一種制備及快速分離胞內單寧酶的方法
【專利摘要】本發明涉及一種制備及快速分離胞內單寧酶的方法，屬于生物發酵和生物分離工程領域。本發明公開的一種制備及快速分離胞內單寧酶的方法，首先配置液體發酵培養基，滅菌、冷卻；往冷卻后的培養基內接入無花果曲霉孢子懸液進行液體發酵，制得無花果曲霉胞內單寧酶；發酵結束后，將發酵液冷凍離心，收集濕菌體，通過超聲和液氮研磨進行無花果曲霉細胞破壁，離心收集粗酶液；對離心后的粗酶液進行單寧酶純化。本發明采用液體發酵能制備胞內單寧酶，發酵條件較好控制，不易污染雜菌，生產效率高，能隨時檢測酶活力，且檢測過程中雜質干擾小。采用液體發酵方式研究了細胞內產生的單寧酶的性質，為單寧酶的綜合開發提供參考。
【專利說明】一種制備及快速分離胞內單寧酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種制備及快速分離胞內單寧酶的方法，屬于生物發酵和生物分離工程領域。
【背景技術】
[0002]單寧酶是一種誘導酶，由某些微生物在單寧酸等誘導物存在時誘導合成。單寧酶用途較廣，可用于皮革業、飼料業、化妝品液等方面，在開發茶飲業新產品和改善天然食品風味方面尤受重視。能水解沒食子單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖，也可以把沒食子酸和丙醇合成沒食子丙酯，還能水解茶葉中的酯型兒茶素，制備兒茶素單體，還可以作為食品添加劑用于開發茶飲料。中國是個茶葉大國，而且可開發的資源豐富，單寧酶的應用前景十分廣泛。
[0003]國內單寧酶研究主要集中在固態發酵及固態發酵生產的胞外單寧酶。而對胞內單寧酶的研究較少。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種制備及快速分離胞內單寧酶的方法，利用液體發酵可制備得胞內單寧酶，通過混合表面活性劑反膠團體系萃取可以快速分離得到大量高活力的胞內單寧酶，對研究不同來源的單寧酶的結構性質有重要意義，為單寧酶的工業化生產提供
理論基礎。
[0005]為解決以上技術問題，本發明提供了以下技術方案:`[0006]一種制備及快速分離胞內單寧酶的方法，包括以下步驟:
[0007](I)配置液體培養基，滅菌、冷卻；
[0008](2)液體發酵:往冷卻后的液體培養基內接入無花果曲霉孢子懸液進行發酵，制得無花果曲霉胞內單寧酶；
[0009](3)無花果曲霉細胞破壁:發酵結束后，將發酵液冷凍離心，收集濕菌體，通過超聲和液氮研磨進行無花果曲霉細胞破壁，離心收集粗酶液；
[0010](4)單寧酶純化:將粗酶液用硫酸銨沉淀、沉淀溶解后超濾，利用混合表面活性劑反膠束體系進行萃取，收集到的酶液經冷凍干燥制備成單寧酶粉末。
[0011]優選的是:步驟(2)所述的無花果曲霉編號為Gim3.6(購于廣東省菌種保藏中心)，無花果曲霉孢子懸液接入量為1.5mL,懸液濃度為I X IO8個孢子/mL。
[0012]優選的是:步驟(1)和步驟(2)所述的液體培養基由麥芽汁、酵母膏、五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L ;適合此培養基的發酵條件為:培養溫度30~35°C，轉速為180r/min的搖床中震蕩培養72~80h。
[0013]優選的是:步驟(1)和步驟(2)所述的液體培養基為:每升蒸餾水含25g單寧、15g蔗糖、3gNaN03、lgK2HP04、0.5gKCl、0.5gMgS04，所述的單寧在培養基滅菌后加入；適合此培養基的發酵條件為:培養溫度30~35°C，轉速為180r/min的搖床中震蕩培養80~90h。[0014]優選的是:步驟(3)所述的超聲功率為300W。
[0015]優選的是:步驟(4)所述的每毫升粗酶液加2.3g固體硫酸銨。
[0016]優選的是:步驟(4)所述的混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機相體系為:助溶劑正丁醇和有機溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質量比2:1，其中有機相體系和水相體積比為2:1，前萃取溫度為40°C，震蕩時間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液,其中有機相體系和水相體積比為2 反萃取溫度為40~45°C，pH為5.0~5.5，震蕩時間為30~40min。
[0017]本發明與現有技術相比，其進步之處在于:
[0018](I)本發明采用液體發酵能制備胞內單寧酶，發酵條件較好控制，不易污染雜菌。
[0019](2)本發明采用液體發酵方式研究了細胞內產生的單寧酶的性質，為單寧酶的綜合開發提供參考。
[0020](3)本發明采用混合表面活性劑反膠團體系體系對單寧酶進行萃取，提高了體系對單寧酶的萃取效率，前萃取率高達92%，反萃取率高達72%。
[0021](4)提取單寧酶過程中對細胞的破壁工藝進行超聲和液氮研磨方法聯合使用，既最大限度的提高破壁的效果，又降低了破壁過程中對酶活的損失。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例，對本發明作進一步詳細的闡述，但本發明的實施方式并不局限于實施例表示的范圍。 這些實施例僅用于說明本發明，而非用于限制本發明的范圍。此外，在閱讀本發明的內容后，本領域的技術人員可以對本發明作各種修改，這些等價變化同樣落于本發明所附權利要求書所限定的范圍。
[0023]以沒食子酸甲酯為底物，本發明制得的胞內單寧酶最合適的反應溫度為40°C，最適pH為6.8，在pH5.0到pH7.5之間保持較好的穩定性，測得其米氏常數為1.028mmol/L,Vmax為96.25 μ mol/ (L.min),總酶活為5198U,總蛋白含量為216mg,比活力為24.06U/
mg ο
[0024]實施例1
[0025]液體發酵培養基由麥芽汁，酵母膏，五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L。IOOmL液體發酵培養基經滅菌、冷卻后，接入
1.5mL無花果曲霉孢子懸液(I X IO8個孢子/mL)，置于搖床中震蕩培養，培養溫度為30°C，轉速為180r/min,培養80h后將發酵液以5000r/min冷凍離心20min,得到濕菌體。所述的無花果曲霉購于廣東省菌種保藏中心，菌種編號為Gim3.6。取5g濕菌體置于研缽中，迅速倒入適量液氮，用缽棒充分研磨，溶于200mL檸檬酸緩沖液中，在300W超聲功率下超聲15min,懸濁液經12000r/min冷凍離心30min，所得上清液即為粗酶液。每毫升粗酶液加入
2.3g固體硫酸銨，收集沉淀，每克沉淀用IOml緩沖液溶解，超濾(超濾管的膜直徑為30ku)后利用混合反膠束體系進行萃取，即可得到純度較高的單寧酶酶液。酶液經真空冷凍干燥制備成粉末即可保存。經測定酶活為140U/g。
[0026]混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機相體系為:助溶劑正丁醇和有機溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質量比2:1，其中有機相體系和水相體積比為2:1,前萃取溫度為40°C,震蕩時間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機相體系和水相體積比為2:1，反萃取溫度為40°C，pH為5.0，震蕩時間為30min。實施例2
[0027]液體發酵培養基由麥芽汁，酵母膏，五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L。IOOmL液體發酵培養基經滅菌、冷卻后，接入
1.5mL無花果曲霉孢子懸液(I X IO8個孢子/mL)，置于搖床中震蕩培養，培養溫度為32°C，轉速為180r/min，培養75h后將發酵液以5000r/min冷凍離心20min，得到濕菌體。所述的無花果曲霉購于廣東省菌種保藏中心，菌種編號為Gim3.6。取5g濕菌體置于研缽中，迅速倒入適量液氮，用缽棒充分研磨，溶于200mL檸檬酸緩沖液中，在300W超聲功率下超聲15min,懸濁液經12000r/min冷凍離心30min，所得上清液即為粗酶液。每毫升粗酶液加入
2.3g固體硫酸銨，收集沉淀，每克沉淀用IOml緩沖液溶解，超濾(超濾管的膜直徑為30ku)后利用混合反膠束體系進行萃取，即可得到純度較高的單寧酶酶液。酶液經真空冷凍干燥制備成粉末即可保存。經測定酶活為130U/g。
[0028]混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機相體系為:助溶劑正丁醇和有機溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質量比2:1，其中有機相體系和水相體積比為2:1,前萃取溫度為40°C,震蕩時間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機相體系和水相體積比為2:1，反萃取溫度為42°C，pH為5.2，震蕩時間為35min。實施例3 [0029]液體發酵培養基由麥芽汁，酵母膏，五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L。150mL液體發酵培養基經滅菌、冷卻后，接入
1.5mL無花果曲霉孢子懸液(I X IO8個孢子/mL)，置于搖床中震蕩培養，培養溫度為35°C，轉速為180r/min，培養72h后將發酵液以5000r/min冷凍離心20min，得到濕菌體。所述的無花果曲霉購于廣東省菌種保藏中心，菌種編號為Gim3.6。取5g濕菌體置于研缽中，迅速倒入適量液氮，用缽棒充分研磨，溶于200mL檸檬酸緩沖液中，在300W超聲功率下超聲15min,懸濁液經12000r/min冷凍離心30min，所得上清液即為粗酶液。每毫升粗酶液加入
2.3g固體硫酸銨，收集沉淀，每克沉淀用IOml緩沖液溶解，超濾(超濾管的膜直徑為30ku)后利用混合反膠束體系進行萃取，即可得到純度較高的單寧酶酶液。酶液經真空冷凍干燥制備成粉末即可保存。經測定酶活為106U/g。
[0030]混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機相體系為:助溶劑正丁醇和有機溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質量比2:1，其中有機相體系和水相體積比為2:1,前萃取溫度為40°C,震蕩時間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機相體系和水相體積比為2:1，反萃取溫度為45°C，pH為5.5，震蕩時間為40min。實施例4
[0031]配置150mL液體發酵培養基，培養基配方為:每升蒸餾水含15g蔗糖、3gNaN03、lgK2HP04、0.5gKCl、0.5gMgS04，液體發酵培養基經滅菌、冷卻后，按每升培養基加入25g單寧，所述的單寧用少量去離子水溶解后過濾除菌。接入1.5mL無花果曲霉孢子懸液(I X IO8個孢子/mL)，置于搖床中震蕩培養，培養溫度30~35°C，轉速為180r/min的搖床中震蕩培養80~90h。將發酵液以5000r/min冷凍離心20min，得到濕菌體。所述的無花果曲霉購于廣東省菌種保藏中心，菌種編號為Gim3.6。取5g濕菌體置于研缽中，迅速倒入適量液氮，用缽棒充分研磨，溶于200mL檸檬酸緩沖液中，在300W超聲功率下超聲15min，懸濁液經12000r/min冷凍離心30min,所得上清液即為粗酶液。每毫升粗酶液加入2.3g固體硫酸銨，收集沉淀，每克沉淀用IOml緩沖液溶解，超濾(超濾管的膜直徑為30ku)后利用混合反膠束體系進行萃取，即可得到純度較高的單寧酶酶液。酶液經真空冷凍干燥制備成粉末即可保存。經測定酶活為128U/g。
[0032] 混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為經超濾后的粗酶液，有機相體系為:助溶劑正丁醇和有機溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機相體系中含量為5g/L，CTAB:Tween-60=2:l，其中有機相體系和水相體積比為2:1，前萃取溫度為40°C，震蕩時間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機相體系和水相體積比為2 反萃取溫度為45°C, pH為5.0,震蕩時間為30mino
【權利要求】
1.一種制備及快速分離胞內單寧酶的方法，包括以下步驟: (1)配置液體培養基，滅菌、冷卻； (2)液體發酵:往冷卻后的液體培養基內接入無花果曲霉孢子懸液進行發酵，制得無花果曲 霉胞內單寧酶； (3)無花果曲霉細胞破壁:發酵結束后，將發酵液冷凍離心，收集濕菌體，通過超聲和液氮研磨進行無花果曲霉細胞破壁，離心收集粗酶液； (4)單寧酶純化:將粗酶液用硫酸銨沉淀、沉淀溶解后超濾，利用混合表面活性劑反膠束體系進行萃取，收集到的酶液經冷凍干燥制備成單寧酶粉末。
2.根據權利要求1所述的制備及快速分離胞內單寧酶的方法，其特征在于:步驟(2)所述的無花果曲霉為無花果曲霉Gim3.6，無花果曲霉孢子懸液接入量為1.5mL,懸液濃度為IXlO8個孢子/mL。
3.根據權利要求1或2所述的制備及快速分離胞內單寧酶的方法，其特征在于:步驟(I)和步驟(2)所述的液體培養基由麥芽汁、酵母膏、五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L ;適合此培養基的發酵條件為:培養溫度30~35°C，轉速為180r/min的搖床中震蕩培養72~80h。
4.根據權利要求1或2所述的制備及快速分離胞內單寧酶的方法，其特征在于:步驟(I)和步驟(2)所述的液體培養基為:每升蒸餾水含25g單寧、15g蔗糖、3gNaN03、lgK2HP04、0.5gKCl、0.5gMgS04，所述的單寧在培養基滅菌后加入；適合此培養基的發酵條件為:培養溫度30~35°C，轉速為180r/min的搖床中震蕩培養80~90h。
5.根據權利要求1所述的制備及快速分離胞內單寧酶的方法，其特征在于:步驟(3)所述的超聲功率為300W。
6.根據權利要求1所述的制備及快速分離胞內單寧酶的方法，其特征在于:步驟(4)所述的每毫升粗酶液加2.3g固體硫酸銨。
7.根據權利要求1所述的制備及快速分離胞內單寧酶的方法，其特征在于:步驟(4)所述的混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機相體系為:助溶劑正丁醇和有機溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質量比2:1，其中有機相體系和水相體積比為2:1，前萃取溫度為40°C，震蕩時間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機相體系和水相體積比為2:1，反萃取溫度為40~45°C，pH為5.0~5.5，震蕩時間為 30 ~40min。
【文檔編號】C12N9/18GK103614351SQ201310593724
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】楊洋, 嚴東, 趙芬芬, 葉琴, 馬萬良, 胡振興 申請人:廣西大學