含BMP-2和ZsGreen1基因的表達載體及其構建方法
【專利摘要】本發明適用于生物【技術領域】，涉及一種含BMP-2和ZsGreen1基因的表達載體及其構建方法。該構建方法包括：通過PCR方法將BMP-2基因擴增，得擴增產物；利用XhoI和BamHI酶將擴增產物和pIRES2-ZsGreen1載體分別進行雙酶切處理，將所得雙酶切產物進行粘性末端連接，其中所述BMP-2基因擴增使用的引物對為SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。本發明還提供由該構建方法制備的含BMP-2和ZsGreen1基因的表達載體。該表達載體能同時表達BMP-2和ZsGreen1，并且兩種蛋白的空間構象和功能不會相互影響。
【專利說明】含BMP-2和ZsGreenI基因的表達載體及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及BMP-2表達載體及其構建，尤其涉及一種含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體及其構建方法。
【背景技術】
[0002]骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)包括一系列結構和功能相似的多肽，其中BMP-1是骨生長調節因子并屬于金屬肽鏈內切酶家族，其余BMP均屬于轉化生長因子TGF-β超家族。ΒΜΡ-2是目前研究最為廣泛、誘導成骨活性最強的BMP之一。ΒΜΡ-2具有誘導未分化的間充質干細胞向成軟骨細胞和成骨細胞定向分化與增殖的能力，并具有促進成骨細胞分化成熟功能，并參與骨和軟骨的生長發育及重建過程。ΒΜΡ-2蛋白質在細胞和動物體內的分布和定位，是目前在分子和細胞水平上研究ΒΜΡ-2促進骨折愈合和骨組織修復的熱點。
[0003]目前，在目標蛋白的定位技術方面的研究已經取得很多進展，不同的靶向蛋白的定位技術的原理也各不相同。目前用于ΒΜΡ-2蛋白定位的方法主要有免疫熒光定位、構建融合蛋白載體和免疫膠體金標記法等。其中免疫熒光定位方法主要利用抗原與抗體相互結合的原理，該方法主要步驟為:首先將ΒΜΡ-2抗體標記上特定的熒光素制成抗體標記物，然后利用該抗體標記物作為探針，將其與細胞或者動物體內的ΒΜΡ-2抗原進行結合，利用熒光顯微鏡觀察，其中熒光素受照射發出各種熒光，從而可以確定ΒΜΡ-2蛋白的定位和性質。而構建融合蛋白載體王要步驟為:構建能表達含有綠色滅光蛋白和目的蛋白相互連接的融合蛋白的載體，并使其在動物或者細胞體內進行表達，通過在熒光顯微鏡下進行觀察，進行靶蛋白的定位。免疫膠體金標記法中，當用金顆粒標記的抗體與抗原反應時，在光鏡下呈現鮮艷的櫻紅色，從而獲得抗原的定位信息。
[0004]在現有技術中，免疫熒光定位方法對儀器的要求比較高，并且結果不能長期保存。而對于現有技術中的構建融合蛋白載體方法，由于兩個不同的基因相互連接，在翻譯成蛋白的時候兩個蛋白之間的空間構象極易發生改變而無法正確折疊，從而使熒光蛋白或者靶蛋白失去活性而無法達到定位或者對靶蛋白進行功能研究的目的。免疫膠體金標記法成本高，需要較大直徑的金顆粒(40-50nm)才能獲得較高的靈敏度，同時耗費抗體量較多，檢測過程中需要較高濃度的標記物，并且當金顆粒過大時，標記物不穩定，長期貯存容易發生自動聚集。因此需要開發一種簡便快速成本低的BMP-2蛋白定位檢測方法。

【發明內容】

[0005]本發明實施例的目的在于提供一種含形態發生蛋白(BMP-2)和ZsGreenl基因的表達載體及其構建方法，旨在解決現有技術中BMP-2蛋白定位成本高效果不好的問題。
[0006]本發明實施例是這樣實現的，一種含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體構建方法，包括:
[0007]S01.通過PCR方法將BMP-2基因擴增，得擴增產物；[0008]S02.將該擴增產物和pIRES2_ZsGreenl載體分別利用XhoI和BamHI酶進行雙酶切處理，將所得含BMP-2基因的雙酶切產物和含ZsGreenl基因的雙酶切產物進行粘性末端連接，
[0009]其中所述通過PCR方法將BMP-2基因擴增時使用的引物對為:SEQ ID NO:1和SEQID NO:2。
[0010]本發明實施例還提供利用本發明的方法構建的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體。
[0011]本發明實施例還提供本發明的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體用于誘導骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞的應用，該應用包括將該表達載體轉染至骨髓間充質干細胞的步驟。
[0012]本發明實施例米用了含有IRES序列的突光報告載體,構建了能夠同時表達非融合的BMP-2蛋白和ZsGreenl綠色熒光蛋白的熒光報告載體，該載體可同時表達上述兩種蛋白，并且使得兩種蛋白的空間構象和功能不會相互影響。因此通過該載體的表達可利用ZsGreenl綠色熒光蛋白對BMP-2蛋白表達和分泌進行亞細胞定位。該表達載體可以應用于動物體內的研究中，可利用該表達載體實時觀察檢測BMP-2在動物體內不同組織表達分布情況。該表達載體的構建，將更有利于探索BMP-2基因在骨折愈合、骨修復等方面的機制研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發明實施例中使用的pIRES2-ZsGreenl載體的序列位點及雙酶切位點示意圖；
[0014]圖2是本發明實施例2中將表達載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2轉染至C0S-1細胞系后的顯微鏡下觀測圖片；
[0015]圖3是本發明實施例2中pIRES2-ZsGreenl-BMP-2轉染細胞后經流式細胞儀檢測的轉染效率圖；
[0016]圖4為本發明實施例2中pIRES2-ZsGreenl-BMP-2轉染細胞后PCR檢測結果電泳圖。
【具體實施方式】
[0017]為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0018]本發明實施例提供一種含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體構建方法，包括:
[0019]S01.通過PCR方法將BMP-2基因擴增，得擴增產物；
[0020]S02.利用XhoI和BamHI酶將所得擴增產物和pIRES2_ZsGreenl載體分別進行雙酶切，得到兩種目的雙酶切產物，將含BMP-2目的基因的雙酶切產物和含ZsGreenl基因的表達載體雙酶切產物進行粘性末端連接，
[0021 ] 其中步驟SOI中對BMP-2基因擴增的PCR方法中使用的弓丨物對為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，具體序列為:[0022]上游引物:5’-CCGCTCGAGACCATGGTGGCCGGGACCCGCT-3，, SEQ ID NO:1，
[0023]下游引物:5’-CGCGGATCCCTAGCGACACCCACAACCCTCCA-3，, SEQ ID NO:2，
[0024]其中上游引物中包含了 Xho I酶切位點，在SEQ ID NO:1中用下劃線標注；下游引物中包含了 BamH I酶切位點，在SEQ ID NO:2中用下劃線標注。
[0025]本發明實施例中使用的BMP-2基因為完整BMP-2編碼基因，包括N端的信號肽、中間的前肽和C端的成熟肽序列，以發揮BMP-2的全部功能。BMP-2在體內以前體形式合成，經蛋白酶切去除信號肽和前肽，得到由114個氨基酸殘基組成的成熟肽。成熟肽通過7對二硫鍵將其保守結構正確折疊。
[0026]具體地，本發明實施例中BMP-2基因插入位點，即XhoI和BamHI雙酶切位點，位于ZsGreenl基因序列上游并與該ZsGreenl基因序列間隔一定序列，如圖1所不。圖1顯不了載體pIRES2-ZsGreenl的序列位點示意圖,其中Xho I酶切識別位點自613位開始，BamHI酶切識別位點自660位開始。雙酶切處理后，回收較大的載體序列與上述PCR反應產物的雙酶切產物連接。將兩種基因序列間隔開，使得兩者形成非融合性表達，各自獨立表達并發揮作用，并且不會相互影響。
[0027]具體地，上述粘性末端連接過程中可使用E.coli DNA連接酶或者T4DNA連接酶，優選使用T4DNA連接酶。
[0028]具體地，上述BMP-2基因擴增的PCR反應條件為:
[0029]94-95 0C 預變性 2-3 分鐘，
[0030]97-98°C變性 10`-12 秒，55_56°C退火 30-40 秒，68_70°C延伸 90-120 秒，擴增 25-30個循環，
[0031]70_72°C充分延伸 10-12 分鐘。
[0032]具體地,上述PCR反應后需進行回收純化目的DNA序列的操作。該操作用于獲得純度較高的目的DNA片段，便于后續操作的順利進行。
[0033]具體地，上述粘性末端連接操作中，含BMP-2目的基因的雙酶切產物與含ZsGreenl基因的表達載體雙酶切產物的DNA含量摩爾比為3-6: I。該用量可獲得較好的連接效果。
[0034]另一方面，本發明實施例還提供根據本發明的表達載體構建方法制備的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體，該表達載體可同時表達BMP-2基因和ZsGreenl基因，兩者可各自發揮作用并且不會相互影響。
[0035]另一方面，本發明實施例還提供本發明制備的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體用于誘導骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞的應用，該應用包括將本發明實施例的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體轉染至骨髓間充質干細胞中的步驟。
[0036]具體地，將本發明構建的雙表達載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2轉染至骨髓間充質干細胞之后，可通過BMP-2誘導該骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化。因此本發明構建的雙表達載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2還可用于治療骨損傷、促進骨愈合等方面的應用。在骨損傷治療領域，骨髓間充質干細胞逐漸成為骨組織工程良好的種子細胞。骨髓間充質干細胞作為體外轉染基因治療的靶細胞具有以下優點:來源充足、采集簡便，有絲分裂能力強、易于擴大培養，有較強的成骨潛能并對多種骨生長因子有良好的反應性等，因此本發明的雙表達載體具有廣泛的應用前景。同時本發明的雙表達載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2也可用于制備治療骨損傷及促進骨愈合的藥物。
[0037]另一方面，本發明構建的雙表達載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2還可用于骨形成蛋白2(BMP-2)基因轉染骨髓間充質干細胞促進骨愈合的研究，即將BMP-2轉染至骨髓間充質干細胞后促進骨愈合的理論研究上有輔助作用。
[0038]本發明實施例中使用的表達載體中，ZsGreenl是來源于Anthozoa珊瑚綱的具有明亮熒光的四聚體綠色熒光蛋白質，特別適合作為報告基因，其熒光強度大約是普通的綠色熒光蛋白EGFP的2.5倍。同時熒光報告載體含有IRES序列，可以使綠色熒光蛋白ZsGreenl和BMP-2基因共同表達而不形成融合蛋白，不影響兩種蛋白的生物學功能，具有靈敏度高、易檢測、對細胞組織不具破壞性；并且在動物體內進行表達不受生物類型、細胞和組織類型的限制，也不需任何底物和輔助因子參與，直接觀察；便于早期篩選轉基因材料。
[0039]以下通過具體實施例對本發明進行詳細描述。
[0040]實施例lpIRES2-ZsGreenl-BMP_2 表達載體構建
[0041]1.BMP-2目的某閔的擴增與鈍化
[0042]引物設計與合成:設計骨形態發生蛋白2(BMP-2)的擴增引物，其中上游引物:5，-CCGCTCGAGACCATGGTGGCCGGGACCCGCT-3，(SEQ ID NO:1)，下劃線部分為 Xho I 酶切位占.[0043]下游引物:5，-CGCGGATCCCTAGCGACACCCACAACCCTCCA-3，(SEQID NO:2)，下劃線部分為BamH I酶切位點。
[0044]該引物對由上海生工生物工程股份有限公司合成。以本實驗室擁有的插入完整的人骨形態發生蛋白2(BMP-2)的pC1-neo-BMp-s質粒為模板，采用上述引物進行PCR擴增，擴增的反應條件為:94°C預變性2分鐘，以98°C變性10秒，56 °C退火30秒，68°C延伸I分鐘30秒，擴增25個循環，再以72°C充分延伸10分鐘。PCR擴增反應體系為15 μ 1，各成分如下表1所示:
[0045]表1 PCR擴增反應體系組成
[0046]
【權利要求】
1.一種含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體構建方法，包括: 501.通過PCR方法將BMP-2基因擴增，得擴增產物； 502.將所述擴增產物和pIRES2-ZsGreenl載體分別利用XhoI和BamHI酶進行雙酶切處理，將所得含BMP-2基因的雙酶切產物和含ZsGreenl基因的雙酶切產物進行粘性末端連接， 其中所述通過PCR方法將BMP-2基因擴增時使用的引物對為:SEQ ID NO:1和SEQ IDN0:2。
2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述BMP-2基因包括信號肽、前肽和成熟肽序列。
3.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述粘性末端連接使用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶進行。
4.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述PCR方法的反應條件為: 94-95 °C預變性2-3分鐘， 97-98°C變性 10-12 秒，55-56°C退火 30-40 秒，68_7(TC延伸 90-120 秒，擴增 25-30 個循環， 70-72°C延伸 10-12 分鐘。
5.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，在所述通過PCR方法將BMP-2基因擴增之后還包括對目的DNA序列進行純化回收的操作。
6.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述粘性末端連接過程中，所述含BMP-2目的基因的雙酶切產物與含ZsGreenl基因的雙酶切產物的DNA摩爾含量比為3-6:1。
7.如權利要求1-6中任一項所述的構建方法制備的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達載體。
8.如權利要求7所述的表達載體用于誘導成骨細胞分化的應用，所述應用包括將所述表達載體轉染至骨髓間充質干細胞中的步驟。
【文檔編號】C12N15/66GK103525851SQ201310446813
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月26日 優先權日:2013年9月26日
【發明者】岳建輝, 趙曉麗, 潘浩波, 胡慶茂 申請人:深圳先進技術研究院