專利名稱：一種肝素黃桿菌肝素酶Ⅱ的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種肝素酶II的制備方法，尤其涉及一種由氯化鈣保護之下，含硫酸銨沉淀分離、SP-Sepharose FF柱層析、肝素親和柱層析、Cellufine Sulfate柱層析、SP-HPLC等步驟的純化制備肝素酶II的方法。
背景技術：
肝素酶是指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃 桿菌中發現并分離出來的，其后，又陸續在一些微生物和動物組織中發現存在肝素酶。肝素酶的應用十分廣泛，如清除血液中殘存肝素、防止凝血、生產低分子肝素、研究肝素的結構。目前有學術論文報道的肝素酶大約有10多種，得到較為細致研究的只有來自肝素黃桿菌的3種酶，分別是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I、II、111分別是分子量大約43、78、66kd的單體蛋白質，其等電點均在9. O左右，應用和研究非常廣泛。肝素酶的純化工作有許多研究報道，Yang等(J Biol Chem, 1985，260: 1849-1857)用羥基磷灰石吸附/洗脫處理、QAE-葡聚糖柱層析、等電聚焦、凝膠過濾等四步純化，制得純肝素酶I，活性收率大約1%。Daniel等(J Bio Chem, 1992，267(34):24347-24355)用羥基磷灰石吸附/洗脫處理、QAE-Sepharose柱層析、HA-HPLC, Mono-SFPLC, GPC-HPLC等五步純化，最終獲得純的肝素酶I，比活性達到130IU/mg，活性回收率為
10.8% ;用羥基磷灰石吸附/洗脫處理、QAE-Sepharose柱層析、HA-HPLC, GPC-HPLC等四步純化，最終獲得純的肝素酶II，比活性達到19iu/mg，活性回收率為I. 02% ;用羥基磷灰石吸附/洗脫處理、QAE-S印harose柱層析、HA-HPLC、Mono-S FPLC、GPC_HPLC等五步純化，最終獲得純的肝素酶III，比活性達到63. 5IU/mg，活性回收率為2. 74%。發明人(食品與藥品，2005，32 (5):446-450)使用羥基磷灰石吸附/解吸、DEAE —Sepharose柱層析、CM 一 Cellose柱層析等三步純化法，純化得到肝素酶I，活性收率13.4%;并(了 Chrom B, 2006，843 (2) : 209-215)通過硫酸銨沉淀、octyl-sepharose 柱層析、CM-650柱層析、SP-650柱層析、sephadex G-100柱層析等五步純化法獲得純化的肝素酶I，收率達到17. 8%。在2009年5月提交的“一種肝素黃桿菌肝素酶I制備方法”(專利申請號200910039360. I)中，建立了一種全新的純化制備工藝，獲得高達30%的純酶活性收率，制備的肝素酶I比活高達223IU/mg。在2011年8月提交的“一種肝素黃桿菌肝素酶I、
11、111制備方法”(專利申請號201110241260.4)中，給出一種同時制備純化出肝素酶I、11、III的方法，制備的肝素酶I、111比活高達417和235IU/mg，肝素酶II比活為15. 3IU/mg。本專利給出一種肝素酶II的制備方法，通過多步柱層析，制備出高純度肝素酶II，比活進一步提高到27. 2 IU/mg。方法高效、可重復，所得酶純度極高。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種高純度肝素酶II的制備方法，該方法可純化出高純度肝素酶II，其比活高于文獻最高報道值。
本發明包括下述步驟
(1)肝素酶粗酶液的制備
將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環菌接到50ml種子培養基中，23°C、150rpm培養I天。然后按5%接種量接入發酵培養基，23°C、150rpm培養2-3天。菌液10000rpm、4°C離心15-30分鐘，收集沉淀，懸浮在25mM Tris-HCl緩沖液中，冰浴超聲(150W，超5s，停5s)。4°C、IOOOOrpm離心30min,上清即為粗酶液；
(2)硫酸銨沉淀除雜質
冰浴中向粗酶加入等體積的溶于10-25mM Tris-HCl緩沖液的飽和硫酸銨溶液，緩慢 滴加，加完后冰浴中緩慢攪拌沉淀30min,然后18000rpm離心30min。取上清,冰浴中向其中再緩慢加入干燥的硫酸銨粉末(153g/L溶液)至飽和度70%，攪拌沉淀30min，然后18000rpm離心30min。棄上清，將沉淀以25mM Tris-HCl緩沖液適量溶解，裝入截留分子量IOKD透析袋中對100倍體積上述緩沖液過夜透析，得去除雜質后的酶液；
(3)肝素酶II的SP柱(使用SP-s印haroseFF填料)分離
將步驟⑴所得粗酶液上一根用10-25mM的Tris-HCl平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的洗脫液，收集液各管隨洗脫的進行呈兩個分離完全的活性峰靠前的那個為肝素酶II，靠后的那個為肝素酶I和肝素酶III的混合物；
(4)肝素酶II的肝素親和層析(HEP柱，填料為鍵合了肝素的S印harose4B)純化 步驟(3)肝素酶II活性峰洗脫液透析后上一根用5-10mM Tris-HCl緩沖液平衡過的
HEP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. IM洗脫，收集測得有酶活性的洗脫液若干管，合并、透析；
(5)肝素酶II的 CS (Cellufine Sulfate)柱純化:
步驟(4)得到的酶液上一根用10-50mMTris-HCl緩沖液平衡過的Cellufine Sulfate柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-1. 5M洗脫，收集測得有酶活性的洗脫液若干管，合并、透析；
(6)肝素酶II的SP-HPLC純化
步驟(5)得到的酶液上一根用IOmM Tris-HCl緩沖液平衡過的SP-HPLC柱，以同樣緩沖液中氯化鈉線形梯度0-1. OM洗脫，收集測得有酶活性的洗脫液若干管，合并、透析，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶II。其中，步驟⑴所述的種子培養基的組成為牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L, NaCl 為 5 g/L, ρΗ7· O。步驟(I)所述的發酵培養基組成為肝素8g/L，K2HPO4 2.5 g/L，NaH2PO4 2.5 g/L，NH4Cl 2.0 g/L, MgCl2 0.5 g/L，組氨酸 0.5 g/L，甲硫氨酸 0.5 g/L，微量元素(NaMoO3、CuCl2, FeCl2' CoCl2^MnCl2, CaCl2 各 I X 1(Γ4Μ)。步驟(I)、(2)、(3)、(5)、(6)所述Tris-HCl 緩沖液均含 IOmM CaCl2、且其ρΗ6. 5-8. O,優選 pH 范圍為 7. 0-7. 5。步驟(4)所述Tris-HCl緩沖液，其ρΗ6· 5-8. 0，優選pH范圍為7. 0-7. 50步驟(4)所使用的肝素親和層析(HEP柱)的填料為鍵合了肝素的S印harose 4B,親和配基與填料的偶聯采用GE公司標準方法,見GE Healthcare公司CNBr_activatedSepharose 4B 使用說明書(Instructions 71-7086-00AF)
本發明中肝素酶活性檢測和蛋白濃度檢測方法，見發明人在2011年8月提交的“一種肝素黃桿菌肝素酶I、II、III制備方法”(專利申請號201110241260.4)。本發明所述制備方法中，肝素酶II在純化過程中使用了保護劑CaCl2，這保持了肝素酶II活性的穩定，提高了收率。本發明還采用了肝素親和柱層析法純化肝素酶II的方法，這個方法特異性好，純化效率很高。曾有報道認為酶對填料中的肝素存在降解，所以肝素柱不能用于純化肝素酶。本發明經過長期實驗檢驗，認為肝素親和柱是能夠用于肝素酶II純化的，而且效果很好。需要注意的是，可能因為純化中酶的降解作用，該填料在使用大約10次后效果下降，需要再生一次，然后即可重新使用。 經過本發明的制備工藝，最終得到比活高達27. 19 IU/mg的肝素酶II，從IL發酵液的菌體中得到9. 29 IU的肝素酶II純酶。與已報道方法相比，酶II比活超過了最高報道19 IU/mg (可查到的最高報道值出現在文獻 Daniel LL, Robert JL. Purification and Characterication of HeparinLyases from Flavobacterium heparinum. J BioChem，1992, 267 (34) :24347- 24355·)。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例
a、將肝素黃桿菌從種子斜面接I環菌到50ml種子培養基(組成為牛肉膏5g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 5 g/L, pH7. 0)中，23°C、150rpm 培養 I 天；將得到的 50ml種子液接入IL發酵培養基(組成為肝素8g/L，K2HPO4 2. 5g/L, NaH2PO4 2. 5g/L, NH4Cl 2. Og/L7MgCl2 0. 5g/L，組氨酸 0. 5g/L,甲硫氨酸 0. 5g/L，微量元素(NaMo03、CuCl2、FeCl2、CoCl2、MnCl2XaCl2 各 I X I(T4M), 23°C、150rpm 培養 2-3 天，4°C、IOOOOrpm 離心 30 分鐘，收集沉淀；沉淀懸浮在100ml、25mM的Tris-HCl (含CaCl2 IOmM, pH7. 0)緩沖溶液中，冰浴超聲2小時，250W、超5s、停5s模式，4°C、IOOOOrpm離心30min，取上清液，即為粗酶液；
b、冰浴中向粗酶加入等體積的溶于25mMTris-HCl (pH7. 0，含CaCl2 10 mM)緩沖液的飽和硫酸銨溶液，緩慢滴加，加完后冰浴中緩慢攪拌30min，然后18000rpm離心30min。取上清，冰浴中再緩慢加入干燥的硫酸銨粉末(153g/L溶液)至飽和度70%，攪拌沉淀30min，然后 18000rpm 離心 30min。棄上清，將沉淀以 25mM Tris-HCl (ρΗ7· 0，含 CaCl2 IOmM)緩沖液30ml溶解，裝入截留分子量10KD透析袋中對100倍體積上述緩沖液過夜透析，得38ml酶液，總肝素酶活力100. 7IU，總蛋白642. Ilmg ；
C、將硫酸銨沉淀后的酶上一根 SP-sepharose FF 柱(2. 5cmX 10cm),以 25mM Tris-HCl(ρΗ7· O,含IOmM CaCl2)平衡100ml,以同樣緩沖液中NaCl線形梯度0-0. 5M洗脫400ml。洗脫速度lml/min，自動收集，每管3_4ml，檢測每管的肝素降解能力?？砂l現酶分為兩個活性峰，收集前面那個活性峰所屬各管酶液，裝入截留分子量10KD透析袋中對100倍體積IOmMTris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液過夜透析，得26ml酶液，總肝素酶活力17. 69IU，總蛋白I. 74mg ；d、將SP柱分離后的酶上一根用IOmM Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液平衡過的HEP柱(I. 6cmX 10cm),以同樣緩沖液平衡3個柱體積，IOmM Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. IM洗脫，收集有活性的洗脫液若干管，合并、透析，得56ml酶液，總肝素酶活力 10. 13IU，總蛋白 O. 98mg ；
e、將HEP柱純化后的酶上一根用50mMTris-HCl (含CaCl2 10 mM，pH7. O)緩沖液平衡過的CS柱(I. 6cmX 10cm),以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-1. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析，得15ml酶液，總肝素酶活力10. 02IU,總蛋白O. 38mg ；
f、將CS柱純化后的酶上一根連接在Waterse2796型HPLC純化設備上的Waters公司的Protein-Pak SP HPLC柱(8HR，1000 ，8Mm)，以 IOmM Tris-HCl(含CaCl2 10 mM,pH7. O)緩沖液平衡柱子，每次上樣1ml，以同樣緩沖液含氯化鈉線形梯度0-1. OM洗脫，流速O. 8ml/min0收集洗脫液若干部分，合并、透析，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮， 得到Iml肝素酶II，總肝素酶活力9. 29IU，總蛋白O. 34mg ；
最終從IL發酵液的菌體中得到9. 29 IU的肝素酶II純酶，比活高達27. 19 IU/mg。
權利要求
1.一種肝素黃桿菌肝素酶II的制備方法，所述方法包括下述步驟 (I)肝素酶粗酶液的制備 將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環菌接到50ml種子培養基中，23°C、150rpm培養I天，然后按5%接種量接入發酵培養基，23°C、150rpm培養2-3天，菌液10000rpm、4°C離心15-30分鐘，收集沉淀，懸浮在25mM Tris-HCl緩沖液中，冰浴超聲(150W、5s、5s)，4°C、IOOOOrpm離心30min,上清即為粗酶液； (2)硫酸銨沉淀除雜質 冰浴中向粗酶加入等體積的溶于10-25mM Tris-HCl緩沖液的飽和硫酸銨溶液，緩慢滴加，加完后冰浴中緩慢攪拌沉淀30min,然后18000rpm離心30min,取上清,冰浴中向其中再緩慢加入干燥的硫酸銨粉末(153g/L溶液)至飽和度70%，攪拌30min，然后18000rpm離心30min，棄上清，將沉淀以25mM Tris-HCl緩沖液適量溶解，裝入截留分子量IOKD透析袋 中對100倍體積上述緩沖液過夜透析，得去除雜質后的酶液； (3)肝素酶II的SP柱分離 將步驟(I)所得粗酶液上一根用10-25mM的Tris-HCl平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的洗脫液，收集液各管隨洗脫的進行呈兩個分離完全的活性峰靠前的那個為肝素酶II，靠后的那個為肝素酶I和肝素酶III的混合物； (4)肝素酶II的肝素親和層析純化 步驟(3)肝素酶II活性峰洗脫液透析后上一根用5-10mM Tris-HCl緩沖液平衡過的HEP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. IM洗脫，收集測得有酶活性的洗脫液若干管，合并、透析； (5)肝素酶II的 CS (Cellufine Sulfate)柱純化: 步驟(4)得到的酶液上一根用10-50mMTris-HCl緩沖液平衡過的Cellufine Sulfate柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-1. 5M洗脫，收集測得有酶活性的洗脫液若干管，合并、透析； (6)肝素酶II的SP-HPLC純化 步驟(5)得到的酶液上一根用IOmM Tris-HCl緩沖液平衡過的SP-HPLC柱，以同樣緩沖液中氯化鈉線形梯度0-1. OM洗脫，收集測得有酶活性的洗脫液若干管，合并、透析，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶II ； 其中，步驟(I)所述的種子培養基的組成為牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5g/L, NaCl 為 5 g/L, ρΗ7·O ； 步驟(I)所述的發酵培養基組成為肝素8g/L，K2HPO4 2.5 g/L, NaH2PO4 2.5 g/L, NH4Cl 2.0 g/L, MgCl2 0.5 g/L,組氨酸 0.5 g/L,甲硫氨酸 0.5 g/L,微量元素(NaMoO3, CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2，各 IX I(T4M); 步驟(I)、(2)、(3)、(5)、(6)所述 Tris-HCl 緩沖液均含 IOmM CaCl2、pH6. 5-8. O,優選pH 范圍為 7. 0-7. 5。
2.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(3)所用SP層析柱的填料優選使用SP-sepharose FF填料,也可使用其他以SP為分離功能基團的蛋白純化填料或離子交換樹脂。
3.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(4)所用肝素親和層析柱的填料優選使用鍵合了肝素的Sepharose 4B，也可使用其他鍵合了肝素的蛋白純化填料或離子交換樹脂。
4.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(4)所述Tris-HCl緩沖液為Tris-HCl 溶液，ρΗ6· 5-8. O,優選 pH 范圍為 7. 0-7. 5。
5.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(5)所用CellufineSulfate層析柱的填料優選使用CHISSO公司的親和層析填料Cellufine Sulfate,也可使用其它公司同類的親和填料。
6.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(6)所用HPLC設備可為任何一種有一定制備能力的HPLC設備，其SP-HPLC層析柱優選使用Waters公司的Protein-Pak SPHPLC柱(8HR，1000 ，8Mm)，也可使用其他以SP為分離功能基團的HPLC柱子。
全文摘要
本發明提供肝素黃桿菌肝素酶Ⅱ的制備方法，將肝素黃桿菌接到種子培養基中培養，再接到發酵培養基，離心收集沉淀，沉淀超聲破碎，離心得到肝素黃桿菌肝素酶的粗酶液，然后將粗酶液通過硫酸銨沉淀分離去部分雜質，再通過一次SP-SepharoseFF層析分離出肝素酶Ⅱ，再通過肝素親和柱層析、CellufineSulfate柱層析、SP-HPLC等步驟的精細純化最終制備出高純度肝素酶Ⅱ。
文檔編號C12N9/88GK102965362SQ20121049280
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者馬小來, 史紹鵬, 李鋰 申請人:深圳市海普瑞藥業股份有限公司