一種裂殖壺菌菌株及其誘變方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種裂殖壺菌菌株及其誘變方法和應用。現有技術中，雖然有報道如何提高菌株中DHA含量，但往往考慮因素單一，并未綜合探索如何大幅提高菌株中DHA含量，這也是裂殖壺菌實現產業化的關鍵所在。本發明利用離子束誘變方法得到裂殖壺菌TC5-2，同時結合培養基和發酵工藝的優化，并添加外源因子烯草酮，大幅提高菌株中DHA含量，有利于實現裂殖壺菌生產DHA的產業化。
【專利說明】一種裂殖壺菌菌株及其誘變方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵領域，涉及一種裂殖壺菌菌株及其誘變方法和應用。

【背景技術】
[0002] 二十二碳六烯酸（DocosahexaenoicAcid，DHA)是哺乳動物生長所必需的多不飽 和脂肪酸的一種，但由于需從外界攝取，因而被稱為必需脂肪酸。研究表明，DHA對嬰幼兒 大腦和視力發育具有非常重要的生理作用，并具有預防及治療心血管疾病、防治老年癡呆、 抑制癌變等生理功能，因而廣泛用于食品、醫藥和飼料行業。
[0003] DHA的傳統來源為深海魚油，但存在率低、資源有限和純化工藝復雜等缺陷。海洋 微生物被認為是DHA最有前途的商業化來源，其中利用微藻(包括隱甲藻、真菌如裂殖壺菌 和破囊壺菌等）培養生產DHA具有更大的優勢和生產潛能，但普遍存在發酵藻粉產率低、月旨 肪酸中DHA含量不夠高的缺陷。微藻中裂殖壺菌發酵生產DHA的含量相對比較高，因此也 被認為是最有希望實現DHA產業化的微生物。
[0004] 目前國內外有關如何提高DHA含量的研究主要集中在以下幾方面：（1)尋找高產 DHA的新菌株；（2)改進發酵工藝；（3)優化培養基；（4)添加外源因子。如培育的海洋真菌 裂殖壺菌0UC88生產的DHA占總脂肪酸的含量提高到23%?44% ;在另一干法制取DHA微 藻油的方法的研究中，該方法可在1L發酵液中提取最高達27. 6g DHA ;在第三種提高DHA 含量的研究中，通過優化裂殖弧菌菌株發酵培養基，使裂殖弧菌產生的DHA占總脂肪酸含 量達到35% ;在第四種提高DHA含量的研究中，通過外源添加因子促進微生物合成DHA的方 法，該方法通過在培養基中添加一種以上乙酸、檸檬酸和辛伐他汀，使DHA占總脂肪酸含量 最商達到42. 65%。以上研究雖然都以提商菌株中脂肪酸的DHA含量為目的，但往往考慮因 素單一，并未綜合探索如何大幅提高菌株中DHA含量，使得生產DHA的工藝復雜、成本增加， 生產效率低，不利于實現裂殖壺菌生產DHA的產業化。


【發明內容】

[0005] 本發明實施例的目的在于提供一種能快速生長且高效合成DHA的裂殖壺菌 TC5-2。
[0006] 本發明實施例的另一目的是提供一種獲得裂殖壺菌TC5-2的誘變方法。
[0007] 本發明實施例的又一目的是提供一種裂殖壺菌TC5-2生產DHA的應用。
[0008] 為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：
[0009] 一種裂殖壺菌菌株，其分類名稱為裂殖壺菌（Schizochytrium limacinum)TC5_2， 并已于2013年3月12日保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO: M2013075。
[0010] 以及，一種裂殖壺菌TC5-2的誘變方法，包括以下步驟：
[0011] 將裂殖壺菌菌種擴大培養得到種子液，將所述種子液接種至裂殖壺菌無菌發酵培 養基中進行發酵培養，得對數生長期菌液；
[0012] 將所述對數生長期菌液制成菌膜，并利用能量為10?30keV的N+離子束采用 脈沖式對所述菌膜進行誘變處理，其中，所述誘變處理過程中的N+離子束的注入劑量為 50X 1017 ?200X 1017ions/cm2 ;
[0013] 將經誘變處理后的菌膜進行培養、篩選出DHA產量高的裂殖壺菌TC5-2。
[0014] 以及，上述裂殖壺菌株TC5-2或按照上述裂殖壺菌TC5-2的誘變方法獲得裂殖壺 菌TC5-2用于生產DHA的應用。
[0015] 上述新型的裂殖壺菌TC5-2繁殖能力強，且遺傳性能穩定，是高產DHA的理想菌 株。
[0016] 上述裂殖壺菌TC5-2的誘變方法中，通過N+離子束注入方式獲得最佳誘變菌株 TC5-2,該誘變方法簡單易實施，誘變所得菌株突變率高，遺傳性能穩定。
[0017] 上述裂殖壺菌株TC5-2用于生產DHA，其應用工藝簡單，條件易控，效率高，且能顯 著提高總脂肪酸和DHA的含量，有利于實現裂殖壺菌生產DHA的產業化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是本發明實施例裂殖壺菌TC5-2的誘變方法工藝流程圖；
[0019] 圖2是本發明實施例裂殖壺菌TC5-2的菌體形態圖。

【具體實施方式】
[0020] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于 限定本發明。
[0021] 本發明實施例提供一種裂殖壺菌菌株，其分類名稱為裂殖壺菌（Schizochytrium limacinum)TC5-2,并已于2013年3月12日保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號 為CCTCC NO :M2013075。該裂殖壺菌TC5-2的繁殖能力強，且遺傳性能穩定，是高產DHA的 理想菌株。
[0022] 相應地，本發明實施例還提供一種裂殖壺菌TC5-2的誘變方法，其誘變方法工藝 流程如圖1所示，該方法包括以下步驟：
[0023] S01.裂殖壺菌出發菌株的培養：以誘變前的裂殖壺菌為出發菌株，將出發菌種擴 大培養得到種子液，將所述種子液接種至裂殖壺菌無菌發酵培養基中進行發酵培養，得對 數生長期菌液；
[0024] S02.采用離子束誘變：在無菌條件下，將步驟S01中的對數生長期菌液制成菌膜， 并利用能量為10?30keV的N+離子束采用脈沖式對所述菌膜進行誘變處理，其中，誘變處 理過程中N+離子束的注入劑量為50X 1017?200X 1017ions/cm2 ;
[0025] S03.將經誘變后的菌膜進行培養、篩選處理：將步驟S02中誘變后的菌膜進行培 養、篩選出DHA產量高的裂殖壺菌TC5-2。
[0026] 上述步驟S01中，裂殖壺菌TC5-2的出發菌株可以選用已知的裂殖壺菌，優選來源 于廣西北海海灘紅樹林分離篩選所得的裂殖壺菌菌株。
[0027] 該步驟S01中，該裂殖壺菌無菌發酵培養基可以直接選用現有裂殖壺菌無菌發酵 培養基，優選為下述利用裂殖壺菌TC5-2生產DHA的方法中使用的無菌發酵培養基。通過 對現有的發酵培養基進行改進，本發明的裂殖壺菌無菌發酵培養基營養豐富，可促進細胞 的快速分裂和生長繁殖，顯著提高菌種的生長率和繁殖率。
[0028] 上述步驟S02中，采用氮離子束注入方式誘變菌種，致使裂殖壺菌發生變異，且隨 注入劑量的穩定增加，致死率也呈緩慢增長的趨勢，見表1所示。優選地，上述氮離子束注 入劑量可以是 50X 1017、100X 1017、150X 1017、200X 1017ions/cm2。
[0029] 上述步驟S03中，將經步驟S02離子束誘變處理的誘變菌種進行編號篩選。具體 篩選方法是將編號的誘變菌種進行擴大培養，比較各種誘變菌株生產DHA的含量，選出DHA 產率最高的誘變菌種。經篩選，發現裂殖壺菌TC5-2的DHA產率最高，高達46. 3%，因此選定 裂殖壺菌TC5-2為最佳菌株，其菌體形態如圖2所示。
[0030] 該步驟S03中，誘變菌種的擴大培養可以將該誘變菌種直接接種至上述S01中的 現有裂殖壺菌無菌發酵培養基進行擴大培養，優選直接接種至下述利用裂殖壺菌TC5-2生 產DHA的方法中使用的無菌發酵培養基進行擴大培養。
[0031] 由上所述，上述裂殖壺菌TC5-2的誘變方法中，通過N+離子束注入方式獲得最佳 誘變菌株TC5-2,該誘變方法簡單易實施，誘變所得菌株突變率高，遺傳性能穩定。
[0032] 相應地，本發明實施例還提供裂殖壺菌TC5-2的應用，具體是將裂殖壺菌TC5-2用 于生產DHA。
[0033] 在具體實施例中，利用裂殖壺菌TC5-2生產DHA的方法包括如下步驟：
[0034] 將上述裂殖壺菌TC5-2接種至裂殖壺菌無菌發酵培養基中進行擴大培養。
[0035] 作為優選實施例，上述裂殖壺菌無菌發酵培養基包括如下含量的組分：
[0036] 人造海水 500 ~ 650 g/L 大豆蛋白胨 25 ~ 35 g/L 酵母膏 35 ~ 45 g/L 葡萄糖 80 ~ 100 g/L 玉米漿 10-20 g/L 復合維生素溶液4~ 6 g/L。
[0037] 上述無菌發酵培養基的碳源為葡萄糖，氮源為玉米漿、大豆蛋白胨和酵母膏。除此 之外，培養基中還添加復配的人工海水，除利用海水中天然存在的無機鹽外，培養基另外再 通過添加人造海水以提供充足的P源、S源以及Mn 2+、Zn2+等離子，除保證一定的鹽度外，還 保持細胞的滲透壓平衡，并為細胞的生長繁殖提供了必需物質。
[0038] 在進一步優選實施例中，上述人造海水包含如下含量的組分：
[0039] NaCL 25 ~ 30g/L MgCl2 4 ~ 6 g/L KC1 0.5 ~1.5 g/L CaCl2 卜 2g，L NaHS04 5 ~ 7 g/L Na.CX), 7 ~ 9 g/L Na2S04 9 ~ 11 g/L MgS04 2 ~ 4 g/L MnS04 3 ~ 6 g/L KH2P04 3 ~ 5 g/L K2HP〇4 3 ~ 5 g/L ZnS〇4 2~4g/L。
[0040] 上述無菌發酵培養基還添加種類豐富的維生素。將各種功能不同的維生素混合 后，共同參與機體代謝的調節，從而適合更多的裂殖壺菌菌種生長，進一步促進裂殖壺菌中 DHA的積累。如本發明通過對比實驗，即不添加復合維生素(對比實施例2)時，其DHA含量 與添加復合維生素(實施例6 )相比，減少40. 7%，表明復合維生素提高裂殖壺菌TC5-2的DHA 含量。
[0041] 在進一步優選實施例中，上述復合維生素溶液包含如下含量的組分：
[0042] 維生素氏2~4g/L 維生素B2 9~ 11 g/L 維生素B5 7~9g/L 維生素B6 3 ~ 5 g/L 維生素PP 9 ~丨丨g/L 生物素 丨0 ~ 14 g/L 葉酸 40 ~ 50 g/L 肌醇 3~5g/L。
[0043] 另外，上述培養基中還添加10?30 mol/L外源因子烯草酮。
[0044] 該培養基中加入微量的烯草酮后，能有效提高裂殖壺菌TC5-2中脂肪酸和DHA含 量的積累。與不添加烯草酮(對比實施例3)相比，添加烯草酮（實施例6)的菌株DHA含量 增加48. 33%，表明烯草酮對裂殖壺菌DHA合成有促進作用，能顯著提高裂殖壺菌中DHA的含 量。
[0045] 作為優選實施例，上述擴大培養的條件可以按照其他裂殖壺菌常規的培養條件進 行擴大培養。但是為了提高DHA的產率和效率，在優選實施例中，該擴大培養的條件為：在 前40小時內溫度為21-25°C，然后溫度控制為15-20°C。
[0046] 在進一步優選實施例中，上述擴大培養過程中的通氣量為0. 5?2. Ovvm，且該擴 大培養在氣升式反應器中進行。
[0047] 這樣，上述擴大培養優選先在較高的培養溫度下提高細胞濃度，然后降低溫度以 積累DHA ;同時，本發明優選使用氣升式反應器顯著降低機械攪拌對菌體生長的抑制，便于 DHA的積累。另外，通入一定量的空氣有助于提高培養基中氧濃度，有利于異養需氧型的裂 殖壺菌的生長和繁殖。
[0048] 由上所述，上述裂殖壺菌TC5-2不僅經優化處理的無菌發酵培養基培養，同時添 加外源因子烯草酮，并結合優化的發酵工藝進行DHA的工業化生產，培養條件考慮全面，應 用工藝簡單，條件易控，效率高，且能顯著提高總脂肪酸和DHA的含量，有利于該菌株及其 應用工藝的大力推廣。
[0049] 現以裂殖壺菌TC5-2的誘變、篩選以及生產DHA的方法為例，對本發明實施例進行 進一步詳細說明。
[0050] 實施例1
[0051] 裂殖壺菌TC5-2的誘變，包括以下步驟：
[0052] S11.裂殖壺菌的培養：以誘變前的裂殖壺菌(廣西北海海灘紅樹林分離篩選所 得的裂殖壺菌株）為出發菌株，挑選出發菌株的單菌落，在10mL液體無菌發酵培養基(無 菌發酵培養基包含的成分為：人造海水600g/L ;大豆蛋白胨30g/L ;酵母膏40g/L ;葡萄 糖90g/L ;玉米漿15g/L ;復合維生素溶液5g/L ;烯草酮20 y mol/L。其中，人造海水配方 為：NaC128g/L、MgCl25g/L、KCllg/L、CaCl 2l. 5g/L、NaHS046g/L、Na2C038g/L、Na2S0 410g/L、 MgS043g/L、MnS045g/L、KH 2P044g/L、K2HP047g/L、ZnS0 43g/L ;復合維生素溶液配方為：維生素 BJg/L、維生素B210g/L、維生素B58g/L、維生素B 64g/L、維生素PP10g/L、生物素12g/L、葉酸 45g/L、肌醇4g/L。）試管中，25°C和150r/min條件下振蕩培養36小時后，以10%接種量接 種到裝有50mL發酵培養基（同上）的三角瓶中，25°C和150r/min條件下振蕩培養36小時， 即得對數生長期菌液；
[0053] S12.離子束誘變：在無菌條件下，往每個滅菌的空平皿里加入lmL上述對數生長 期菌液，涂勻制成菌膜，將能量為20keV的N+離子束以雙等離子體源脈沖式注入由對數生 長期菌液制成的菌膜中，其中注入劑量為下文表1中實施例1的劑量。
[0054] 實施例2
[0055] 裂殖壺菌TC5-2的誘變，該誘變參照實施例1的誘變步驟，其中，在S12的離子束 誘變步驟中，雙等離子體源脈沖式注入由對數生長期菌液制成的菌膜中，注入劑量為下文 表1中實施例2的劑量。
[0056] 實施例3
[0057] 裂殖壺菌TC5-2的誘變，該誘變參照實施例1的誘變步驟，其中，在S12的離子束 誘變步驟中，雙等離子體源脈沖式注入由對數生長期菌液制成的菌膜中，注入劑量為下文 表1中實施例3的劑量。
[0058] 實施例4
[0059] 裂殖壺菌TC5-2的誘變，該誘變參照實施例1的誘變步驟，其中，在S12的離子束 誘變步驟中，雙等離子體源脈沖式注入由對數生長期菌液制成的菌膜中，注入劑量為下文 表1中實施例4的劑量。
[0060] 將實施例1-4誘變處理后的菌膜進行致死率的測定，測定結果如表1所述：
[0061] 表 1
[0062]

【權利要求】
1. 一種裂殖壺菌菌株，其分類名稱為裂殖壺菌（Schizochytriumlimacinum)TC5-2， 并已于2013年3月12日保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNO: M2013075。
2. 裂殖壺菌TC5-2的誘變方法，包括以下步驟： 將裂殖壺菌菌種擴大培養得到種子液，將所述種子液接種至裂殖壺菌無菌發酵培養基 中進行發酵培養，得對數生長期菌液； 將所述對數生長期菌液制成菌膜，并利用能量為10?30keV的N+離子束采用脈沖式對 所述菌膜進行誘變處理，其中，所述誘變處理過程中的N+離子束的注入劑量為50XIO17? 200X1017ions/cm2 ； 將經誘變處理后的菌膜進行培養、篩選出二十二碳六烯酸產量高的裂殖壺菌TC5-2。
3. 如權利要求2所述的裂殖壺菌TC5-2的誘變方法，其特征在于：所述無菌發酵培養 基包括如下組分： 人造海水 500 ~ 650g/L 大豆蛋白胨 25~35g/L 酵母膏35~45g./L 葡萄糖 80 ~ 100g/L 玉米漿 10 ~ 20g/L 復合維生素溶液4 ~ 6g/L。
4. 如權利要求3所述的裂殖壺菌TC5-2的誘變方法，其特征在于：所述人造海水配方 包括以下組分： NaCI 25 ~ 30g/LMgCl2 4 ~ 6g，L KCl 0.5 ~ 1.5g/LCaCl2I~ 2g/L NaHSO4 5 ?7g/LNa2CO3 7 ~ 9g/L Na2SO4 9 ~ 11g/LMgSO4 2 ~ 4g/L MnSO4 3 ~ 6g/LKH2PO4 3 ~ 5g/L K2HPO4 3 ~ 5g/LZnSO4 2 ~ 4g/U
5. 如權利要求3或4所述的裂殖壺菌TC5-2的誘變方法，其特征在于，所述復合維生素 溶液配方包括以下組分： 維生素B1 2 ~ 4g/L 維生素B2 9 ~ 11g/L 維生素B5 7 ~9g/L 維生素B6 3 ~ 5g/L 維生素PP 9 ~ 11g/L 生物素 10 ~ 14g/L 葉酸 40 ~ 50g/L肌醇 3 ~ 5g/L。
6. 如權利要求5所述的裂殖壺菌TC5-2的誘變方法，其特征在于，所述裂殖壺菌無菌發 酵培養基中還添加有外源因子烯草酮，含量為10?30μmol/L。
7. 如權利要求1所述的裂殖壺菌株TC5-2或如權利要求2?6任一所述的裂殖壺菌 TC5-2的誘變方法獲得裂殖壺菌TC5-2用于生產二十二碳六烯酸。
8. 如權利要求7所述的裂殖壺菌株TC5-2的應用，其特征在于：所述裂殖壺菌TC5-2用 于生產二十二碳六烯酸的方法包括如下步驟： 將所述裂殖壺菌TC5-2接種至如權利要求2?6任一所述的裂殖壺菌無菌發酵培養基 中進行擴大培養。
9. 如權利要求8所述的裂殖壺菌株TC5-2的應用，其特征在于：所述擴大培養的條件： 在前40小時內溫度為21?25°C，然后溫度控制為15?20°C。
10. 如權利要求8或9所述的裂殖壺菌株TC5-2的應用，其特征在于，所述的擴大培養 在氣升式反應器中進行，通氣量為〇. 5?2.Ovvm。
【文檔編號】C12P7/64GK104450529SQ201310443058
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月25日 優先權日:2013年9月25日
【發明者】郭星, 梁世中 申請人:郭星