一種新型誘導抗體產生的方法
【專利摘要】本發明提供了一種新型抗體產生的方法，包括制備表達融合抗原蛋白的真核表達載體。該融合蛋白包括四部分序列組成：①來源于人IgE重鏈編碼序列的信號肽序列；②抗原蛋白序列；③來源于結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ的輔助序列，該序列可以放大小鼠針對抗原蛋白的抗體應答；④能與小鼠FcrRⅡ結合的多肽序列MFSRMTSLIMGN（簡稱APCTS）；該序列可將蛋白抗原特定導向小鼠抗原呈遞細胞（APC），從而提高抗原呈遞效率。將表達融合抗原蛋白的質粒直接注射小鼠肌肉或皮內，小鼠細胞可攝入DNA、高效表達融合抗原蛋白；繼之刺激動物產生針對該抗原蛋白的高親和力抗體。產生的抗體經純化后可用于科研和臨床診斷或治療；抗體分泌細胞也可用雜交瘤技術制備特異性單克隆抗體。
【專利說明】一種新型誘導抗體產生的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫學和基因工程【技術領域】，尤其涉及到人IgE重鏈信號肽、小鼠FcrR II結合多肽和特異性抗原蛋白和結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II輔助序列組成的融合抗原蛋白及其表達載體以及用該表達載體進行DNA免疫制備特異性抗體。
[0002]
【背景技術】
[0003]抗體(antibody)指機體的免疫系統在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖分化成漿細胞所產生的、可與相應抗原發生特異性結合的免疫球蛋白。通過向動物體內注射特定的抗原，可以得到相應特異性的抗體。對這些實驗動物的血液進行分離后，可以在血清中得到“多克隆抗體”。即針對相同抗原的多種不同的抗體。這種方法制備的抗體又叫做抗血清。為了獲得針對某一抗原單一抗原表位的特異性抗體，需要從動物身上分離出相應的抗體分泌B淋巴細胞，然后通過與骨髓瘤細胞株相融合使之可無限增值。這種融合細胞叫做雜交瘤，可以在培養環境中不停分泌抗體。雜交瘤細胞既能像骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。因此，該技術又稱為雜交瘤技術(hybridoma technology)。通過有限稀釋克隆法將單個雜交瘤細胞分離出來,這種細胞克隆方法所制備出來的抗體是完全一樣的，被稱為單克隆抗體。
[0004]抗體在生物學和醫學研究領域中顯示了極大的應用價值，是親和層析中重要的配體，是免疫組化中主要的探針，是免疫檢驗中的新型試劑，是生物治療的導向武器。抗原和抗體的特異性結合在體內和體外都可呈現某種反應。在體內可表現為溶菌、殺菌、促進吞噬或中和毒素等作用，可作為藥物用于治療；抗體藥物是以細胞工程技術和基因工程技術為主體的抗體工程技術制備的藥物，具有特異性高、性質均一、可針對特定靶點定向制備等優點，在各種疾病治療，特別是腫瘤治療領域的應用前景備受關注。21世紀，生物技術將與信息技術一起為全球經濟發展提供強大的動力，成為全社會最重要并可能改變未來工業和經濟格局的技術。抗體工程技術隨著現代生物技術的發展而不斷完善，并且是生物技術產業化的主力軍，尤其在生物技術制藥領域占有重要地位。單克隆抗體由于可精確的攻擊靶分子，且具有較少的毒副作用而成為人們期望中的理想藥物。因此，制備高質量的抗體成為人們在科研、診斷和治療等領域中進行開發和研究的一種核心技術。
[0005]要得到高質量即高特異性和靈敏性的抗體，首先要有高質量的抗原用于免疫動物。在制備抗體的過程中，使用復雜的抗體純化技術、傳統的雜交瘤技術，抗體基因克隆/表達技術以及重組抗體文庫的制備等，所有這些都不能改變已產生的抗體親和力和特異性。抗體的抗體親和力 和特異性是在動物免疫和應答反應過程中就已決定的。它與動物免疫系統接觸到的抗原形式有關。抗體的純化和篩選只能幫助選出動物已經產生的各種抗體。因此，制備高質量的抗原和設計高效的動物免疫方式是制備高質量抗體的關鍵。
[0006]在常規抗體制備過程中，一般都用人工合成的多肽作為抗原。由于多肽構象與相應序列在天然蛋白質中的構象不完全一致，因此用多肽刺激動物產生的抗體對相應的天然蛋白質抗原親和力低或完全不能識別。在常規方法中，也用細菌表達的重組蛋白質作為抗原。在細菌中表達的重組蛋白，往往缺乏在真核細胞中天然蛋白經過的修飾作用。因此，細菌產生的重組蛋白液不能滿足產生針對某些經過修飾(如糖基化修飾)的真核蛋白質的特異性高質量抗體。并且，用真核細胞表達抗原蛋白，一是成本高，同時對于大規模制備批量的抗原蛋白也不實際。在常規抗體制備免疫過程中往往使用佐劑。佐劑的應用也往往會改變蛋白抗原的構象。最后，有些重要的蛋白質抗原性較低，本身很難在機體刺激產生特異性抗體。因此，在制備針對各種不同的蛋白質特異性高質量抗體，需要在從抗原制備到免疫方式等各個不同的環節進行技術革新。
[0007]Richard Young首次發現結核分枝桿菌熱休克蛋白Hsp70可以調節機體的免疫應答，建議其可以用于免疫治療和預防。他們的研究認為熱休克蛋白Hsp70含有許多協助性T細胞決定簇，可加強機體對于與之相連的其它抗原決定簇(epitope)產生特異性的抗體或細胞免疫應答(Suzue，K.& Young, R.A.: J.1mmunol.156:873-9，1996)。我們發現將結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II蛋白與特異性抗原蛋白一起制成融合蛋白，該融合蛋白注射活動物機體后可明顯促進機體對其中特異性靶蛋白抗原的抗體生成應答。結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II蛋白比結核分枝桿菌熱休克蛋白Hsp70會有更多的輔助性T細胞決定簇。它可以作為一種抗原輔助序列與天然蛋白抗原一起以融合蛋白形成對動物進行免疫。在特異性抗原免疫前，動物已受到自然界中該抗原輔助序列或同源相關蛋白的致敏作用，從而產生許多記憶性T細胞。因此，該抗原輔助序列與特異性抗原組成的融合蛋白進入機體后可迅速刺激這些已致敏的輔助性T細胞放大針對特異性抗原產生較強烈的免疫應答。抗原輔助序列也可與微生物疫苗結合在一起應用，以促進機體對于疫苗的免疫應答。
[0008]此外，Nchinda等人發現用針對樹突狀細胞Dec205分子的單鏈抗體將抗原蛋白靶向導給樹突狀細胞可以顯著增強小鼠對抗原蛋白的免疫應答(Nchinda，G.ef al: J.clin.1nvest.118:1427-36, 2008)因此，促進抗原呈遞細胞對抗原的呈遞效率也是有效制備抗體的一種方式。

【發明內容】

[0009]我們的抗體制備新技術中，首先用抗原遞呈細胞祀向序列(antigen-presentingcell-targeted sequence, APCTS)將特異性抗原定向輸給抗原遞呈細胞,從而極大地提高了其抗原呈遞(presenting)能力以及顯著促進后續的針對該抗原蛋白的特異性免疫應答，產生高滴度的特異性抗體和細胞免疫應答等。我們所用的APCTS是一種能特異性與抗原呈遞細胞表面FcrR II結合的肽，其序列為:MFSRMTSUMG。在常規免疫方法中，抗原呈遞細胞對抗原的捕捉是隨機的，以至其抗原呈遞效率極大地低于我們特異性靶向抗原富集新方法。
[0010]并且，我們還應用了抗原輔助(antigen helper)序列。我們的“抗原輔助”序列，充分利用動物機體在日常生活中已被自然界廣泛存在的“輔助抗原” “致敏(primed)”這一特點，將靶蛋白抗原與“抗原輔助序列”制成融合蛋白抗原，這樣在“抗原輔助序列”刺激的加強型特異性輔助T細胞作用下可引發有效地針對靶蛋白抗原的免疫應答。 我們的抗原輔助序列來源于結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II (CtaC)蛋白。[0011]最后，我們的新技術將人IgE重鏈信號肽序列、抗原呈遞細胞靶向序列、特異性抗原蛋白和抗原輔助序列制成一融合抗原蛋白。用基因克隆方法將編碼該融合抗原蛋白的DNA克隆到真核表達載體中去，從而得到表達該融合抗原蛋白的真核表達質粒，將該載體質粒利用DNA免疫(DNA immunization)方法使得免疫動物體內細胞中高效過量表達(overexpress)該融合抗原蛋白，這些蛋白在構象、加工和修飾方面與天然蛋白質一樣。并且這些蛋白質可持續長時間在體內表達。充足的抗原蛋白質可持續刺激、誘導抗體免疫活性細胞產生針對抗原蛋白較強的特異性免疫應包括抗體生成作用。這些抗體可對天然蛋白產生高親和力和高特異性反應。
[0012]此外，我們的技術可以用于生產高質量的一些常規方法無法或較困難得到的針對靶蛋白抗原的特異性抗體。并且，該技術可以制備產生重要的功能性抗體，如中和性抗體
坐寸ο
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】: 圖1:小鼠FcrRII結合多肽APCTS蛋白序列和DNA編碼序列。
圖2:用重疊PCR方法制備HS-ADCTS-VEGF-CtaC融合蛋白編碼DNA示意圖。
圖3:用疊加PCR (overlapping PCR)方法制得的HS-APCTS-人VEGF-CtaC融合蛋白編碼DNA片段，其大小約為2.7kb，與設計相符。
圖4:用特異性VEGF抗體在免疫印跡方法中檢測到APCTS-人VEGF-CtaC表達質粒轉染的293T細胞中該融合抗原蛋白的表達。
圖5: VEGF和APCTS-VEGF-CtaC融合蛋白DNA免疫家兔產生VEGF特異性抗體的比較。圖6:APCTS-VEGF-CtaC融合蛋白DNA免疫小鼠制備的VEGF特異性小鼠單克隆抗體(2E8)在免疫印跡實驗中對人VEGF的特異性識別作用。重組人VEGF蛋白上樣量都為10ng。圖7 =VEGF單克隆抗體(2E8)對VEGF誘導Huvec細胞的增殖抑制作用。
【具體實施方式】:
為了制備高質量的抗體，首先要制備高質量的抗原。同時用抗原免疫動物的方式也是決定抗體應答的重要環節。為了有效地使抗原被抗原呈遞細胞(APC)所捕獲，我們首先從曬菌體展示多肽文庫(phage-display library)中篩選能與APC表達的FcrR II相結合的多肽片段。采用美國NEB公司生產的Ph.D.?噬菌體表面展示肽庫試劑盒，按照操作說明，我們從隨機肽文庫中發現一短肽MFSRMTSUMG能與小鼠FcrR II結合，由此我們得到了抗原遞呈細胞祀向序列(antigen-presenting cell-targeted sequence, APCTS)。
[0014]大量實驗證明結核分枝桿菌產生的分泌蛋白和一些細胞膜相關蛋白含有許多輔助性T細胞表位(epitopes),可激活輔助性T細胞增強特異性抗體應答(Horwitz, M.A.ef al: Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92:1530-34，1995)。為了篩選這種結核分枝桿菌蛋白作為融合抗原蛋白中的輔助序列，將l_3Kb長的結核分枝桿菌H37Rv DNA片段克隆到Ρ?τ_ρ1?Α融合載體中去制成一重組蛋白表達文庫。載體中的PhoA基因編碼堿性磷酸酶，其自身上游的信號肽序列被除去，將結核分枝桿菌DNA片段克隆到其phoA基因上游，即可在IPTG誘導融合基因上游啟動子作用下介導下游融合蛋白的表達。如果結核分枝桿菌DNA編碼的是分泌型或膜蛋白，則可將具有酶活性的堿性磷酸酶蛋白通過融合蛋白分泌到細胞外或進入胞周腔，從而分解底物產生顏色反應，即可鑒定出陽性克隆。采用高通量抗-PhoA親和柱結合純化方法從陽性克隆中純化其陽性融合蛋白。然后用小鼠T細胞增殖實驗檢測篩選陽性克隆所表達的融合蛋白免疫原性。結果發現結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II蛋白的T細胞刺激作用最強。同時也證明它可以明顯促進與之融合的Ph0A蛋白在小鼠誘導的特異性抗體應答反應。因此，我們選用結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II作為免疫用融合抗原蛋白中的輔助序列。[0015]進一步，采用分子克隆方法構建表達由抗原呈遞細胞靶向序列、特異性抗原蛋白和輔助序列(結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II)以及FcrR II結合肽序列組成的融合蛋白表達載體。在該融合抗原蛋白的上游加上一來自人IgE重鏈蛋白的信號肽序列。先用疊加PCR(Overlapping PCR)方法將編碼這四個蛋白質片段的基因按以下順序進行同框(inframe)串聯在一起--人IgE重鏈信號肽-FcrR II結合肽序列_特異性抗原蛋白序列_結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II蛋白序列。將編碼這一融合抗原蛋白基因進一步克隆到真核表達載體pcDNA3.1 (+)中去制成pcDNA3.1(_)抗原表達載體。將該表達載體在大腸桿菌DH5 α細胞中進行培養擴增，制備大量純化的質粒DNA。將該質粒DNA對Balb/c小鼠進行 DNA 免疫(Chu, T.H.T.et al: Br.J.Haematol.113:32-6，2001 )，取 50 μ g 質粒于50 μ I生理鹽水中在小鼠后腿肌肉和背部皮內進行多點注射免疫；間隔2周重復DNA免疫2次。最后一次免疫2周后，在小鼠尾部取血用ELISA法測定抗原特異性抗體滴度。如制備抗原特異性單克隆抗體，則在取小鼠脾臟細胞進行融合前3天，用同一質粒轉染的293Τ細胞(5Χ IO6個細胞)在小鼠腹腔進行一次加強刺激(boost)。按常規雜交瘤技術制備抗原特異性單克隆抗體。
[0016]以下將以用本發明方法制備人VEGF特異性單克隆抗體為例，通過具體實施的方式，對本發明進行舉例說明，但應當理解這些實例不以任何形式限制本發明范圍。
[0017]實例1:APCTS_人VEGF-結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II CtaC融合抗原蛋白真核表達載體的構建
首先采用疊加PCR (overlapping PCR)的方法合成編碼該融合蛋白的DNA,具體方法如圖2所示。如無特殊說明，本發明中所有分子生物學實驗操作均按文獻操作:Green，M.R:Molecular cloning, A Laboratory Manual (4th) , Cold Spring Harbour Press, 2012。先合成四個寡聚核苷酸引物片段:(1) 5' ATGTTTTCTCGCATGACCTCGCTCATTATGGGTAACAACTTTCTGCTGTCTTGG 3，:(2)5' TGGCTCGCGAGGTGTCACCCGCCTCGGCTTGTCACATCT
3 ' ； (3 ) 5 ' ATCGCTCGAGCTAACCTACGGGCATCGG 3 ' ； ( 4 )
5,ACTGGGTACCATGGACTGGACCTGGATA CTGTTCCTGGTG GCC GCCGCCACACGGGTGCACAGCACCTCGCTCATTATGGGT 3'。引物(I)含有APCTS的編碼序列和人VEGF N端6個氨基酸殘基的編碼序列。引物(2)含有結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II N端6個氨基酸殘基的互補編碼序列和人VEGF的C端7個氨基酸殘基的互補編碼序列。引物(3)含有結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II C端6個氨基酸殘基的互補編碼序列和XhoI酶切位點，引物(4)含有人IgE重鏈信號肽編碼序列和KpnI酶切位點以及人VEGF的N端6個氨基酸殘基的編碼序列。
[0018]以含全長人VEGF cDNA的質粒為模板，進行第一輪PCR反應:
VEGF 質粒(I μ g/μ I) 1μ I
引物IΙμ?
引物21μ I
【權利要求】
1.一種用于制備抗原特異性抗體的融合抗原蛋白及其重組DNA編碼序列.其中所述的融合抗原蛋白具有: (1)信號肽序列:來源于人IgE重鏈信號肽序列； (2)能與小鼠FcrRII結合的多肽序列(見圖1):其序列為MFSRMTSUMGN ； (3)特異性蛋白抗原序列:即用于制備特異性抗體的抗原蛋白序列； (4)抗原輔助序列:該序列是結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II蛋白編碼序列。
2.在權利要求1所述的融合蛋白中， (5)特異性抗原蛋白序列可以在輔助序列結核分枝桿菌細胞色素C氧化酶亞基II蛋白的N端，也可以是在其C端.(6 )FcrR II結合多肽序列，可以在融合蛋白的C端，也可在信號肽之后而位于特異性抗原蛋白序列和輔助序列的上游。
3.權利要求2所述的融合抗原蛋白序列從N端到C端為:信號肽序列一FcrRII結合肽序列——特異性抗原蛋白序列——抗原輔助序列。
4.一種真核表達載體，其含有啟動子/增強子控制下的編碼權利要求1-3中任一項所述的融合抗原蛋白DNA序列。
5.用權利要求4所述的真核表達載體在小鼠進行DNA免疫以制備抗原特異性抗體，該抗體可以是多克隆抗體，也 可是用 雜交瘤技術或其它技術制備的單克隆抗體。
【文檔編號】C12N15/62GK103524625SQ201310437663
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】吳炯, 林峰 申請人:眾森源生物技術（江蘇）有限公司