表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌、制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種大腸桿菌工程菌，本發明還提供一種大腸桿菌工程菌的制備方法，步驟是克隆黃孢原毛平革菌木質素過氧化物酶的基因的cDNA，雙酶切上述cDNA，將酶切片段連接pCold-TF載體,鑒定得到的質粒pCold-TF-LiP是否陽性表達，將陽性質粒pCold-TF-LiP導入至大腸桿菌BL21感受態細胞中，獲得表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌，本發明還提供大腸桿菌工程菌的應用，方法是將大腸桿菌工程菌接種于液體培養基，液體培養基中加入氨芐青霉素，培養至OD600為0.58～0.62，加入蛋白誘導劑IPTG，誘導重組蛋白表達，本發明的大腸桿菌工程菌表達量高，活性極強，酶活為3528U/L。
【專利說明】表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種大腸桿菌工程菌，具體是一種表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌、制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]木質素是地球上已知的第二大量的生物高聚物，結構非常復雜，不容易降解(Martinez,A.T.，et al.2005."Biodegradation of lignoceIIulosics:microbial，chemical，and enzymatic aspects of the fungal attack of lignin.〃Int Microbiol8:195-204)。由于缺乏適當的處理，許多木質素變成了廢物，引發了各種各樣的環境問題。伴隨著能源的日益緊張，已有國內外研究人員試圖通過轉變木質素來生產乙醇作為替代能源并取得一定進展。木質纖維素也被用于制造紙的原材料、培養食用菌和動物飼料(Sanchez, C.2009.^Lignocellulosic residues:biodegradation and bioconversion byfung1."Biotechnol Adv 27:185-194)。我國每年的木質素廢物產量巨大，堆積如山，隨之衍生的木質素生物轉變和資源化利用具有廣闊的應用前景。雖然木質素的用途多樣，然而由于缺乏強有力的木質素資源化轉變技術，極大地制約了它的資源化利用。截至目前，木質素的利用率仍舊是非常低的。分解木質素的方法是多樣的。特別地，微生物降解木質素是當前公認的既經濟又友好的方式。微生物通過分泌木質素降解酶，能有效地降解木質素。木質素過氧化物酶就是一種重要的木質素降解酶，由包含亞鐵血紅素的糖蛋白構成(Choinowski, T., et al.1999.^The crystal structure of lignin peroxidase at 1.70A resolution reveals a hydroxy group on the cbeta of tryptophan 171:a novelradical site formed during the redox cycle."J Mol Biol 286:809-827)，主要由真菌等微生物分泌，種類繁多，包括 Ligninase H2、Ligninase H8、Ligninase A、LigninaseB、Ligninase C、Ligninase LG2、Ligninase LG3、Ligninase LG5、Ligninase LG6、Ligninperoxidase lipj、 Lignin peroxidase isoform A、 Lignin peroxidase isoform lipB、Lignin peroxidase isoform lipD、Lignin peroxidase isoform lipE、Lignin peroxidaseisoform IipG 等(http:// www.uniprot.0rg/)。
[0003]自然界中許多微生物例如白腐真菌可以分泌木質素過氧化物酶。因此，白腐真菌已普遍應用于木質素的生物降解。例如黃孢原毛平革菌(一種白腐真菌)分泌的木質素過氧化物酶具有較強的木質素降解能力。盡管白腐真菌依賴其強大的木質素降解能力而被普遍應用于木質素降解研究中，但是當同細菌相比較，其繁殖速度一般低于細菌，致使其在實際的推廣使用中受到了一定的限制。此外，白腐真菌分泌的木質素過氧化物酶的數量是有限的，難于大規模的應用于木質素廢物的生物降解和工業生產中的紙漿漂白，僅僅依賴現存的微生物分泌的少量的木質素過氧化物酶進行降解是不現實的。

【發明內容】
[0004]本發明的目的是將細菌快速的繁殖能力和白腐真菌木質素過氧化物酶強大的木質素降解能力結合起來，通過基因克隆和重組的方法得到一種能表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌，另外提供大腸桿菌工程菌的制備方法和應用。
[0005]本發明的能表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌，構建其所需的步驟如下:
(O克隆黃孢原毛平革菌木質素過氧化物酶的基因的CDNA，所述木質素過氧化物酶為Ligninase LG3，蛋白序列為SEQ ID NO:01 ;通過木質素過氧化物酶的序列構建其基因的cDNA序列，適當調整，得到所述基因的cDNA序列為SEQ ID N0:02。
[0006](2)用如I和通ο I雙酶切克隆的上述cDNA，獲得相應酶切片段，將酶切片段用T4 DNA連接酶連接pCold-TF載體，得到重組原核表達質粒pCold-TF-Zi凡
[0007](3)鑒定重組原核表達質粒pCold-TF-Zi產是否陽性表達，得到陽性重組質粒pCoId-TF-Zi凡
[0008](4)將陽性重組質粒pCoId-TF-ZiP導入至大腸桿菌BL21感受態細胞中，獲得表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌。
[0009]鑒定重組原核表達質粒pCold-TF-Zi/^是否陽性表達的方法為:
(一)熱擊法將重組原核表達質粒pCold-TF-Zi/^導入至DH5 α感受態細胞中。
[0010](二)菌液PCR擴增鑒定，得到陽性克隆的DH5 α ;所述PCR擴增所使用的正向引物為 5，- aactcgagatggcatttaaacagctttttgcgg - 3，，序列為 SEQ ID N0:03,反向引物為 5’-aaggatcccgctcccggaggcggtgg - 3，，序列為 SEQ ID N0:04。
[0011](三)堿裂解法對上述陽性克隆的DH5α提取重組質粒。
[0012](四)重組質粒進行I和通OI雙酶切鑒定，對目的片段進行測序，測序正確的重組質粒為陽性重組質粒pCoId-TF-Zi凡
[0013]本發明還提供一種大腸桿菌工程菌在表達木質素過氧化物酶中的應用，步驟是: 將表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌接種于LB液體培養基，LB液體培養基中
加入氨芐青霉素80~120mg/L, 35~37°C，180~220 rpm,培養至OD600為0.58-0.62，加入蛋白誘導劑IPTG，16°C，200rpm，誘導重組蛋白表達12~16h。所述LB液體培養基的配方為:蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。
[0014]將誘導表達后的大腸桿菌工程菌裝入離心管中，離心，棄上清液，加入緩沖液重懸，超聲破碎，加入鎳柱，進行純化。
[0015]本發明的有益效果是:
1.本發明合成的木質素過氧化物酶來源于黃孢原毛平革菌，白腐真菌屬于真菌門擔子菌綱，形狀為絲狀，黃孢原毛平革菌是白腐真菌中的典型代表，具有較強的木質素降解能力。
[0016]2.本發明所使用的大腸桿菌BL21具有很快的繁殖能力，保證了重組得到的大腸桿菌工程菌能在很短的時間里生產一定數量的木質素過氧化物酶，能用于木質素固體廢物的降解和紙漿工業的漂白。
[0017]3.本發明所獲得的一種能表達合成的木質素過氧化物酶基因的大腸桿菌工程菌體積小易培養，適合大規模工業化生產木質素過氧化物酶。
[0018]4.本發明選取的Ligninase LG3的全長蛋白質序列是已知的,而其它的木質素過氧化物酶基因很多是片段的，克隆片段或非全長基因序列很難獲得基因的全部功能，可能導致其構建的工程菌表達的木質素過氧化物酶沒有活性。
[0019]5.本發明選取Ligninase LG3相較于其它木質素過氧化酶蛋白質序列長度適中且蛋白質全長序列已知，便于基因克隆，節省了時間和成本。
[0020]6.本發明將選取的Ligninase LG3構建入原核載體pCold-TF中，得到重組原核表達載體pCold-TF-Zi凡原核載體pCold-TF中的TF能夠增加外源蛋白的可溶性，因此能夠增加Ligninase LG3蛋白的可溶性。本發明得到的含有Ligninase LG3的大腸桿菌工程菌表達量大，蛋白產量高，具有滿足工業生產的巨大潛力，可望大規模應用于固體廢物的降解和環境污染治理。
[0021]7.本發明的木質素過氧化物酶是Ligninase LG3，我們發現，其所表達的木質素過氧化物酶具有活性，且酶活性非常高，酶活為3528 U/L。相比現有技術的工程菌表達的過氧化物酶無活性的技術相比，具有巨大的效果和顯著的進步。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為原核表達載體pCold-TF-Zi產雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；
其中，M為Marker，I代表取樣1，2代表取樣2。
[0023]圖2為菌液PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
其中，M為Marker，1、2、3、4、5是以菌液為模板的PCR擴增產物，條帶6是陰性對照，條帶7是陽性對照。
[0024]圖3為可溶性分析的SDS-PAGE圖；
其中，M為Protein Marker，I為總蛋白，2為上清，3為沉淀。
【具體實施方式】
[0025]實施例1
1、克隆木質素過氧化物酶基因的cDNA
從數據庫UniPiOtKB篩選得到木質素過氧化物酶的蛋白質序列(P21764)為SEQ ID:N0:01，為Met Ala Phe Lys Gln Leu Phe Ala Ala He Ser Leu Ala Leu Ser Leu Ser AlaAla Asn Ala Ala Ala Val He Glu Lys Arg Ala Thr Cys Ser Asn Gly Lys Thr Val GlyAsp Ala Ser Ser Cys Ala Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp He Gln Gln Asn Leu Phe HisGly Gly Gln Cys Gly Ala Glu Ala His Glu Ser He Arg Leu Val Phe His Asp Ser IleAla He Ser Pro Ala Met Glu Ala Gln Gly Lys Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly SerHe Met He Phe Asp Asp He Glu Thr Ala Phe His Pro Asn He Gly Leu Asp Glu IleVal Lys Leu Gln Lys Pro Phe Val Gln Lys His Gly Cys Thr Pro Gly Asp Phe He AlaPhe Ala Gly Ala Val Ala Leu Ser Asn Cys Pro Gly Ala Pro Gln Met Asn Phe Phe ThrGly Arg Ala Pro Ala Thr Gln Ala Ala Pro Asp Gly Leu Val Pro Glu Pro Phe His ThrVal Asp Gln He He Asn Arg Val Asn Asp Ala Gly Glu Phe Asp Glu Leu Glu Leu ValTrp Met Leu Ser Ala His Ser Val Ala Ala Val Asn Asp Val Asp Pro Thr Val Gln GlyLeu Pro Phe Asp Ser Thr Pro Gly He Phe Asp Ser Gln Phe Phe Val Glu Thr Gln LeuArg Gly Thr Ala Phe Pro Gly Ser Gly Gly Asn Gln Gly Glu Val Glu Ser Pro Leu ProGly Glu He Arg He Gln Ser Asp His Thr He Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ala Cys GluTrp Gln Ser Phe Val Asn Asn Gln Ser Lys Leu Val Asp Asp Phe Gln Phe lie Phe LeuAla Leu Thr Gln Leu Gly Gln Asp Pro Asn Ala Met Thr Asp Cys Ser Asp Val lie ProGln Ser Lys Pro He Pro Gly Asn Leu Pro Phe Ser Phe Phe Pro Ala Gly Lys Thr lieLys Asp Val Glu Gln Ala Cys Ala Glu Thr Pro Phe Pro Thr Leu Thr Thr Leu Pro GlyPro Glu Thr Ser Val Gln Arg lie Pro Pro Pro Pro Gly Ala。
[0026]為了使該蛋白質能在原核表達載體中1?效地表達，對該蛋白質序列(P21764)的cDNA進行了一些修飾和改造，在克隆引物序列5’兩端添加了和Z如I雙酶切位點，獲得的基因片段經和Z如I雙酶切法融合入原核表達載體pCold-TF，獲得重組原核表達質粒PCold-TF-Zi戶，該重組質粒表達的融合蛋白加入組氨酸標簽，有利于融合蛋白的鑒定及純化。所述 cDNA 序列為 SEQ ID NO:02, SEQ ID N0:02 為 atggcatttaaacagctttttgcggcgattagcctggcgctgagcctgagcgcggctaatgctgcggcggtgattgaaaaacgtgcgacctgcagcaatggcaaaaccgtgggcgatgcgagcagctgtgcgtggtttgatgtgctggatgatattcagcagaatctgtttcatggcggccagtgcggtgcggaggcgcacga aagcattcgtctggtgtttcatgatagcattgcgattagtcccgcgatggaagcgcagggaaaattcggcggtggtggggccgatggcagcattatgatttttgatgatattgaaaccgcgtttcatccgaatattggcctggacgaaattgtgaaactgcagaaaccgtttgtgcagaaacatggctgcacgccgggtgattttatcgcgtttgcaggggcagtcgcgctgagcaattgtccgggtgctccgcagatgaatttctttaccggccgtgcaccggcaacccaagccgcaccggatggcctggtgccggaaccctttcataccgtggatcagattatcaatcgtgtgaatgatgcgggcgaatttgatgaactggaactggtgtggatgctgagcgcgcatagcgtggcggcagtaaatgacgtggacccgaccgtgcagggcctgccttttgatagcaccccgggtatttttgattctcagttttttgttgaaacccagctgcgtggcaccgcgtttccgggctcaggcggcaatcagggcgaagtggaaagtccgctgcctggcgaaattcgtattcagagtgatcataccattgcgcgtgatagccgtaccgcgtgcgaatggcagagctttgtgaataatcagagcaaactggtggatgattttcagtttatctttctggcgctgacccaattaggccaggaccctaatgcgatgactgattgcagcgatgtgattccgcagagcaaacccattccgggcaacctgccgtttagcttttttccggcaggcaaaaccattaaggatgtggagcaggcgtgtgcggaaaccccttttccgaccctgaccaccctgcctggtccagagaccagcgtgcagcgtattccaccgcctccgggagcgtaao
[0027]2、構建重組表達載體pCoId-TF-ZiP
用及I和ZAo I雙酶切克隆的木質素過氧化物酶基因片段。雙酶切體系為:1.5 μ LBam^ I, 1.5μ L Xho Ι,2μ L 10 X buffer，5 μ L 酶切物質，10 μ L PCR 水。37°C，酶切 90min。參照膠回收試劑盒進行酶切產物回收，獲得相應雙酶切基因片段。
[0028]T4 DNA連接酶連接pCold-TF空載體。連接體系為:1.5 μ L Τ4 DNA連接酶，2 μ L10ΧΤ4 DNA連接酶buffer，1.5μ L 50%的聚乙二醇(PEG)，5 μ L雙酶切的載體，10 μ L上述雙酶切基因片段，室溫連接，得到含有重組原核表達質粒pCold-TF-Zi/^的連接體系產物。
[0029]3、得到陽性重組質粒pCold-TF-Zi/7
(一)取1(^1^含有重組原核表達質粒？(:01(^^-^/?的連接體系產物加入IOOyLDH5 α感受態細胞，混勻，冰浴20min，轉入42°C熱激90s。
[0030](二)將上述熱激后的產物加入ImL LB液體培養基,置于37°C恒溫振蕩培養箱中培養lh。從中取200 μ L涂布在含氨芐青霉素的LB固體培養基的培養皿上，用膠帶密封。放在37°C恒溫培養箱中倒置培養12~16h。挑取7~8個單菌落至5mL含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C震蕩培養12~16h，所述LB固體培養配方為，蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，0.75g瓊脂粉，加水50ml。
[0031]以菌液為模板進行PCR擴增初步驗證陽性菌株，得到陽性克隆的DH5 α。
[0032]PCR 擴增引物為:正向引物:5’ - aactcgagatggcatttaaacagctttttgcgg - 3，，反向引物:5’ - aaggatcccgctcccggaggcggtgg - 3’。所述 PCR 擴增的體系為 50 μ L 體系:IOXbuffer 5 μ L, dNTP 2.5 yL，正向引物 0.75 yL，反向引物 0.75 “1^，酶0.75 μ L,模板5 μ L,加水補足至50 μ L0
[0033]所述PCR運行的程序:預變性溫度為94°C，時間為5min ;變性溫度為94°C，時間為30 s ;退火溫度為56°C，時間為30s ;延伸溫度為72°C，時間為70s ;循環34次；后延伸溫度為72°C，時間為5 min ;12°C低溫保存。
[0034]所述PCR產物的證實通過1%瓊脂糖凝膠電泳:量取0.4 g瓊脂糖至錐形瓶中，加Λ40 mL TBE電泳緩沖液，置于微波爐中，調至高火，煮2min左右，至透明，取出。膠制好后，點樣，蓋好電泳槽，開啟電源，10 min左右，觀察電泳結果。
[0035](三)堿裂解法對上述陽性克隆的DH5α提取重組質粒。
[0036](四)重組質粒進行I和通οI雙酶切鑒定，鑒定結果如圖1所示。對目的片段送上海生物工程公司進行測序驗證，得到陽性重組質粒pCold-TF-Zi凡
[0037]4、將陽性重組質粒pCold-TF-Zi/^轉化進大腸桿菌BL21感受態細胞中，涂布于含100 mg/L氨芐青霉素的固體LB培養基上篩選陽性工程菌，得到表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌。檢測重組表達載體PCold-TF-ZiP是否構建成功，檢測結果如圖2所示。
[0038]實施例2
上述大腸桿菌工程菌在表達木質素過氧化物酶中的應用
將實施例1制備的大腸桿菌工程菌接種于LB液體培養基，含氨芐青霉素100mg/L，37°C, 200 rpm，培養至OD6tltl約為0.6左右，加入蛋白誘導劑IPTG，16°C，200 rpm，誘導重組蛋白表達12~16 h。所述LB液體培養基的配方為:蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉 0.5g,加水 50ml ο
[0039]實施例3
木質素過氧化物酶的分離提純
將實施例2誘導培養后的的大腸桿菌工程菌裝入離心管中，12000rpm離心lmin，棄上清液，加入PBS緩沖液重懸，超聲破碎，加入ImL鎳柱，進行純化。
[0040]將實施例2誘導培養后的的大腸桿菌工程菌，1000Orpm離心5min,離心收集并分析蛋白可溶性，超聲破碎，分別取總蛋白、上清液和沉淀進行SDS-PAGE蛋白電泳分析，具體結果如圖3所示，表明該木質素過氧化物酶蛋白能夠在大腸桿菌BL21中高效表達。
[0041]實施例4
大腸桿菌工程菌分泌的木質素過氧化物酶酶活的測定
木質素過氧化物酶酶活的測定采用VA (藜蘆醇)為底物的方法:
取 10 mmol/L 藜蘆醇溶液 0.6 mL、250 mmol/L 酒石酸緩沖液(pH=3.0) 1.2 mL> 10 μ L實施例3得到的酶液與10 μ L FeSO4溶液(0.01g/mL)混勻。在室溫下，往上述體系中加20mmol/L H2O2溶液60 μ L。同時以未加H2O2溶液的上述體系為參比，于310nm處，使用紫外分光光度計測定3min前后反應體系吸光度的變化情況。酶活力單位(U):每分鐘催化藜蘆醇形成I μ mol藜蘆醛所需的酶量。計算中的ε 31(1=9300 πιο1.cnT1。通過上述方法測得的酶活為352U/L
【權利要求】
1.一種表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌，其特征是，制備方法是: (O克隆黃孢原毛平革菌木質素過氧化物酶的基因的CDNA，所述木質素過氧化物酶為Ligninase LG3，蛋白序列為 SEQ ID N0:01 ； (2)用BeuM I和通ο I雙酶切克隆的上述cDNA，獲得相應酶切片段，將酶切片段用T4DNA連接酶連接pCold-TF載體，得到重組原核表達質粒pCold-TF-Zi產； (3 )鑒定重組原核表達質粒pCo I d-TF-Zi^是否陽性表達，得到陽性重組質粒pCold-TF-Zi/7 ； (4)將陽性重組質粒pCoId-TF-ZiP導入至大腸桿菌BL21感受態細胞中，獲得表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌。
2.一種表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌的制備方法，其特征是， (O克隆黃孢原毛平革菌木質素過氧化物酶的基因的cDNA，所述木質素過氧化物酶為Ligninase LG3，蛋白序列為 SEQ ID N0:01 ； (2)用及I和通ο I雙酶切克隆的上述cDNA，獲得相應酶切片段，將酶切片段用T4DNA連接酶連接pCold-TF載體，得到重組原核表達質粒pCold-TF-Zi產； (3 )鑒定重組原核表達質粒pCo I d-TF-Zi^是否陽性表達，得到陽性重組質粒pCold-TF-Zi/7 ； (4)將陽性重組質粒pCoId-TF-ZiP導入至大腸桿菌BL21感受態細胞中，獲得表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌。
3.如權利要求2所述的表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌的制備方法，其特征是，所述cDNA序列為SEQ ID N0:02。
4.如權利要求2所述的表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌的制備方法，其特征是，鑒定重組原核表達質粒pCold-TF-Zi/^是否陽性表達的方法為: (一)熱擊法將重組原核表達質粒pCold-TF-Zi/^導入至DH5a感受態細胞中； (二)菌液PCR擴增鑒定，得到陽性克隆的DH5a ； (三)堿裂解法對上述陽性克隆的DH5a提取重組質粒； (四)重組質粒進行ifeMlI和ZA0 I雙酶切鑒定，對目的片段進行測序，測序正確的重組質粒為陽性重組質粒pCold-TF-Zi/7。
5.如權利要求4所述的表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌的制備方法，其特征是，步驟(二)的菌液PCR擴增鑒定使用的正向引物為5’ - aactcgagatggcatttaaacagctttttgcgg - 3，，反向引物為 5，- aaggatcccgctcccggaggcggtgg - 3，。
6.如權利要求1所述的表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌在表達木質素過氧化物酶中的應用。
7.如權利要求6所述的表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌在表達木質素過氧化物酶中的應用，其特征是，將表達木質素過氧化物酶的大腸桿菌工程菌接種于含有氨芐青霉素的液體培養基中，培養，加入蛋白誘導劑IPTG，分離提純，得到表達的木質素過氧化物酶。
8.如權利要求7所述的應用，其特征是，液體培養基為LB液體培養基，氨芐青霉素的濃度為80~120mg/L，培養溫度為35~37°C。
9.如權利要求7所述的應用，其特征是，培養至OD6tltl為0.58~0.62時加入蛋白誘導劑 IPTG ，16°C 培養。
【文檔編號】C12N9/08GK103540606SQ201310544399
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】陳明, 晏銘, 曾光明, 杜長青, 張嘉超, 魯倫慧, 朱藝, 賴萃, 許飄, 武海鵬 申請人:湖南大學