層析柱，上樣結束后，繼續用流動相I進行洗脫。
[0037]將洗脫獲得的樣品進行透析，透析液為(20mmol / L Tris-HCl，ρΗ8.0)。
[0038]進行抗血小板聚集實驗，抑制率與透析復性的樣品9%相比，提高了 5.2倍，為47%。
【權利要求】
1.一種提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的復性方法，利用凝膠過濾層析進行，包括以下步驟: (1)柱平衡:用流動相I平衡凝膠過濾柱；泵入5%-10%柱體積的流動相II ;其中流動相I為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) 20-50mmol / L，pH8.0-9.5，L-精氨酸200-500mmol / L，還原型谷胱甘肽l-3mmol / L，氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol / L，流動相II 為尿素 6-8mol / L，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) 20-50mmoI / L，ρΗ8.0-9.5，L-精氨酸200_500mmol / L,還原型谷胱甘肽l_3mmol / L,氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol /L ； (2)上樣:泵入變性蛋白； (3)洗脫:繼續用流動相I洗脫凝膠過濾柱，蛋白在通過凝膠過濾柱時，逐漸將尿素的濃度降低，進而蛋白有足夠的時間折疊成天然的形態。
2.根據權利要求1所述的復性蛋白的方法，其特征在于凝膠過濾層析的介質為Superdex75、Superose6 或者 Sephacryl S-200。
3.根據權利要求1所述的復性蛋白的方法，其特征在于步驟(I)中的柱體積為400ml。
4.根據權利要求1所述的復性蛋白的方法，其特征在于所有步驟均是在AKTA上操作的。
【文檔編號】C12N9/68GK104419694SQ201310388577
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月29日 優先權日:2013年8月29日
【發明者】秦引林, 韓承業 申請人:江蘇柯菲平醫藥股份有限公司