大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體及其應用，所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其編碼基因如SEQ?ID?No.2所示。本發明通過易錯PCR的方法對野生型大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶（GlmS）進行突變。過表達突變后的GlmS，40h發酵產量可達6g/L，72h氨基葡萄糖的產量可以達到17g/L。
【專利說明】大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程及微生物發酵領域，具體地說，涉及一種大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體及其應用。
【背景技術】
[0002]氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)又稱氨基葡糖或葡萄糖胺，是葡萄糖的一個羥基被氨基取代后的化合物，是一種重要的功能單糖，也是第一個被確認結構的氨基單糖，在醫藥、食品和保健領域具有廣泛應用。氨基葡萄糖在體內具有重要的生理作用，如參與肝腎解毒，發揮抗炎、護肝的作用；作為抗菌消炎藥物，治療風濕性關節炎和胃潰瘍等。由于GlcN對人體沒有毒性，日本和美國均將其作為食品配料廣泛使用。氨基葡萄糖也是一種新型生化藥品、藥物中間體和高檔化妝品的添加劑。目前主要的生產方法為甲殼素水解法。水解法消耗大量的酸堿，腐蝕設備，環境污染嚴重，純化工藝復雜，產品有魚腥味，存在過敏效應。相對于甲殼素水解法，微生物發酵法生產不受資源限制，對環境污染小，產品無魚腥味，不存在過敏效應。
[0003]對GlcN的生物合成研究表明:在大腸桿菌中，由谷氨酰胺作為氨基供體，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖合成酶(GlmS)的催化作用下，生成GlcN，該步是GlcN合成途徑中的第一個限速反應。過表達氨基葡萄糖合成酶(GlmS)和降解基因的失活都會增加約15倍的氨基葡萄糖產量，達到60mg/L。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體及其應用。
[0005]為了實現本發明目的，本發明的一種大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006]與野生型的氨基葡萄糖合成酶相比，本發明的氨基葡萄糖合成酶突變體發生改變的氨基酸序列為:M43K (第43位甲硫氨酸變為賴氨酸)，P151T (第151位脯氨酸變為蘇氨酸)，Y258S (第258位酪氨酸變為絲氨酸)，I434T (第434位異亮氨酸變為蘇氨酸)，A552G(第552為丙氨酸變為甘氨酸)。
[0007]本發明還提供編碼所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體的基因，其核苷酸序列為:
[0008]i) Seq ID N0.2所示的核苷酸序列；或
[0009]ii)Seq ID N0.2所示的核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質的核苷酸序列；或
[0010]iii)在嚴格條件下與Seq ID N0.2所示序列雜交的核苷酸序列；
[0011]所述嚴格條件為在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。[0012]本發明還提供含有編碼所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體基因的載體、工程菌及轉基因細胞系。優選地，所述工程菌的出發菌株為大腸桿菌。
[0013]本發明還提供所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體在氨基葡萄糖合成中的應用。
[0014]本發明進一步提供一種利用大腸桿菌發酵生產氨基葡萄糖的方法，通過在大腸桿菌中過表達編碼所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體的基因，從而提高氨基葡萄糖的發
酵產量。 [0015]所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體的篩選方法，包括以下步驟:
[0016](I)從大腸桿菌(Escherichia coli )基因組DNA中，擴增GlmS的編碼基因glms ;
[0017](2)采用易錯PCR技術，以GlmS的編碼基因glms為模板，擴增獲得GlmS突變體基因；
[0018](3)將步驟(2)所得易錯PCR產物用BamH I和Xho I雙酶切后，與BamH I和Xho I酶切的pET-24d(+)載體連接，連接產物轉入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，涂布至LB(Kan)平板，將平板置37°C恒溫培養箱培養，即得構建好的重組GlmS基因突變庫；
[0019](4) LB (Kan)平板上長出菌落，挑取其中的100個單克隆，轉接到LB (Kan)液體培養基中，37°C搖床培養，待菌液0D600值達0.8時，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導，放回37°C搖床繼續培養12h后，收集菌體，超聲破碎，測定GlmS野生型和突變體酶活，挑選酶活力最強的一株，并測定其基因序列，結果如SEQ ID N0.2所示。
[0020]其中，所述野生型氨基葡萄糖合成酶具有SEQ ID N0.3所示的基因序列和SEQ IDN0.4所示的氨基酸序列。
[0021]本發明的另一方面提供所述氨基葡萄糖合成酶突變體的制備方法，包括以下步驟:
[0022]I) PCR擴增編碼所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體的基因；
[0023]2)將步驟I)所得PCR產物連接表達載體pET_24d ( + )；
[0024]3)連接產物轉入大腸桿菌感受態細胞，獲得表達產物；
[0025]其中，步驟I)中PCR擴增所用引物為:
[0026]正向引物:5'-CGGATCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC-3'
[0027]反向引物:5'-CCTCGAGTTACTCAACCGTAACCGATTTTGCCA-3'
[0028]其中，過表達的大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體C-端含有6個組氨酸標簽。
[0029]通過誘導表達，獲得GlmS (野生型)及GlmSM (突變體)的誘導上清液，并進行SDS-PAGE 分析。
[0030]本發明的大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體及其編碼基因還可以通過人工合成序列的方法獲得。
[0031]由于GlmS受6-磷酸氨基葡萄糖的強烈抑制，本發明通過易錯PCR的方法對GlmS進行突變。過表達突變后的GlmS，40h發酵產量可達6g/L，72h氨基葡萄糖的產量可以達到
Ug/lo
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為PCR擴增野生型大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶基因的凝膠電泳檢測結果。[0033]圖2為PCR擴增大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體基因的凝膠電泳檢測結果。
[0034]圖3為野生型和突變體大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶的SDS-PAGE檢測結果；其中，I為野生型，II為突變體，I為未誘導的菌體上清，2為經過誘導的菌體上清。
[0035]圖4為大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體的SDS-PAGE檢測結果；其中，M為蛋白Marker, I為經過誘導的菌體上清，2為經過純化的GlmSM蛋白。
【具體實施方式】
[0036]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0037]實施例1大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶基因的獲得
[0038]以Iyg大腸桿菌(Escherichia coli)基因組DNA為PCR反應模板，按SEQ IDN0.3 所示的序列設計正向引物 GlmS-F:5/ -CGGATCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC-3'，反向引物 GlmS - R:5’ -CCTCGAGTTACTCAACCGTAACCGATTTTGCCA-3';其中，斜體字母部分分別為酶切位點BamH I和Xho I。PCR反應在50 μ I總體系中進行，反應條件為:94°C變性5min ；94°C變性 50s，58°C退火 lmin，72°C延伸 2min，共 30 個循環；72°C延伸 lOmin。取 3μ I PCR擴增產物做瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果如圖1所示。取100 μ I PCR產物做瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒的說明回收目的片段。
[0039]實施例2野生型氨基葡萄糖合成酶基因表達載體的構建
[0040]將實施例1中的PCR產物經限制性內切酶BamH I和Xho I雙酶切消化后，與用BamH I和Xho I內切酶消化的pET_24d ( + )質粒(購自Novagen公司)進行連接反應,構建的載體被命名為pET-GlmS，然后用連接產物pET-GlmS混合物轉化大腸桿菌DH5- α (購自promega公司),并進行序列測定提取轉化菌體庫的質粒,轉化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株(購自promega公司)。
[0041]實施例3易錯PCR擴增大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶基因
[0042]利用Taq DNA聚合酶不具有3' -5'校對功能的性質，在高鎂離子濃度(8mmol/L)和不同濃度dNTP的濃度下(其中dATP和dGTP濃度為1.5mmol/L, dTTP和dCTP濃度為
3.0mmol/L)，來控制隨機突變的頻率，向目的基因中引入隨機突變，構建突變庫。模板濃度A260值為1000ng/mL，酶濃度為5U/yL，引物濃度為100 μ M。實驗中最優突變率約為0.6%。
[0043]易錯PCR反應體系(100 μ I):
[0044]
【權利要求】
1.一種大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求2或3所述基因的轉基因細胞系。
6.含有權利要求2或3所述基因的工程菌。
7.如權利要求6所述的工程菌，其特征在于，出發菌株為大腸桿菌。
8.權利要求1所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體在氨基葡萄糖合成中的應用。
9.一種利用大腸桿菌發酵生產氨基葡萄糖的方法，其特征在于，在大腸桿菌中過表達權利要求2或3所述基因，從而提高氨基葡萄糖的發酵產量。
10.權利要求1所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)PCR擴增編碼所述大腸桿菌氨基葡萄糖合成酶突變體的基因； 2)將步驟I)所得PCR產物連接表達載體pET-24d( + )； 3)連接產物轉入大腸桿菌感受態細胞，獲得表達產物； 其中，步驟I)中PCR擴增所用引物為: 正向引物:5' -CGGATCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC-3'； 反向引物:5' -CCTCGAGTTACTCAACCGTAACCGATTTTGCCA-3'。
【文檔編號】C12N9/10GK103589696SQ201310465013
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】李榮杰, 尚海濤, 楊為華, 鄧遠德, 徐斌, 汪本助, 紀傳俠 申請人:安徽豐原發酵技術工程研究有限公司