一株不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株。本發明所提供的不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株具體為黃曲霉（Aspergillus?flavus）GZ-17，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.8050。實驗證明，本發明所提供的黃曲霉菌株GZ-17對產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株產毒有抑制作用，在該菌株與產毒菌的孢子濃度比為105:105時，該不產毒菌對產毒菌的抑制產毒率達到近96%。該菌株對于抑制產毒黃曲霉侵染農產品、降低農產品中黃曲霉毒素污染具有重要意義。
【專利說明】一株不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于農產品安全領域，涉及一株不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株，以及該菌株在抑制黃曲霉產毒方面的應用。
【背景技術】
[0002]黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)—類主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等真菌產生的次級代謝產物,現已分離出AFB1、AFB2、AFG1、
18種不同結構的黃曲霉毒素，其中最重要的是AFBpAFByAFGpAFGy在我國，黃曲霉毒素主要由黃曲霉產生。黃曲霉毒素具有致癌、致畸、致細胞突變的作用，被世界衛生組織(WHO)認定為一級致癌物，嚴重影響人類健康，其中AFB1的毒性最強，其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍。黃曲霉毒素主要污染花生等作物，嚴重影響我國花生及其制品的出口，給我國的出口貿易帶來了巨大損失。因此，有效防控黃曲霉毒素污染，對于保障我國食品安全和維護國家經濟利益具有重要意義。
[0003]其中，利用不產毒黃曲霉或寄生曲霉來抑制產毒菌菌群數量及產毒量是防控黃曲霉毒素污染的重要手段。美國環境保護協會注冊了兩株不產毒的黃曲霉菌株，用于防治棉花和花生黃曲霉毒素污染，并在美國多個州的試驗田中廣泛試用。但是來自不同地區的不產毒菌株在抑制產毒菌方面有一定的適用范圍，例如非洲篩選獲得的不產毒菌能較好地抑制當地黃曲霉產毒，而美國篩選得到的菌株在抑制非洲產毒黃曲霉產毒方面就沒有很好的效果。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是一株不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株，以及該菌株在抑制黃曲霉產毒方面的應用。
[0005]本發明提供的黃曲霉菌株具體為黃曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17。該菌株已于2013年8月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC N0.8050。
[0006]所述黃曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050缺失黃曲霉毒素合成基因aflT、黃曲霉毒素合成基因pksA、黃曲霉毒素合成基因nor-Ι、黃曲霉毒素合成基因fas-2、黃曲霉毒素合成基因fas-Ι、黃曲霉毒素合成基因aflR、黃曲霉毒素合成基因aflj、黃曲霉毒素合成基因adhA、黃曲霉毒素合成基因estA、黃曲霉毒素合成基因norA、黃曲霉毒素合成基因ver-Ι、黃曲霉毒素合成基因verA ;因此,該菌株不能合成黃曲霉毒素。其中，ver-Ι和verA這兩個基因，它們是黃曲霉毒素合成`必須基因，是4種黃曲霉毒素(B1、B2、GpG2)最終形成的最關鍵的兩個基因。
[0007]所述黃曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050在抑制產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒中的應用也屬于本發明的保護范圍。[0008]一種用于抑制產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒的菌劑，它的活性成分為所述黃曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050。
[0009]在上述應用或菌劑中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17CGMCC N0.8050可為分生孢子或/和菌絲體。
[0010]在上述應用或菌劑中，所述抑制產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒體現在:使所述產黃曲霉毒素的黃曲霉的產毒素量降低，具體如使所述產黃曲霉毒素的黃曲霉在農產品中的產毒量降低。
[0011]所述農產品可為谷物、油料作物、堅果、香辛料、飼料原料、中草藥和水果等。在本發明的一個實施例中，所述農產品為花生，具體為含水量20% (質量百分含量)的花生。
[0012]在上述應用中，在抑制所述產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒的過程中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050與所述產黃曲霉毒素的黃曲霉的孢子個數比為 1:10 至 10:1 (如 1:1-10:1，具體如 1:10 或 1:1 或 10:1)。
[0013]在本發明的一個實施例中，在抑制所述產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒的過程中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17CGMCC N0.8050的孢子、所述產黃曲霉毒素的黃曲霉的孢子和所述花生的配比為(5X IO3~5X IO5)個孢子:5X104個孢子:5g花生。另外，在抑制所述產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒的過程中，培養條件為30°C，培養14天。
[0014]在上述應用或菌劑中，所述產黃曲霉毒素的黃曲霉具體可為黃曲霉(Aspergi I Iusflavus) GD-1。
[0015]在上述應用或菌劑中，所述不產黃曲霉毒素具體為至少不產黃曲霉毒素B2, G1和G20
[0016]以上所有的所述產毒中 的“毒”均指“黃曲霉毒素”，進一步為“黃曲霉毒素B1 ”。
[0017]所述黃曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050在制備所述菌劑中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0018]所述黃曲霉(Aspergillusflavus) GZ-17CGMCC N0.8050 在生產分生孢子或 / 和菌絲體中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0019]本發明的黃曲霉菌株GZ-17的菌落形態與普通黃曲霉相似，但不合成黃曲霉毒素；其不產毒素的機制是:該菌株的毒素合成基因從基因aflT到合成基因verA出現缺失，verA基因到最后一個毒素合成基因hypA之間的基因是完整的。
[0020]實驗證明，本發明的黃曲霉菌株GZ-17對產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株產毒有抑制作用，在該菌株與產毒菌的孢子濃度比為IO5:1O5時，該不產毒菌對產毒菌的抑制產毒率達到近96%。該菌株對于抑制產毒黃曲霉侵染農產品、降低農產品中黃曲霉毒素污染具有重要意義。
[0021]保藏說明
[0022]囷種名稱:黃曲霉
[0023]拉丁名:(Aspergillusflavus)
[0024]菌株編號:GZ-17
[0025]保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0026]保藏機構簡稱:CGMCC
[0027]地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號[0028]保藏日期:2013年8月21日
[0029]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.8050
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為黃曲霉毒素BpByGpG2混合標準品(LB96951)的UPLC圖譜。其中，I為黃曲霉毒素標準品中AFG2，保留時間為1.273min ；2為黃曲霉毒素標準品中AFG1，保留時間為
1.483min ；3為黃曲霉毒素標準品中AFB2，保留時間為1.720min ；4為黃曲霉毒素標準品中AFB1，保留時間為2.057min。
[0031]圖2為菌株GZ-17的UPLC圖譜。
[0032]圖3為黃曲霉菌株GZ-17毒素合成基因缺失示意圖。
[0033]圖4為黃曲霉菌株GZ-17的平板菌落形態。
[0034]圖5為黃曲霉菌株GZ-17對產黃曲霉毒素的黃曲霉菌GD-1的競爭菌落圖。其中，A 為 GZ-17:⑶-1 (IO4:1O5) ；B 為 GZ_17:GD_1 (105:1O5) ；C 為 GZ_17:GD_1 (106:1O5)。
[0035]圖6為黃曲霉毒素BI標準品的UPLC圖譜。其中，I即為黃曲霉毒素B1標準品。
[0036]圖7為單獨產黃曲霉毒素的黃曲霉菌⑶-1的UPLC圖譜。其中，I為目的洗脫峰。
[0037]圖8為GZ-17:⑶-1(106:1O5)的UPLC圖譜。其中，I為目的洗脫峰。
【具體實施方式】
`[0038]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0039]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0040]產黃曲霉毒素的黃曲霉菌GD-1:記載于 “Chu-Shu Zhang, Fu-Guo Xing, JonathanNimal Selvaraj et al.The effectiveness of ISSR profiling for studying geneticdiversity of Aspergillus flvcus from peanut-cropped soils in China.BiochemicalSystematics and Ecology50 (213): 147-153” 一文。
[0041]黃曲霉毒素G2混合標準品(LB96951):購于SUPELC0公司。
[0042]黃曲霉毒素B1標準品(LB88848):購于SUPELC0公司。
[0043]黃曲霉毒素B1的Elisa酶聯免疫法試劑盒(HEM0396/HEM0348):購于北京華安麥科生物技術有限公司。試劑盒自帶AFB1酶標物、AFB1抗試劑、底物液A液、底物液B液等相關試劑。
[0044]實施例1、黃曲霉菌株GZ-17的采集、分離、鑒定
[0045]一、從花生種植土壤中分離黃曲霉菌株GZ-17
[0046]從廣東花生種植土壤中用DG18培養基分離黃曲霉菌株。具體操作如下:
[0047]1、土壤樣品菌懸液的制備
[0048]取IOg 土樣，加入90mL0.1%蛋白胨無菌水(w/v)，在室溫震蕩30min，制成10—1菌懸液；再取0.SmLKT1菌懸液加4.5mL0.1%蛋白胨無菌水，制備出10_2稀釋度的菌懸液；按上述方法制備10_3稀釋度的菌懸液。
[0049]2、菌株的分離與純化
[0050]每個稀釋度取0.1mL菌液，涂布在DG18培養基(配方:酪蛋白胨5.0g，無水葡萄糖
10.0g,磷酸二氫鉀1.0g,硫酸鎂0.5g，氯硝胺0.002g,瓊脂15.0g,氯霉素0.lg，用蒸餾水1000mL溶解，再加入200.0g的甘油，混勻，121°C滅菌。)上，30°C黑暗培養5d，每個稀釋度重復3次。挑取長有黃色孢子的菌株在DG18培養基上進行二次劃線分離，直至得到單個菌落。挑取單個菌落于MEA斜面試管培養基(配方:每升培養基中含有麥芽浸粉30.0g，大豆蛋白胨3.0g，瓊脂15.0g ；pH5.8)上，于30°C培養3d后保存于4°C中。將其中一株菌記為GZ-17。
[0051]二、菌株GZ-17的鑒定
[0052]1、形態學鑒定
[0053]挑取保存于MEA培養基上的菌株GZ-17于AFPA培養基(配方:蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉20.0g/L,檸檬酸鐵銨0.5g/L，氯硝銨0.002g/L,氯霉素0.lg/L，瓊脂15.0g/L, pH為
6.3)上，30°C培養3-5d，可見AFPA培養基背面為亮橘色。
[0054]2、分子鑒定
[0055]通過真菌鈣調基因序列對菌株GZ-17進行分子鑒定(Rodrigues, P., Santos, C.,Venancioj A., Lima, N., 2011.Species identification of Aspergillus section Flaviisolates from Portuguese almonds using phenotypic, including MALD1-T0F ICMS，andmolecular approaches.J Appl Microbiol 111877-892 )D 黃曲霉基因組鈣調蛋白 PCR 擴增所用的引物為CLl和CL2A (序列如下)。PCR擴增反應程序為:94°C預變性5min，I個循環；94。。變性30s，54。。退火30s，72。。延伸90s，共30個循環；72°C最后延伸7min0擴增后，產物保存于4°C。產物送至上海生工生物工程有限公司測序。并在BLASTresearches上比對測序結果(http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/)。
[0056]CLl:5，-GARTWCAAGGAGGCCTTCTC-3，；
[0057]CL2A: 5，-TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3，。
[0058]菌株GZ-17的PCR擴增產物的測序結果如序列表中序列I所示。將菌株GZ-17的鈣調蛋白基因的測序結果提交上NCBI上進行比對，發現，其與黃曲霉菌NRRL3357和NRRL21882的同源性均為99%。
[0059]經過以上形態學鑒定和分子鑒定，可知菌株GZ-17為黃曲霉(Aspergillusflavus)。
[0060]3、利用超高效液相色譜法檢測菌株GZ-17是否產黃曲霉毒素[0061 ] (I)待測樣品制備
[0062]將菌株GZ-17接種于MEA斜面試管培養基上，28°C培養5天，將5ml無菌生理鹽水加入MEA斜面試管培養基，沖洗，得菌懸液。將菌懸液加入50ml的試管中，再加入IOml的培養液(150g蔗糖/L，20g酵母提取物/L，IOg大豆蛋白胨/L，pH5.9)，30°C培養5天。將液體發酵液用濾紙過濾，取Iml濾液加入到免疫親和柱(VICAM，G1010)中(使黃曲霉毒素掛到柱子上，從而有效去除雜質)，待液體排干后，用蒸餾水或去離子水洗滌2次，每次10mL，流速2~3d/s ;待液體排干后，上樣ImL甲醇，用樣品瓶接洗脫液，洗脫后液體即為待測樣品，用于UPLC檢測。
[0063](2)超高效液相色譜法檢測待測樣品
[0064]取黃曲霉毒素B2, G1, G2混合標準品(LB96951 )，用甲醇配制成溶液，再取步驟(I)制備的待測樣品，分別按照如下條件進行超高效液相色譜檢測。看待測樣品的色譜圖在與黃曲霉毒素標準品相同的保留時間處是否有色譜峰出現。[0065]其中，超高效液相色譜的條件如下:色譜柱:C18色譜柱(50mmX2.1mm, 1.7 μ m)；檢測器:熒光檢測器ACQUITY型，激發波長365nm，發射波長:440nm ;柱溫:40°C;流動相:甲醇:水(45:55，體積比)，輔以甲醇(色譜級純甲醇)用于清洗；進樣量:10μ L ;流速:0.2mL/
mirio
[0066]黃曲霉毒素BpB^GpG2混合標準品(LB96951)的UPLC圖譜如圖1所示，從圖1中可以看出，黃曲霉毒素標準品中AFB1的保留時間為2.057min，AFB2的保留時間為1.720min,AFG1的保留時間為1.483min, AFG2的保留時間為1.273min。菌株GZ-17的UPLC圖譜如圖2所示，從圖2中可以看出，在與黃曲霉毒素標準品對應的以上四個保留時間處均沒有色譜峰產生。由此可見，菌株GZ-17不產黃曲霉毒素。
[0067]通過以上鑒定結果，確定步驟二所得的菌株GZ-17為不產生黃曲霉毒素的黃曲霉(Aspergillus flavus),并對其進行了保藏,保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期為:2013年8年21日，保藏號:CGMCC N0.8050。
[0068]實施例2、黃曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17CGMCC N0.8050 中黃曲霉毒素合成
基因缺失鑒定
[0069]本發明的發明人以Genbank登錄號為AY510451黃曲霉的毒素合成基因的序列為參照，設計了毒素合成相關基因hypB、hypC、hypD和hypE四對引物，其他基因的引物參考 Perng-Kuang Chang (Chang, P.K., Horn, B.ff.and Dorner, J.ff.(2005)Sequencebreakpoints in the afl atoxin biosynthesis gene cluster and flanking regions innonaflatoxigenic Aspergillus flavus isolates.Fungal Genet Bio42, 914 - 923.X 待測的29個基因及其對應的引物序列如表1所示。
[0070]表1不同黃曲霉毒素合成基因的引物序列
[0071]
【權利要求】
1.不產黃曲霉毒素的黃曲霉(Aspergillusflavus) GZ-17,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8050。
2.權利要求1所述的黃曲霉(Aspergillusflavus)GZ_17CGMCC N0.8050在抑制產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒中的應用。
3.一種用于抑制產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒的菌劑，它的活性成分為權利要求1所述的黃曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050。
4.根據權利要求2所述的應用或權利要求3所述的菌劑，其特征在于:所述黃曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050 為分生孢子或 / 和菌絲體。
5.根據權利要求2-4中任一所述的應用或菌劑，其特征在于:所述抑制產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒體現在:使所述產黃曲霉毒素的黃曲霉的產毒量降低。
6.根據權利要求2-5中任一所述的應用，其特征在于:在抑制所述產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒的過程中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17CGMCC N0.8050與所述產黃曲霉毒素的黃曲霉的孢子個數比為1:10至10:1。
7.根據權利要求2-6中任一所述的應用或菌劑，其特征在于:所述產黃曲霉毒素的黃曲霉為黃曲霉(Aspergillus flavus)⑶-1。
8.權利要求1所述的黃曲霉(Aspergillusflavus)GZ_17CGMCC N0.8050在制備權利要求3-7中任一所述菌劑中的應用。
9.權利要求1所述黃曲霉(Aspergillusflavus)GZ_17CGMCC N0.8050在生產分生孢子或/和菌絲體中的應用。
【文檔編號】C12N1/14GK103509723SQ201310445854
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月25日 優先權日:2013年9月25日
【發明者】劉陽, 魏丹丹, 周露, 張初署, 邢福國, 趙月菊, 王龑 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所