本發明涉及一種甜瓜花藥誘導培養基及花培育種方法，具體涉及一種有效提高花藥愈傷誘導率、大大加快了甜瓜花培育種進程的甜瓜花藥誘導培養基及花培育種方法，屬于果蔬培育種植技術領域。
背景技術：
甜瓜（melon），別名甘瓜、香瓜、穿腸瓜、果瓜以及熟瓜，在植物分類學上屬于葫蘆科（cucurbitaceae）甜瓜屬（cucumis），是1年生蔓性草本植物，是一種深受人們喜愛的水果型蔬菜。甜瓜原產于印度、非洲熱帶沙漠地區，大約在北魏時期隨著西瓜一同傳到中國，明朝開始廣泛種植。作為世界十大水果之一，一直以其風味獨特著稱。
成熟甜瓜果實中含有大量的碳水化合物及檸檬酸、胡蘿卜素和維生素b、c等，且水分充沛，可消暑清熱，生津解渴，除煩等；營養甜瓜中含有轉化酶，可以將不溶性蛋白質轉變成可溶性蛋白質，能幫助腎臟病人吸收營養，對腎病患者有益；甜瓜蒂所含的葫蘆素b能明顯增加實驗性肝糖元蓄積，減輕慢性肝損傷，從而阻止肝細胞脂肪變性及抑制纖維增生；甜瓜蒂含有苦毒素，葫蘆素b、e等結晶性苦味質，能刺激胃粘膜，內服適量，可致嘔吐，但不為身體吸收，而無虛脫及中毒等弊端；現代研究發現，甜瓜子有驅殺蛔蟲、絲蟲等作用，可廣泛用于治療蟲積病癥。補充營養甜瓜熟肉含有蛋白質、脂肪、碳水化合物、無機鹽等，可補充人體所需要的能量及營養素，幫助機體恢復健康。
作為一種重要的瓜類經濟作物，甜瓜為世界十大重要水果之一，栽培面積和產量較大，世界溫帶至熱帶地區廣泛栽培。中國、俄羅斯、西班牙、美國、伊朗、意大利、日本等國家普遍栽培，以中國產量最高。自20世紀80年代以來，我國甜瓜的栽培面積和產量一直居于世界第一。因此，我國甜瓜生產在世界上占有重要地位，甜瓜是我國高端農業的優勢作物，對農民增收與農業結構調整有著重要意義。
由于甜瓜是異花授粉植物，天然雜交率高，因此采用常規育種手段獲得純系具有周期長、難度大、遺傳性狀不穩定等缺點，而利用單倍體技術育種就可以避免這些問題，大大提高育種效率。單倍體育種技術是指通過誘發單性生殖使某些品種的異質配子發育成單倍體植株，再經過染色體加倍獲得純系，之后進行品種選育的一種育種方法。這種技術能夠縮短育種年限、提高育種效率。但自然界中，作物自發產生單倍體植株的幾率極低，不過通過一些人為手段可獲得單倍體，如花藥或游離小孢子培養技術。迄今為止，甜瓜中沒有發現自發產生的單倍體植株，所以甜瓜花培技術就成為獲得甜瓜單倍體植株的重要途徑。
技術實現要素：
本發明的目的是針對當前甜瓜花培愈傷組織誘導率極低、花培技術不完善的缺陷，提供了一種有效提高花藥愈傷誘導率、大大加快了甜瓜花培育種進程的甜瓜花藥誘導培養基及花培育種方法。
本發明采用的技術方案如下：
一種甜瓜花藥誘導培養基，其特征在于：培養基配方由每升蒸餾水中以下組分含量分別為：kno380-90mg/l，mgso4?7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2?4h2o160-200mg/l，mnso4?4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4?7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4?7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4?2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4?5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2?6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，谷氨酰胺450-550mg/l，維生素b10.9-1.1mg/l，維生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，煙酸4.5-5.5mg/l，肌醇120-140mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，胰島素1.8-2.2mg/l，環鳥苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基磺酸乙酯1.0-1.4g/l，蔗糖42-48g/l，瓊脂6.5-7.5g/l，6-ba0.8-1.2mg/l，naa0.8-1.2mg/l，甘露醇14-16g/l，椰乳27-33g/l，植物硫化激動素psk-α18-22pmol/l。
所述的培養基配方由每升蒸餾水中以下組分最佳含量分別為：kno385mg/l，mgso4?7h2o150mg/l，kh2po473mg/l，ca(no3)2?4h2o180mg/l，mnso4?4h2o27.5mg/l，na2-edta12.5mg/l，feso4?7h2o13.5mg/l，h3bo38.25mg/l，znso4?7h2o9.0mg/l，ki0.5mg/l，agno317mg/l，na2moo4?2h2o0.25mg/l，cuso4?5h2o0.025mg/l，cocl2?6h2o0.025mg/l，腺嘌呤15mg/l，谷氨酰胺500mg/l，維生素b11.0mg/l，維生素b60.7mg/l，vc0.6mg/l，煙酸5.0mg/l，肌醇130mg/l，甘氨酸4.0mg/l，胰島素2.0mg/l，環鳥苷酸0.2g/l，谷胱甘肽32.5mg/l，甲基磺酸乙酯1.2g/l，蔗糖45g/l，瓊脂7.0g/l，6-ba1.0mg/l，naa1.0mg/l，甘露醇15g/l，椰乳30g/l，植物硫化激動素psk-α20pmol/l。
所述的甲基磺酸乙酯的添加方法為：配制好甲基磺酸乙酯溶液后，用滅菌的0.22μm的微孔濾膜過濾滅菌，待培養基高壓蒸汽滅菌后冷凝到45-55℃時，取出置于超凈工作臺中，無菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，搖勻冷凝，24h時間內接種。
所述的培養基的配制ph值為：5.4-5.8，最佳配制ph值為5.6。
一種甜瓜花培育種方法，其特征在于：花培育種方法按如下步驟操作：
（1）花蕾取材與預處理
在大田常規栽培的甜瓜處于初花期時，上午9-11點采集生長健壯、無病蟲害的植株上取發育時期處于單核靠邊期的花蕾為試材，將采集的花蕾用濕紗布包裹后再用自封塑料袋套起，置于4℃冰箱中低溫處理2d，然后轉入36℃環境下熱激處理2d；
（2）培養基的配制
將權利要求1、2、3和4所述的培養基配制好后分裝于250ml的三角瓶中，每瓶盛50ml-70ml的培養基，密封后置于溫度為121℃、壓力為15kpa高壓蒸汽條件下滅菌20min，冷凝到45-55℃時，取出置于超凈工作臺中，無菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，搖勻冷凝，24h時間內接種；
（3）花藥接種
取出預處理后的花蕾，先用流水沖洗1-2min，用鑷子剝去花柄，用小塊紗布包裹，浸入70%酒精中15s，用無菌水沖洗2-3次后轉入0.1%升汞溶液中消毒8-10分鐘，然后用無菌水沖洗3-4次，將花蕾放入覆有濾紙的滅菌培養皿內，無菌條件下剝取花藥接種到步驟2配制好的誘導培養基上，每瓶接入花藥14-16枚；
（4）花藥誘導培養
將接種花藥后的培養基置于溫度為26-28℃、光照強度1400-1800lx、光周期11h光/13h暗的環境下進行培養，誘導出花藥愈傷；
（5）花藥分化培養
待花藥愈傷長至直徑2.5cm后，挑選半透明、結構松散的愈傷組織轉接入分化培養基上進行分化培養，愈傷逐漸分化出綠苗；
（6）馴化與移栽
花藥分化培養35d后綠苗生長旺盛，此時將封口膜打開馴化煉苗，7d后將試管苗取出，將根部清洗干凈，移栽入溫室，常規栽培。
所述步驟（1）的單核靠邊期的甜瓜花蕾選材標準為：測量甜瓜花蕾的縱莖長度，縱莖長度為3.0-3.6mm的花蕾。
所述步驟（5）分化培養的條件為：溫度25-27℃、濕度為70%-80%、光照強度2000-2500lux、光周期12h光/12h暗。
本發明提供的甜瓜花藥誘導培養基及花培育種方法是在現有其它蔬菜種的研究基礎之上特異性針對甜瓜花藥培養要求進行創造性改良的成果，本發明大大提高了甜瓜花藥愈傷組織誘導率，首次建立了甜瓜花培育種程序。
本發明所提供的甜瓜花藥誘導培養基，是經過大量單因子、多因子試驗所篩選的，通過大量的實驗研究證明了本發明的培養基組分配比是最優組合。采用本發明所提供的培養基可以大大提高甜瓜花藥愈傷組織誘導效率，因此具有較高的產業推廣價值。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
一種甜瓜花藥誘導培養基及花培育種方法，其特征在于：花培育種方法按如下步驟操作：
（1）花蕾取材與預處理
在大田常規栽培的甜瓜處于初花期時，上午9-11點采集生長健壯、無病蟲害的植株上取發育時期處于單核靠邊期的花蕾為試材，單核靠邊期的甜瓜花蕾選材標準為：測量甜瓜花蕾的縱莖長度，縱莖長度為3.0-3.6mm的花蕾；將采集的花蕾用濕紗布包裹后再用自封塑料袋套起，置于4℃冰箱中低溫處理2d，然后轉入36℃環境下熱激處理2d；
（2）培養基的配制
配制甜瓜花藥誘導培養基，培養基配方由每升蒸餾水中以下組分含量分別為：kno380-90mg/l，mgso4?7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2?4h2o160-200mg/l，mnso4?4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4?7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4?7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4?2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4?5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2?6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，谷氨酰胺450-550mg/l，維生素b10.9-1.1mg/l，維生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，煙酸4.5-5.5mg/l，肌醇120-140mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，胰島素1.8-2.2mg/l，環鳥苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基磺酸乙酯1.0-1.4g/l，蔗糖42-48g/l，瓊脂6.5-7.5g/l，6-ba0.8-1.2mg/l，naa0.8-1.2mg/l，甘露醇14-16g/l，椰乳27-33g/l，植物硫化激動素psk-α18-22pmol/l，ph值為：5.4-5.8；
培養基配方由每升蒸餾水中以下組分最佳含量分別為：kno385mg/l，mgso4?7h2o150mg/l，kh2po473mg/l，ca(no3)2?4h2o180mg/l，mnso4?4h2o27.5mg/l，na2-edta12.5mg/l，feso4?7h2o13.5mg/l，h3bo38.25mg/l，znso4?7h2o9.0mg/l，ki0.5mg/l，agno317mg/l，na2moo4?2h2o0.25mg/l，cuso4?5h2o0.025mg/l，cocl2?6h2o0.025mg/l，腺嘌呤15mg/l，谷氨酰胺500mg/l，維生素b11.0mg/l，維生素b60.7mg/l，vc0.6mg/l，煙酸5.0mg/l，肌醇130mg/l，甘氨酸4.0mg/l，胰島素2.0mg/l，環鳥苷酸0.2g/l，谷胱甘肽32.5mg/l，甲基磺酸乙酯1.2g/l，蔗糖45g/l，瓊脂7.0g/l，6-ba1.0mg/l，naa1.0mg/l，甘露醇15g/l，椰乳30g/l，植物硫化激動素psk-α20pmol/l，最佳配制ph值為5.6；
將培養基配制好后分裝于250ml的三角瓶中，每瓶盛50ml-70ml的培養基，密封后置于溫度為121℃、壓力為15kpa高壓蒸汽條件下滅菌20min，冷凝到45-55℃時，取出置于超凈工作臺中，無菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，甲基磺酸乙酯的添加方法為：配制好甲基磺酸乙酯溶液后，用滅菌的0.22μm的微孔濾膜過濾滅菌，待培養基高壓蒸汽滅菌后冷凝到45-55℃時，取出置于超凈工作臺中，無菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，搖勻冷凝，24h時間內接種；搖勻冷凝，24h時間內接種；
（3）花藥接種
取出預處理后的花蕾，先用流水沖洗1-2min，用鑷子剝去花柄，用小塊紗布包裹，浸入70%酒精中15s，用無菌水沖洗2-3次后轉入0.1%升汞溶液中消毒8-10分鐘，然后用無菌水沖洗3-4次，將花蕾放入覆有濾紙的滅菌培養皿內，無菌條件下剝取花藥接種到步驟2配制好的誘導培養基上，每瓶接入花藥14-16枚；
（4）花藥誘導培養
將接種花藥后的培養基置于溫度為26-28℃、光照強度1400-1800lx、光周期11h光/13h暗的環境下進行培養，誘導出花藥愈傷；
（5）花藥分化培養
待花藥愈傷長至直徑2.5cm后，挑選半透明、結構松散的愈傷組織轉接入分化培養基上進行分化培養，分化培養的條件為：溫度25-27℃、濕度為70%-80%、光照強度2000-2500lux、光周期12h光/12h暗，愈傷逐漸分化出綠苗；
（6）馴化與移栽
花藥分化培養35d后綠苗生長旺盛，此時將封口膜打開馴化煉苗，7d后將試管苗取出，將根部清洗干凈，移栽入溫室，常規栽培。
實施例1
一種甜瓜花藥誘導培養基，按照以下配方配制：
每升蒸餾水中以下組分含量分別為：kno385mg/l，mgso4?7h2o150mg/l，kh2po473mg/l，ca(no3)2?4h2o180mg/l，mnso4?4h2o27.5mg/l，na2-edta12.5mg/l，feso4?7h2o13.5mg/l，h3bo38.25mg/l，znso4?7h2o9.0mg/l，ki0.5mg/l，agno317mg/l，na2moo4?2h2o0.25mg/l，cuso4?5h2o0.025mg/l，cocl2?6h2o0.025mg/l，腺嘌呤15mg/l，谷氨酰胺500mg/l，維生素b11.0mg/l，維生素b60.7mg/l，vc0.6mg/l，煙酸5.0mg/l，肌醇130mg/l，甘氨酸4.0mg/l，胰島素2.0mg/l，環鳥苷酸0.2g/l，谷胱甘肽32.5mg/l，甲基磺酸乙酯1.2g/l，蔗糖45g/l，瓊脂7.0g/l，6-ba1.0mg/l，naa1.0mg/l，甘露醇15g/l，椰乳30g/l，植物硫化激動素psk-α20pmol/l，最佳配制ph值為5.6。
將培養基配制好后分裝于250ml的三角瓶中，每瓶盛50ml-70ml的培養基，密封后置于溫度為121℃、壓力為15kpa高壓蒸汽條件下滅菌20min，冷凝到45-55℃時，取出置于超凈工作臺中，無菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，甲基磺酸乙酯的添加方法為：配制好甲基磺酸乙酯溶液后，用滅菌的0.22μm的微孔濾膜過濾滅菌，待培養基高壓蒸汽滅菌后冷凝到45-55℃時，取出置于超凈工作臺中，無菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，搖勻冷凝，24h時間內接種；搖勻冷凝，24h時間內接種。
試驗甜瓜品種選為紅城10號和龍甜一號，花培育種方法按如下步驟操作：
花蕾取材與預處理：在大田常規栽培的甜瓜處于初花期時，上午9-11點采集生長健壯、無病蟲害的植株上取發育時期處于單核靠邊期的花蕾為試材，單核靠邊期的甜瓜花蕾選材標準為：測量甜瓜花蕾的縱莖長度，縱莖長度為3.0-3.6mm的花蕾；將采集的花蕾用濕紗布包裹后再用自封塑料袋套起，置于4℃冰箱中低溫處理2d，然后轉入36℃環境下熱激處理2d；
花藥接種：取出預處理后的花蕾，先用流水沖洗1-2min，用鑷子剝去花柄，用小塊紗布包裹，浸入70%酒精中15s，用無菌水沖洗2-3次后轉入0.1%升汞溶液中消毒9分鐘，然后用無菌水沖洗3-4次，將花蕾放入覆有濾紙的滅菌培養皿內，無菌條件下剝取花藥接種到步驟2配制好的誘導培養基上，每瓶接入花藥14-16枚；
花藥誘導培養：將接種花藥后的培養基置于溫度為27℃、光照強度1600lx、光周期11h光/13h暗的環境下進行培養，誘導出花藥愈傷，統計花藥愈傷組織誘導率，花藥愈傷組織誘導率（%）=花藥愈傷組織數/接種花藥數×100%，實際統計得到紅城10號和龍甜一號花藥愈傷組織誘導率分別為35.4%和28.8%；
花藥分化培養：待花藥愈傷長至直徑2.5cm后，挑選半透明、結構松散的愈傷組織轉接入分化培養基上進行分化培養，分化培養的條件為：溫度26℃、濕度為75%、光照強度2250lux、光周期12h光/12h暗；愈傷逐漸分化出綠苗；
馴化與移栽：花藥分化培養35d后綠苗生長旺盛，此時將封口膜打開馴化煉苗，7d后將試管苗取出，將根部清洗干凈，移栽入溫室，常規栽培。
實施例2
在本發明的甜瓜花藥誘導培養的研發過程中，進行了培養基組分的單因子配比試驗，培養基配方的單因子試驗組分種類分別為：腺嘌呤、vc、胰島素、環鳥苷酸、甲基磺酸乙酯、椰乳和植物硫化激動素psk-α。每個試驗組分差異均僅限一種，其它組分與實施例1相同。試驗甜瓜品種均亦選為紅城10號和龍甜一號，培養基的配制方法、花培育種方法均與實施例1相同。
單因子配比試驗具體配比和試驗結果如下表1-表7。
由表1到表7的甜瓜花藥誘導培養基組分改變的單因子試驗可以發現，培養基配方的單因子試驗組分種類中胰島素、甲基磺酸乙酯和椰乳配比的增加產生了顯著的不利效應；而腺嘌呤、vc、環鳥苷酸和植物硫化激動素psk-α的增加不能顯著增加培養基的誘導效果，由于這些添加物的增加會提高培養基的配制成本，在培養基誘導效果達最優值的最小配比量是綜合生產成本后的最佳配比。由此可見，進行任何培養基組分的增加或減少均是不利的，同時說明本發明的組分配比是最優的。
實施例3
為了比較本發明所提供的甜瓜花藥誘導培養基與其它培養基對甜瓜花藥胚性愈傷組織誘導效率的差異，我們另外選擇了2種花藥誘導培養基，試驗品種亦采用紅城10號和龍甜一號，花藥分離方法、組培操作方法、培養方法均與實施例1相同，胚性愈傷組織形成后分別統計紅城10號和龍甜一號的花藥在該2種培養基內的花藥愈傷組織誘導率。
其它2種花藥誘導培養基配方為：
c17-2培養基：c17-2基本培養基+20g/l蔗糖+7g/l瓊脂+2mg/l2，4-d+1mg/l激動素，ph為5.8（對比文件來自于f?s?wen等《高粱花藥和花序培養誘導愈傷組織及再生植株》）；
ms培養基：ms基本培養基+3%蔗糖＋1.0mg/lnaa＋1.0mg/lkt＋10%椰乳，ph為5.8（對比文件來自于高秀云等《番茄花藥離體培養獲得植株》）。
培養基對比實驗
將采用本發明所提供的花藥誘導培養基與對比實施例所提供的其它2種培養基誘導紅城10號和龍甜一號花藥愈傷組織統計所得的花藥愈傷組織誘導率進行比較，比較結果如下表8所示。
由上表8可以發現，本發明提供的甜瓜花藥誘導培養基及花培育種方法對甜瓜品種紅城10號和龍甜一號的花藥愈傷組織誘導率均值高達32.1%，，可以發現本發明的甜瓜花藥誘導培養基及花培育種方法特異性針對甜瓜花藥培養要求進行創造性改良的成果，首次建立了甜瓜花培育種程序。采用本發明所提供的培養基可以大大提高甜瓜花藥愈傷組織誘導效率，因此具有較高的產業推廣價值。
本領域技術人員可以根據本發明公開的內容和所掌握的本領域技術對本發明內容作出替換或變型，但是這些替換或變型都不應視為脫離本發明構思的，這些替換或變型均在本發明要求保護的權利范圍內。