Tert啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述方法包括下述步驟：以包含TERT啟動(dòng)子基因的待測(cè)基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增TERT啟動(dòng)子基因；PCR擴(kuò)增完成后通過sanger測(cè)序法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；將PCR產(chǎn)物的序列與正常TERT啟動(dòng)子基因序列進(jìn)行對(duì)比，得到TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于首次在泌尿系腫瘤中發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子的高頻突變，為泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤預(yù)后和監(jiān)測(cè)的提供一種新的生物標(biāo)志物。
【專利說明】TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法。
_2] 【背景技術(shù)】
膀胱癌是排在第九位的全球最常見的腫瘤。2013年，在美國有超過73000名患者被診斷為膀胱癌，其中死亡人數(shù)約15000人。其中超過90%的患者最初診斷為原發(fā)性膀胱癌，大約75%的患者目前為表淺膀胱腫瘤，20%的為浸潤性膀胱腫瘤，剩下的5%初診為轉(zhuǎn)移性腫瘤。先前的研究表明，膀胱癌有著多變的臨床表現(xiàn)和遺傳背景。最近的膀胱腫瘤研究報(bào)道了 8 個(gè)相關(guān)基因(UTX, MLL-MLL3, CREBBP-EP300，NCORl，ARID1A, CHD6)。
[0003] 目前檢測(cè)“膀胱癌”采用的腫瘤標(biāo)記物主要有以下幾種，但是各腫瘤標(biāo)志物都存在不同的缺點(diǎn):
(1)、膀胱腫瘤抗原(BTA):BTA試劑分為BTA stat和BTA test兩種；首先，這兩種試劑都不能獨(dú)立用于確診膀胱癌；另外，BTA試劑價(jià)格昂貴，目前尚難以全面推廣使用；
(2)、LewisX抗原檢測(cè):Lewis X是一種ABO血型相關(guān)抗原，在正常尿路上皮中不存在該抗原；而5%~89%的移行細(xì)胞癌可檢出Lewis X,但Lewis X與腫瘤的分級(jí)無關(guān)；
(3)、核基質(zhì)蛋白22(nuclear matrix protein22,NMP22):NMP22是核有絲分裂器蛋白，診斷膀胱癌的敏感性為48%~90%，特異性為70%~92%，NMP22對(duì)高級(jí)，高期膀胱癌敏感性較高；
(4)、纖維蛋白/纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrindegradation products, FDP):用快速免疫檢測(cè)法測(cè)定尿中FDP診斷膀胱癌的敏感性為68%，對(duì)T2~T4期膀胱癌的敏感性更是高達(dá)100% ；
(5)、玻璃酸酶檢測(cè)hyaluronidase,HAase:玻璃酸酶是一種細(xì)胞外降解基質(zhì)透明質(zhì)酸的內(nèi)源性糖苷酶，在腫瘤進(jìn)展中起重要作用，應(yīng)用凝膠技術(shù)檢測(cè)G2，G3級(jí)膀胱癌尿液中玻璃酸酶活性，敏感性達(dá)92%~100% ；
(6)、端粒酶活性(telomerase):端粒是位于染色體末端的保護(hù)性結(jié)構(gòu)，隨細(xì)胞分裂逐步縮短，直至細(xì)胞死亡，端粒酶的作用就是延長端粒，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性增強(qiáng)，該法診斷包括低級(jí)，低期腫瘤在內(nèi)的膀胱癌，敏感性可達(dá)91%。
[0004]然而，導(dǎo)致膀胱腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)仍未完全闡明，同時(shí)由于這些個(gè)體標(biāo)記的靈敏性較低以至于未被應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，這表明需要新的靈敏性高的生物標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在本發(fā)明的試驗(yàn)過程中，在超過85%的人類腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT, TERT通過Human Genome Browser獲取NCBI發(fā)布版本37的人類基因組序列:Feb.2009(GRCh37/hgl9 ) ；>hgl9_ensGene_ENST00000310581_0 range=chr5:1295163-
1296562 5’pad=400 3’pad=0 strand=- repeatMasking=none)活躍，我們認(rèn)為是一個(gè)人類腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。TERT是端粒酶的催化部分，位于5號(hào)染色體短臂，在人類腫瘤中調(diào)節(jié)端粒酶活性。最近人們應(yīng)用全基因組測(cè)序在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子突變。人們?cè)谝恍┌螂装颖局凶C實(shí)了高頻率的TERT啟動(dòng)子突變。一些研究發(fā)現(xiàn)，具有活性的端粒酶或TERT表達(dá)增加與腫瘤的病理分期以及臨床分期是相關(guān)聯(lián)的。然而，人們還未獲得TERT基因拷貝，TERT的表達(dá)或活性對(duì)膀胱癌的臨床影響仍然是有爭(zhēng)議的。在本發(fā)明中，我們通過試驗(yàn)得到TERT啟動(dòng)子的高頻突變位點(diǎn)，并進(jìn)行了相關(guān)的體外功能分析試驗(yàn)來證實(shí):這些啟動(dòng)子的突變可提高ETRT活性，是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)所在，這些突變對(duì)泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷和預(yù)后具有重要的意義。
[0006]本發(fā)明的目的在于公開了一種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法。
[0007]—種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法，包括下述步驟:
以包含TERT啟動(dòng)子基因的待測(cè)基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增TERT啟動(dòng)子基因，所述引物對(duì)P為 :
TF:5，CAGCGCTGCCTGAAACTC3’
TR:5’ GTCCTGCCCCTTCACCTT3’ ；
PCR擴(kuò)增完成后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序，檢測(cè)得到TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性，所述單核苷酸多態(tài)性序列包括:
TERT啟動(dòng)子chr5，I, 295，228位為C或T的堿基多態(tài)性序列；
TERT啟動(dòng)子chr5，I, 295，242-1，295，243位為CC或TT的堿基多態(tài)性序列；
TERT啟動(dòng)子chr5，I, 295，250位為C或T的堿基多態(tài)性序列。
[0008]上述技術(shù)方案所述的一種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法，其中，所述的 PCR 反應(yīng)體系體積為 20 μ 1，含有 dNTP 2 μ IUOXPCR Buffer 2 μ 1、TF(10 μ Μ)I μ 1,TR(10 μ Μ) I μ 1、模板 DNA I μ UdH2O 12.5μ I 和 TaKaRa Taq HS 0.5 μ I。
[0009]上述技術(shù)方案所述的一種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法，其中，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?93°C 2分鐘預(yù)變性，然后按93 °C I分鐘，55 °C I分鐘，72 °C I分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，最后72°C 7分鐘延伸。
[0010]本發(fā)明具有以下有益效果:
1、本發(fā)明為檢測(cè)膀胱癌提供一種新的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)發(fā)現(xiàn)膀胱癌及其相關(guān)疾病的易感人群和基因診斷有重要價(jià)值；
2、本發(fā)明中的TERT啟動(dòng)子的高頻突變可能膀胱癌發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)所在，對(duì)探索膀胱癌等疾病的發(fā)病機(jī)制有重要意義；
3、本發(fā)明為臨床生物治療提供了分子靶向，同時(shí)也開辟新的治療途徑起到重要作用。
[0011]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為通過ABI 3730 XL測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序得到的反鏈上體細(xì)胞突變位點(diǎn)；
圖2為PCR(RT-PCR)對(duì)TERT表達(dá)的分析結(jié)果，其中WT為野生型、C228T為正鏈chr5，I, 295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295，250 OT ；
圖3為蛋白免疫印記技術(shù)檢測(cè)TERT的表達(dá)分析結(jié)果，其中WT為野生型、C228T為正鏈chr5, 1，295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295, 250 OT ；
圖4為染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試驗(yàn)檢測(cè)TERT表達(dá)分析結(jié)果，其中WT為野生型、C228T 為正鏈 chr5, 1，295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295, 250 OT ；圖5為劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TERT啟動(dòng)子突變對(duì)膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力的結(jié)果，其中WT為野生型、C228T 為正鏈 chr5, 1，295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295, 250 OT0
[0012]【具體實(shí)施方式】:
為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明一種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法作進(jìn)一步的說明。
[0013]試驗(yàn)例1:一種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法:
一、樣本來源及選擇標(biāo)準(zhǔn):
用中國泌尿生殖系統(tǒng)癌癥基因組學(xué)協(xié)會(huì)(UCGC)會(huì)員機(jī)構(gòu)新診斷的泌尿系統(tǒng)癌癥病人的腫瘤組織作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)用患者的外周血或形態(tài)正常膀胱組織作為對(duì)照組。所有標(biāo)本收集后用液氮快速冷凍并立即存儲(chǔ)在_80°C的環(huán)境中以用于更遠(yuǎn)研究。由兩個(gè)獨(dú)立的病理學(xué)家在顯微鏡下評(píng)估由蘇木精-伊紅(HE)染色制備的癌組織切片。在本研究中，僅有腫瘤細(xì)胞超過80%的腫瘤組織被用來提取DNA和進(jìn)行隨后的測(cè)序。目前研究中總共有302位泌尿生殖系腫瘤患者參與測(cè)序，包括216名膀胱癌患者，11名腎盂癌患者，24名腎細(xì)胞癌患者，21名腎上腺腫瘤患者，17名睪丸癌患者及13名前列腺癌患者。
[0014]樣本的選擇標(biāo)準(zhǔn):1、所有患者(302例)在術(shù)前都未經(jīng)放療或化療；2、患者都是由中山腫瘤中心確診的；3、樣本組織都是新鮮組織，切下后30分鐘內(nèi)放入RNAlater中，并在4° C冷藏過夜，其后-80° C低溫儲(chǔ)存；4、經(jīng)HE染色，腫瘤細(xì)胞超過80%的腫瘤組織；5、正常托腎組織在病理學(xué)檢查中顯示正常的腎小管和腎小球且無腫瘤細(xì)胞污染；6、年齡大于18歲。
[0015]二、主要試劑和儀器
QIAamp DNA Mini Kits (試劑盒、希爾登，德國)；Dual 96-well GeneAmp PCRSystem 9700(美國，Life Technologies公司)；ABI 3730 XL測(cè)序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);TAKARATaqTM Hot Start (試劑盒、大連寶生物工程有限公司)。
[0016]三、操作步驟:
(一)、按照QIAamp DNA Mini Kits試劑盒中說明書的步驟對(duì)302例樣本(癌癥患者的腫瘤組織作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)用患者的外周血或形態(tài)正常膀胱組織作為對(duì)照組)中的DNA進(jìn)行提取:
1、切割組織樣品，確定組織的數(shù)量，對(duì)于樣本組織的取材應(yīng)在25mg以內(nèi)。DNA產(chǎn)量與組織類型和大小有關(guān)，一般來說Img組織可得到大約0.2-1.2 μ g的DNA。
[0017]2、將切割下來的組織樣品切碎(step2a),研磨(step2b):
2a.將約25毫克的組織樣品切成小塊。放入一個(gè)1.5ml離心管，并添加180 μ I Buffer
ATL。
[0018]2b.在將組織樣品置于液氮中，研磨磨徹底后倒入到1.5ml離心管。加入180 μ IBuffer ATL0此過程中，液氮可以揮發(fā)，但組織不能融化。
[0019]3、加入20μ1 proteinase K,振蕩處理20s, 56°C水浴至組織完全裂解。
[0020]注:proteinase K必須使用，因?yàn)镼IAGEN Protease在Buffer ATL存在的情況下活性已降低。裂解時(shí)間視組織塊大小而定，通常l_3h即可完全裂解。過夜處理是合理的，無不良影響。為保證裂解效率，應(yīng)使用振蕩水浴或者振蕩臺(tái)。
[0021]4、1.5毫升微型離心機(jī)短時(shí)離心，以去除離心管蓋內(nèi)沿液體。[0022]5、加入200 μ I Buffer AL，振蕩15S，70°C水浴lOmin。1.5毫升微型離心機(jī)短時(shí)離心，以去除離心管蓋內(nèi)沿液體。
[0023]加入Butter AL后，可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀物，70°C水浴中大都可以溶解。這些沉淀物對(duì)于抽提過程和后續(xù)實(shí)驗(yàn)沒有影響。
[0024]6、加入200 μ I乙醇(濃度為96%_100%)，振蕩15s，1.5毫升微型離心機(jī)短時(shí)離心，
以去除離心管蓋內(nèi)沿液體。加入乙醇后，可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀物。這些沉淀物對(duì)于抽提過程和后續(xù)實(shí)驗(yàn)沒有影響。
[0025]7、仔細(xì)的將以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp Mini spincolumn中，將離心柱放入2ml收集管中。蓋緊離心管蓋，以6000X g(8000rpm)離心lmin。將離心管取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)，丟棄舊的收集管與濾液。6000 Xg (8000rpm)離心是為了減少噪音，最大速度離心不影響DNA產(chǎn)量和純度。務(wù)必使所有溶液進(jìn)入到收集管，如沒有，則需再次以更高速度離心直至所有溶液進(jìn)入收集管。
[0026]8、小心加入 500 μ I Buffer AWl 到 QIAamp Mini spin column 中，蓋緊離心管蓋，以6000Xg(8000rpm)離心lmin。將離心管取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)。丟棄收集管及其中的慮液。
[0027]9、小心加入 500μ1 Buffer AW2 到 QIAamp Mini spin column 中；蓋緊離心管蓋，以 20000 X g (14000rpm)離心 3min。
[0028]10、將QIAamp Mini spin column置入一支新的2ml收集管中(自備)，丟棄舊的收集管與濾液。全速離心lmin。此步是為了防止Buffer AW2殘留。
[0029]11、將QIAamp Mini spin column置入一支潔凈1.5ml收集管中(自備)，丟棄舊的收集管與濾液。小心在QIAamp Mini spin column中加入200 μ I Buffer AE或蒸懼水。室溫下靜置 lmin,6000Xg(8000rpm)離心 lmin。
[0030]12、重復(fù)step 11之離心操作。將收集管蓋好，保存于_20°C，此時(shí)收集管中為腫瘤和正常對(duì)照的DNA。
[0031](二)、PCR 引物設(shè)計(jì):
針對(duì)TERT核心啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物,用primer5.0設(shè)計(jì)引物:
TF: 5， -CAGCGCTGCCTGAAACTC-3，；
TR: 5’ -GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’。
[0032](三)、進(jìn)行PCR擴(kuò)增:利用Dual96-well GeneAmp PCR System 9700 (美國，LifeTechnologies公司)PCR擴(kuò)增儀,用步驟(二)中相同的引物擴(kuò)增從步驟(一)中獲得的DNA模板，.按照TAKARATaqTM Hot Start PCR試劑盒的說明書要求擴(kuò)增出啟動(dòng)子片斷:
(I)、按表1中的組份配制PCR反應(yīng)體系(在冰上進(jìn)行反應(yīng)體系的配制)。
[0033]表1 PCR反應(yīng)體系
【權(quán)利要求】
1.一種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法，包括下述步驟: 以包含TERT啟動(dòng)子基因的待測(cè)基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增TERT啟動(dòng)子基因，所述引物對(duì)P為:
TF:5，CAGCGCTGCCTGAAACTC3’
TR:5’ GTCCTGCCCCTTCACCTT3’ ； PCR擴(kuò)增完成后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序 ，檢測(cè)得到TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性，所述單核苷酸多態(tài)性序列包括: TERT啟動(dòng)子chr5，I, 295，228位為C或T的堿基多態(tài)性序列； TERT啟動(dòng)子chr5，I, 295，242-1，295，243位為CC或TT的堿基多態(tài)性序列； TERT啟動(dòng)子chr5，I, 295，250位為C或T的堿基多態(tài)性序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種TERT啟動(dòng)子的單核 苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)體系體積為20 μ 1，含有dNTP 2 μ IUOXPCR Buffer 2 μ 1、TF(10μ Μ) I μ 1,TR(10 μ Μ) I μ 1、模板 DNA I μ 1、dH20 12.5 μ I 和 TaKaRa Taq HS 0.5 μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?93°C 2分鐘預(yù)變性，然后按93°C I分鐘，55°C I分鐘，72 0C I分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，最后72 °C 7分鐘延伸。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103571953SQ201310514526
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】吳松, 黃嫻, 王波, 蔡志明, 梅紅兵 申請(qǐng)人:深圳市第二人民醫(yī)院