二肽的制造方法
【專利摘要】根據本發明，可以提供二肽的制造方法，其特征是將具有生產具有由1種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的能力、而且具有生產該1種以上的氨基酸中的至少1種氨基酸能力的微生物在培養基中進行培養，使二肽該培養基中生成、蓄積，從該培養基回收二肽。
【專利說明】二肽的制造方法
[0001]本申請是2005年6月24日提交的200580020690.6號發明專利申請“二肽的制造
方法”的分案申請。
【【技術領域】】
[0002]本發明涉及二肽的制造方法，其特征是將具有生產具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質能力，而且具有生產該I種以上的氨基酸中的至少I種氨基酸能力的微生物在培養基中進行培養，使二肽在培養基中生成、蓄積，從該培養基回收二肽。
【【背景技術】】
[0003]目前，很多氨基酸都是通過所謂的發酵法制造的(參照非專利文獻I和2)。這里所謂的發酵法指的是在由葡萄糖、醋酸、甲醇、氨、硫酸銨、玉米浸潰液等便宜的物質構成的培養基中培養微生物，利用微生物的代謝活性獲得目的氨基酸的方法。作為由便宜的原料通過環境負荷小的方法制造氨基酸的方法，發酵法是很好的制造方法。
[0004]有關肽的大量合成法已知有化學合成法(液相法、固相法)、酶促合成法和使用DNA重組法的生物合成法。現在，對于50殘基以上的長鏈肽使用酶促合成法或生物合成法，對于二肽主要使用化學合成法和酶促合成法。[0005]使用化學合成法合成二肽需要對官能團進行保護和去保護等操作，由于也合成消旋體，化學合成法不能說是經濟、有效的方法。另外由于化學合成法使用大量的有機溶劑等，從環境衛生方面看也不是一個好的方法。
[0006]通過酶法合成二肽已知有利用蛋白分解酶(蛋白水解酶)的逆反應的方法(參照非專利文獻3)、利用耐熱性氨酰t-RNA合成酶的方法(參照專利文獻I~4)、利用脯氨酸亞氨基肽酶的逆反應的方法(參照專利文獻5)、利用非核糖體肽合成酶(以下稱為NRPS)的方法(參照非專利文獻4、5和專利文獻6、7)。
[0007]然而，就利用蛋白水解酶的逆反應的方法來說，需要對底物氨基酸的官能團進行保護和去保護，存在著提高肽形成反應效率和阻止肽分解反應困難的問題。至于利用耐熱性氨酰t-RNA合成酶的方法，存在著酶的表達、阻止目的產物以外的副生物反應困難的問題。而利用脯氨酸亞氨基肽酶的方法存在著需要作為底物一方的氨基酸酰胺化的缺點。關于利用NRPS的方法需要供給作為輔酶的4’ -磷酸泛酰巰基乙胺(4’ -phosphopantetheine),不能說是有效的制造方法。
[0008]除了這些缺點外，這些方法無論那一種由于作為底物都使用氨基酸或它的衍生物，具有制造成本增加的缺點。
[0009]另外，已知酶分子量比NRPS小、不需要作為輔酶的4’ -磷酸泛酰巰基乙胺(4，-phosphopantetheine)的 Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y-glutamylcysteinesynthetase)、谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase)、D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)連接酶(D-Ala-D-Ala ligase)、聚-Y -谷氨酸合成酶(poly- y -glutamatesynthetase)等一組肽合成酶。幾乎所有這些酶由于都具有使用D-氨基酸作為底物催化在Y位羧基形成肽鍵等特征，所以不能用于在L-氨基酸的α位羧基形成肽鍵的二肽的合成。
[0010]另外,據報道在已知作為抗生物質7 y 'y > (albonoursin)的生產株的諾爾斯氏鏈霉菌(Streptomyces noursei) ATCCl 1455株中，與NRPS酶完全不相似的蛋白質(albC基因產物)負責環(L-苯丙氨酰-L-亮氨酸)[環(L-phenylalanyl-L-leucine)]結構的合成，如果使環二肽氧化酶作用于導入了 albC基因的大腸桿菌(Escherichia coli)和淺青紫鏈霉菌(Streptomyces Iividans)的培養液，可以檢測到albonoursin (參照非專利文獻6)，但還沒有g猛基因產物生成直鏈狀二肽的報告。
[0011]已知通過在L-氨基酸的α位羧基形成肽鍵活性生成二肽只有來自屬于芽孢桿菌屬的微生物的作為二肽抗生物質的桿菌溶素合成酶。已知桿菌溶素合成酶具有合成桿菌溶素(L-丙氛酸-L-anticapsin、L-Ala-L-anticapsin)和L-丙氛酸-L-丙氛酸(L-Ala-L-Ala)的活性，至于其它的二肽的合成活性還不知道(參照非專利文獻7和8)。
[0012]另外，有關全某閔纟目情報已闡明的枯草芽孢桿菌(BaciIIus subtilis) 168株(參照非專利文獻9)中的桿菌溶素生物合成酶基因組，已知如果對含有Μ?Κ~E的ORF的桿菌溶素操縱子進行擴增，可增加桿菌溶素的產率(參照專利文獻8)。然而，在這些ORF中還不知道是否含有編碼具有通過肽鍵連接2種以上的氨基酸的活性的蛋白質的0RF，如果含有，哪一個ORF編碼該蛋白質也不清楚。
[0013]即，到目前為止也不了解通過發酵生產制造由I種以上的氨基酸構成的二肽的方法。
[0014]【非專利文獻I】氨基酸發酵、學會出版中心、相田浩等(1986)
[0015]【非專利文獻2】Biotechnology2nd ed., Vol.6, Products of PrimaryMetabolism, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim(1996)
[0016]【非專利文獻3] J.Biol.Chem..119.707-720(1937)
[0017]【非專利文獻4】Chem.Biol.,7, 373-384(2000)
[0018]【非專利文獻5】FEBS Lett..498.42-45(2001)
[0019]【非專利文獻6】Chemistry&Biol?，色 1355-1364(2002)
[0020]【非專利文獻7] J.1nd.Microbiol., 2, 201-208(1987)
[0021]【非專利文獻8】Enzyme.Microbial.Technol., 29, 400-406 (2001)
[0022]【非專利文獻9 】Nature, 390, 249-256 (1997)
[0023]【專利文獻I】特開昭58-146539號公報
[0024]【專利文獻2】特開昭58-209991號公報
[0025]【專利文獻3】特開昭58-209992號公報
[0026]【專利文獻4】特開昭59-106298號公報
[0027]【專利文獻5】國際公開專利第03-010307號小冊子
[0028]【專利文獻6】美國專利第5795738號
[0029]【專利文獻7】美國專利第5652116號
[0030]【專利文獻8】國際公開專利第00-03009號小冊子【
【發明內容】
】[0031]【發明要解決的課題】
[0032]本發明的目的在于提供供二肽的制造方法，其特征是將具有生產具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的能力，而且具有生產、蓄積該I種以上的氨基酸中的至少1種氨基酸的能力的微生物在培養基中進行培養，使二肽該培養基中生成、蓄積，從該培
養基回收二肽。
[0033]【用于解決課題的手段】
[0034]本發明涉及到以下(I)~(15)內容。
[0035](I) 二肽的制造方法，其特征是將具有生產具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的能力，而且具有生產該I種以上的氨基酸中的至少I種氨基酸的能力的微生物在培養基中進行培養，使二肽在該培養基中生成、蓄積，從該培養基回收二肽
[0036](2)上述(I)所述的制造方法，其中具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質是選自以下[I]~[11]中的蛋白質:
[0037][I]具有序列號I~8中的任一個表示的氨基酸序列的蛋白質
[0038][2]由在序列號I~8中的任一個表示的氨基酸序列缺失、置換或附加I個以上的氨基酸的氨基酸序列構成、而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質
[0039][3]由與序列號I~8中的任一個表不的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列構成，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質
[0040][4]具有與序列號17表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質
[0041][5]具有由序列號37或38表不的氣基酸序列的蛋白質
[0042][6]由在序列號37或38表示的氨基酸序列中缺失、置換或附加I個以上的氨基酸的氨基酸序列構成，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質
[0043][7]由與序列號37或38表示的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列構成，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質
[0044][8]具有非核糖體肽合成酶(以下稱為NRPS)活性的蛋白質
[0045][9]具有序列號43表示的氨基酸序列的蛋白質
[0046][10]由在序列號43表示的氨基酸序列中缺失、置換或附加I個以上的氨基酸的氨基酸序列構成，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質
[0047][11]由與序列號43表示的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列構成，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質。
[0048](3)上述(I)或(2)所述的制造方法，其中具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質是由選自以下[I]~[8]中的DNA編碼的蛋白質:
[0049][I]具有序列號9~16和36中的任一個表不的堿基序列的DNA
[0050][2]和具有與序列號9~16和36中的任一個表示的堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格的條件下雜交，而且編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA
[0051][3]和具有與序列號18表示的堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格的條件下雜交，而且編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA
[0052][4]具有序列號39或40表示的堿基序列的DNA
[0053][5]和具有與序列號39或40表示的堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格的條件下雜交，而且編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA
[0054][6]編碼具有NRPS活性的蛋白質的DNA
[0055][7]具有序列號44表不的喊基序列的DNA
[0056][8]和具有與序列號44表示的堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格的條件下雜交，而且編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA。
[0057](4)上述(I)所述的制造方法，其中具有生產具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的能力的微生物是帶有重組DNA的微生物，該重組DNA含有上述(3)的[I]~
[8]中任一個DNA。
[0058](5)上述(I)~(4)中的任一個制造方法,其中生產氨基酸的能力是通過選自以下
[I]~[5]中的方法獲得的:
[0059][I]緩和或解除至少一個控制該氨基酸生物合成的結構的方法
[0060][2]對至少一個參與該氨基酸生物合成的酶表達增強的方法
[0061][3]使至少一個參與該氨基酸生物合成的酶基因的拷貝數增加的方法
[0062][4]對至少一個由該氨基酸生物合成途徑到該氨基酸以外的代謝產物旁路的代謝途徑進行弱化或阻斷的方法
[0063][5]與野生型株相比，選擇對該氨基酸的類似物抗性高的細胞株的方法。
[0064](6)上述(I)~(5)中的任一個制造方法，其中微生物是屬于埃希氏菌屬、棒桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、假單孢菌屬或鏈霉菌屬的微生物。
[0065](7)上述(6)所述的制造方法,其中屬于埃希氏菌屬、棒桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、假單孢菌屬或鏈霉菌屬的微生物是大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、產氨棒桿菌、乳酸發酵棒桿菌、黃色棒桿菌、Corynebacterium efficiens、枯草芽抱桿菌、巨大芽抱桿菌、粘質沙雷氏菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、天藍色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌。
[0066](8)上述(I)~(5)中的任一個制造方法，其中微生物是I種以上的肽酶和具有I種以上肽轉運活性的蛋白質(以下也稱為肽轉運蛋白質)的活性低下或喪失的微生物。
[0067](9)上述(I)~(5)中的任一個制造方法，其中微生物是3種以上肽酶的活性低下或喪失的微生物。
[0068](10)上述(8)或(9)所述的制造方法，其中肽酶是具有序列號45~48中的任一個表示的氨基酸序列的蛋白質、或具有與序列號45~48中的任一個表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列，而且具有肽酶活性的蛋白質。
[0069](11)上述(8)或(10)所述的制造方法，其中肽轉運蛋白質是具有序列號49~53中的任一個表示的氨基酸序列的蛋白質、或由與序列號49~53中的任一個表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列構成的蛋白質，而且具有肽轉運活性的蛋白質。
[0070](12)上述(8)~(11)中的任一個制造方法，其中微生物是屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬或棒桿菌屬的微生物。
[0071](13)上述(12)所述的制造方法，其中屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬或棒桿菌屬的微生物是大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、產氨棒桿菌、乳酸發酵棒桿菌、黃色棒桿菌、Corynebacterium eff iciens、枯草芽抱桿菌或巨大芽抱桿菌。
[0072](14)上述(I)~(13)中的任一個制造方法，其中氨基酸是選自L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-天冬氨酸、L- α -氨基丁酸、L-4-羥基脯氨酸、L_3_羥基脯氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸的氨基酸。
[0073](15)上述(I)~(14)中的任一個制造方法，其中二肽是式(I)表示的二肽；
[0074]R1-R2 (I) [0075](式中，R1和R2可以相同或不同，表示選自L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-天冬氨酸、L- α -氨基丁酸、L-4-羥基脯氨酸、L-3-羥基脯氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸的氨基酸)。
[0076]【發明的效果】
[0077]根據本發明可以提供二肽的制造方法，其特征是將具有生產具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質的能力，而且具有生產該I種以上的氨基酸中的至少I種氨基酸能力的微生物在培養基中進行培養，使二肽在培養基中生成、蓄積，從該培養基回收二肽。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0078]【圖1】圖1是表示質粒ρΡΕ43的構建過程的圖。
[0079]【圖2】圖2是表示質粒pQE60ywfE的構建過程的圖。
[0080]【圖3】圖3是表示作為具有直鏈二肽的合成活性的蛋白質的表達質粒載體pAL-nou和pAL-alb的構建過程的圖。
[0081]【圖4】圖4是表示作為WfE基因表汰強化型載體的pPE56的構建過程的圖。
[0082]【圖5】圖5是表示作為WfE基因和aid基因表汰載體的dPE86的構建過程的圖。
[0083]【圖6】圖6是表示作為抗反饋型PheA基因表達載體的pPHEA2、以及抗反饋型pheA基因和抗反饋型_基因表達質粒載體的PPHEAF2的構建過程的圖。
[0084]【符號說明】
[0085]ywfE:來自枯草芽孢桿菌168株的ywfE基因
[0086]Ptrp:色氨酸啟動子基因
[0087]P:m:T5 啟動子
[0088]Ampr:氨芐青霉素抗性基因
[0089]IacIg:乳糖阻遏蛋白基因
[0090]albC:albC某閔或albC類似某閔
[0091]aid:ald 基因
[0092]DheAfltt:杭反饋型DheA某閔
[0093]aroF^:抗反饋型aroF基因
【【具體實施方式】】
[0094]本發明制造方法中使用的具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質只要是具有由I種以上的氨基酸生成同一或不同氨基酸通過肽鍵生成二肽的活性的蛋白質，可以是任一種蛋白質，作為該蛋白質，例如、
[0095][1]具有序列號1~8中任一個序列表示的氨基酸序列的蛋白質
[0096][2]由在序列號1~8中的任一個表示的氨基酸序列缺失、置換或附加I個以上的氨基酸的氨基酸序列構成，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質
[0097][3]由與序列號1~8中的任一個表不的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列構成，而且具有由1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質
[0098][4]具有與序列號17表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質
[0099][5]具有由序列號37或38表示的氨基酸序列的蛋白質
[0100][6]由在序列號37或38表示的氨基酸序列中缺失、置換或附加1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成，而且具有由1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質
[0101][7]由與序列號37或38表示的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列構成，而且具有由1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質
[0102][8]具有非核糖體肽合成酶(以下稱為NRPS)活性的蛋白質
[0103][9]具有序列號43表不的氣基酸序列的蛋白質
[0104][10]由在序列號43表示的氨基酸序列中缺失、置換或附加1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質
[0105][11]由與序列號43表示的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列構成，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質。
[0106]本發明中所說的氨基酸，是下面本發明制造方法中使用的微生物生產的氨基酸，優選L-氨基酸和甘氨酸，更優選L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-天冬氨酸、L- α -氨基丁酸、L-4-羥基脯氨酸、L-3-羥基脯氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和甘氨酸，再優選L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-天冬氨酸、L- α -氨基丁酸和甘氨酸。
[0107]在上述中，由缺失、置換或附加I個以上的氨基酸的氨基酸序列構成，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質可以通過使用Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)(以下、略為 Molecular Cloning 第 3 版)、Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley&Sons (1987-1997)(以下、略為 Current Protocols in Molecular Biology)、Nucleic Acids Research,.10, 6487 (1982)、Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research,.13, 4431 (1985)、Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82, 488 (1985)等所述的定點突變導入法，例如通過在編碼序列號I~8、37、38或43中的任一個表示的氨基酸序列構成的蛋白質的DNA中導入定點突變，可以取得。
[0108]缺失、置換或附加的氨基酸的數目沒有特別限定，是通過上述的定點突變法等眾所周知的方法能夠缺失、置換或附加程度的數目，從1個至數十個、優選1~20個、更優選1~10個、再優選1~5個。[0109]所謂在序列號I~8、37、38或43中的任一個表示的氨基酸序列缺失、置換或附加I個以上的氨基酸可以在同一序列中的任意位置缺失、置換或附加I個或多個氨基酸。
[0110]作為可置換的氨基酸，例如對序列號I~8、序列號37和38、或眾所周知的NRPS與序列號43表示的氨基酸序列分別使用眾所周知的序列比對軟件進行比較時，在比較的所有的氨基酸序列中不保守的氨基酸。作為眾所周知的序列比對軟件，例如基因解析軟件Genetyx (軟件開發株式會社)中含有的序列比對解析軟件。作為該解析軟件的解析參數，可以使用default值。
[0111]另外作為可進行氨基酸缺失或附加的氨基酸位置，例如序列號I~8、37、38和43中的任一個表示的氨基酸序列的N末端側和C末端側。
[0112]缺失、置換或附加可以同時出現，被置換或附加的氨基酸無論天然型，還是非天然型都可以。作為天然型氨基酸，如L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸
坐寸ο
[0113]以下給出了 可相互置換的氨基酸的例子。同一組中含有的氨基酸可相互置換。
[0114]A群:亮氨酸 、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、t- 丁基甘氨酸、t- 丁基丙氨酸、環己基丙氨酸 [0115]B群:天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
[0116]C群:天冬酰胺、谷氨酰胺
[0117]D群:賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸
[0118]E群:脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸
[0119]F群:絲氨酸、蘇氨酸、同型絲氨酸
[0120]G群:苯丙氨酸、酪氨酸
[0121]另外，為了使本發明的蛋白質具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性，希望是序列號I~8、37、38和43中的任一個表示的氨基酸序列，優選與序列號I表示的氨基酸序列的同源性具有65%以上、優選75%以上、更優選85%以上、再優選90%以上、特別優選95%以上、最好優選98%以上的同源性。
[0122]氨基酸序列或堿基序列的同源性可以使用Karlin and Altschul的算法 BLAST [Pr0.Natl.Acad.Sc1.USA,臉，5873 (1993)]或 FASTA [MethodsEnzvmol..183.63(1990)1決定。通過根據這個算法BLAST開發了稱為BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，^5, 403 (1990)]。當根據BLAST通過BLASTN對堿基序列進行解析時，參數定為例如Score = 100、wordlength = 12。另外當根據BLAST通過BLASTX對氨基酸序列進行解析時，參數定為例如score = 50、wordlength = 3。當使用BLAST和GappedBLAST程序時，使用各程序的default參數。這些解析方法的具體手法眾所周知(http://www.ncb1.nlm.nih.gov.)。
[0123]序列號17表示的氨基酸序列是被保存在具有序列號I~7表示的氨基酸序列的蛋白質間的區域，而且是對應于各種微生物的具有Ala-Ala連接酶活性的蛋白質公有序列的區域。
[0124]作為具有與序列號17表示的氨基酸序列有80%以上、優選90%以上、再優選95%以上同源性的氨基酸序列的蛋白質，而且具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質也是通過本發明的制造方法中使用的微生物生產的蛋白質。
[0125]具有與序列號17表示的氨基酸序列有80%以上、優選90%以上、再優選95%以上同源性的氨基酸序列的蛋白質為了作為具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質，希望該蛋白質的氨基酸序列與序列號I~8中的任一個表示的氨基酸序列的同源性至少具有80%以上、通常為90%以上、最好是具有95%以上的同源性。
[0126]氨基酸序列的同源性可以象上述那樣使用BLAST或FASTA決定。
[0127]作為確認上述[I]~[11]的蛋白質是具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的手段，例如使用DNA重組法制作表達該蛋白質的轉化體，使用該轉化體制造本發明的蛋白質后，使本發明的蛋白質、I種以上的氨基酸、和ATP存在于水性介質中，通過HPLC等分析二肽是否在該水性介質中生成、蓄積的方法。
[0128]本發明的制造方法使用的DNA只要是編碼具有由I種以上的氨基酸生成同一或不同氨基酸通過肽鍵結合形成二肽的活性的蛋白質的DNA，任一種都可以，例如
[0129][12]具有序列號9~16和36中任一個表不的堿基序列的DNA、
[0130][13]和具有與序列號9~16和36任一個表示的堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格的條件下雜交，而且編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA、[0131][14]和具有與序列號18表示的堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格的條件下雜交，而且編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA、
[0132][15]具有序列號39或40表不的喊基序列的DNA、
[0133][16]和具有與序列號39或40表示的堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格的條件下雜交，而且編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA、
[0134][17]編碼具有NRPS活性的蛋白質的DNA、
[0135][18]具有序列號44表示的堿基序列的DNAj
[0136][19]和具有與序列號44表示的堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格的條件下雜交，而且編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA。
[0137]所謂在上述嚴格的條件下可雜交的DNA指的是以具有與序列號9~16、18、36、39、40或44中的任一個表示的堿基序列互補的堿基序列的DNA的一部分、或全部作為探針，通過使用菌落雜交法、噬斑雜交法或Southern blot雜交法等得到的DNA，具體來說，使用固定了來自菌落或噬斑的DNA的濾器，在0.7~1.0mol/L、優選0.9mol/L氯化鈉存在下、于65 °C下進行雜交后、使用0.1~2倍、優選0.1倍濃度的SSC溶液(I倍濃度的SSC溶液組成由150mmol/l氯化鈉、15mmol/l檸檬酸鈉構成)，于65°C條件下,通過清洗濾器能夠鑒定的 DNA。雜交可以根據 Molecular Cloning 第 3 版、Current Protocols in MolecularBiology、Current Protocols in Molecular Biology、DNA Cloningl: Core Techniques, APractical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等記載的方法進行。作為可雜交的DNA，例如使用上述的BLAST和FASTA等，在根據上述參數計算時，與序列號9~16、18、36、39、40或44中的任一個表示的堿基序列至少具有75%以上、優選85%以上、再優選90%以上、特別優選95%以上同源性的DNA。
[0138]另外，作為供雜交的DNA樣品，例如與在其染色體DNA上具有序列號9~16、18、36、39、40或44中的任一個表不的堿基序列的微生物同屬、優選屬于同種的微生物的染色體 DNA。
[0139]在嚴格的條件下與具有序列號9~16、18、36、39、40或44中的任一個表不的堿基序列的DNA雜交的DNA是編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA，例如象上述那樣可以通過使用重組DNA法制造該DNA編碼的蛋白質，測定該蛋白質的活性來確認。
[0140](i)本發明制造方法中使用的DNA的制備
[0141]本發明的制造方法中使用的DNA可以通過以下(a)~(C)取得:
[0142](a)使用根據序列號9~16和36表示的堿基序列設計的探針，可對微生物、優選屬于芽孢桿菌屬的微生物的染色體DNA文庫進行Southern雜交、或使用根據序列號9~16和36表示的堿基序列設計的引物DNA，以微生物、優選屬于芽孢桿菌屬的微生物的染色體DNA 作為模板的 PCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]、
[0143](b)使用根據序列號39或40表示的堿基序列設計的探針可對微生物、優選屬于鏈霉菌屬的微生物的染色體DNA文庫進行Southern雜交、或使用可根據序列號3或4表示的堿基序列設計的引物DNA，以微生物、優選屬于鏈霉菌屬的微生物的染色體DNA作為模板的PCRJ
[0144](c)使用眾所周知的編碼 NRPS 的 DNA、例如 Eur.J.Biochem.，270, 4555 (2003)、特表2003-512835、美國專利5795738或美國專利5652116所述的編碼NRPS的DNA、或可根據序列號44表示的堿基序列設計的探針對微生物、優選屬于芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、假單孢菌屬或黃單孢菌屬等的微生物的染色體DNA文庫進行Southern雜交、或使用根據上述的編碼NPRS的DNA的堿基序列設 計的引物DNA，以微生物、優選屬于芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、假單孢菌屬或黃單孢菌屬等的微生物的染色體DNA作為模板的PCR取得。
[0145]另外，對于各種基因序列數據庫，與編碼序列號I~8、17、37、38和43中的任一個表示的氨基酸序列的DNA的堿基序列具有75%以上、優選85%以上、更優選90%以上、再優選95%以上、特別優選98%以上同源性的序列進行檢索，根據通過該檢索得到的堿基序列，由具有該堿基序列的生物的染色體DNA、cDNA文庫等通過上述方法也可以取得本發明制造方法中使用的DNA。
[0146]取得的DNA可以直接、或用適當的限制酶等進行酶切，通過常法轉運到載體，然后將得到的的重組DNA導入宿主細胞后，通過使用通常用的堿基序列解析方法、例如雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA, 74, 5463 (1977)]或 373A.DNA 序列儀(Perkin-Elmer 公司生產)等堿基序列分析裝置進行分析，可以決定該DNA的堿基序列。
[0147]決定堿基序列的結果表明當取得的DNA為部分長時，可以通過使用該部分長DNA作為探針，對染色體DNA文庫的Southern雜交法等取得全長DNA。
[0148]然后根據決定的DNA的堿基序列,通過使用PerSeptive Biosystems公司制造的8905型DNA合成裝置等進行化學合成，也可以制備目的DNA。
[0149]作為象上述那樣取得的DNA，例如、具有序列號9~16、36、39、40和44表示的堿基序列的DNA。
[0150]作為轉運上述的DNA的載體,如pBluescriptll KS(+) (Stratagene公司生產)、pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990) I >pCR~Script Amp SK (+) (Stratagene 公司生產)、pT7Blue(Novagen 公司生產)、pCR II( Invitrogen 公司生產)和 pCR_TRAP(Genhunter公司生產)等。
[0151]作為上述宿主細胞，如屬于埃希氏菌屬的微生物等。作為屬于埃希氏菌屬的微生物，例如大腸桿菌XLl-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌ATCC12435、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌N0.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、大腸桿菌ME8415等。
[0152]作為重組DNA的導入方法，只要是將DNA導入到上述宿主細胞的方法，可以使用任一種方法，例如使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA, 69,2110 (1972)]、原生質體法(特開昭 63-248394)、電穿孔法[Nucleic Acids Res., 16, 6127(1988)]等。
[0153]作為通過上述方法得到的用于本發明制造方法的帶有DNA的微生物，例如帶有重組DNA的微生物的大腸桿菌匪522/pPE43，該重組DNA含有序列號I表示的序列的DNA。
[0154](ii)具有生產氨基酸能力的微生物的制備
[0155]本發明的二肽的制造方法中使用的具有生產氨基酸能力的微生物只要是具有生產I種以上的氨基酸的能力的微生物，無論那一種都可以，為該微生物如從自然界分離的菌株自身具有該能力的該菌株本身、通過眾所周知方法人為賦予生產構成目的二肽的氨基酸中的至少1種氨基酸能力的微生物等。
[0156]作為眾所周知的方法，如
[0157](a)緩和或解除至少一個控制氨基酸生物合成的結構的方法、
[0158](b)對至少一個參與氨基酸生物合成的酶表達增強的方法、
[0159](c)使至少一個參與氨基酸生物合成的酶基因的拷貝數增加的方法、
[0160](d)對至少一個由氨基酸生物合成途徑向該氨基酸以外的代謝產物的旁路代謝途徑進行弱化或阻斷的方法，和
[0161](e)野生型株相比，選擇對氨基酸的類似物抗性高的細胞株的方法等，上述眾所周知的方法可以單獨或組合使用。
[0162]關于上述(a)，例如Agric.Biol.Chem.，11，105-111 (1979)、J.Bacteriol.，UO, 761-763 (1972)和 Appl.Microbiol.Biotechnol.，39, 318-323 (1993)等所述，關于上述(b),例如 Agric.Biol.Chem.，益，105-111 (1979)和T.Bacteriol., 110, 761-763 (1972)等所述、關于上述(c),例如 Appl.Microbiol.Biotechnol., 39, 318-323 (1993)和 Agric.Biol.Chem.，迪，371-377 (1987)等所述，關于上述(d),例如 Add1.Environ.Micribiol., 38, 181-190 (1979)和 Agric.Biol.Chem.,42, 1773-1778(1978)等所述，關于上述(e)，例如 Agric.Biol.Chem.,36, 1675-1684(1972)、Agric.Biol.Chem., 41, 109-116 (1977)、Agric.Biol.Chem.，37, 2013-2023 (1973)和 Agric.Biol.Chem.，51, 2089-2094 (1987)等所述。參考上述文獻等可以制備具有生產各種氨基酸能力的微生物。
[0163]另外，有關通過上述(a)~(e)中的任一個、或組合的方法制備具有生產氨基酸能力的微生物的制備方法，在Biotechnology2nd ed., Vol.6, Products ofPrimary Metabolism(VCH Verlagsgesellschaft mbH, ffeinheim, 1996)sectionl4a, 14b和 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology79, 1-35(2003)、 氨基酸發酵、學會出版中心、相田浩等(1986)中記載了很多例子，另外除了上述以外，其它的具體的具有生產氨基酸能力的微生物的制備方法有特開2003-164297、Agric.Biol.Chem., 39, 153-160(1975)、Agric.Biol.Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J.Gen.Appl.Microbiol.，生，272-283 (1958)、特開昭 63-94985、Agric.Biol.Chem., 37, 2013-2023(1973)、W097/15673、特開昭 56-18596、特開昭 56-144092 和特表2003-511086等很多報告，通過參照上述文獻等可以制備具有生產I種以上的氨基酸能力的微生物。
[0164]作為通過上述方法可以制備的具有生產氨基酸能力的微生物，例如作為L-谷氨酰胺生產菌，可例舉KlnE基因和/或KlnS基因缺失的微生物，作為L-丙氨酸生產菌，可例舉丙氨酸脫氫酶基因(&M基因)的表達被增強的微生物，作為L-脯氨酸生產微生物，可例舉表達苯丙氨酸的抗反饋型EiiM基因和/或酪氨酸的抗反饋型_基因的微生物等。 [0165]作為上述的生成、蓄積氨基酸的微生物，只要是可以適用上述(a)~(e)方法的微生物或具有上述遺傳性狀的微生物，可以是任一種微生物，優選原核生物、更優選細菌。
[0166]作為原核生物，如屬于埃希氏菌(Escherichia)屬、沙雷氏菌(Serratia)屬、芽孢桿菌屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、棒桿菌(Corynebacterium)屬、微芽孢桿菌屬(Microbacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)屬、土壤桿菌(Agrobacterium)屬、月旨環酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、負腥藍細菌(Anabaena)屬、組囊藍細菌(Anacystis)屬、節桿菌(Arthrobacter)屬、固氮菌(Azotobacter)屬、著色菌(Chromatium)屬、歐文氏菌(Erwinia)屬、甲基桿菌(Methylobacterium)屬、席藍細菌(Phormidium)屬、紅細菌(Rhodobacter)屬、紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)屬、紅螺菌(Rhodospirillum)屬、七才、r ^ A ^ (Scenedesmus)屬、鏈霉菌(Streptomyces)屬、聚球藍細菌(Synechoccus)屬、發酵單胞菌(Zymomonas)屬等的微生物、例如、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、角軍淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliauefaciens)、凝結芽抱桿菌(BaciIIuscoagulans)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、fa 小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)、1、^if K 夕亍 々 Λ.彳 τ 才 7 < )V Λ (Brevibacterium immariophilum)、解糖 fa 桿菌(Brevibacterium saccharoIyticum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳酸發酵 fa.桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、嗜乙酉先乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)、無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(SerratiafontiCoIa)λ 液化沙雷氏菌(Serratia liauefaciens)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、方女身寸形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)、發根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)、懸鉤子土壤桿菌(Agrobacterium rubi)、柱抱負腥藍細菌(Anabaena cylindrica)、才甬形隹.月星藍細菌(Anabaena doliolum)、水華負腥藍細菌(Anabaenaf los-aquae)λ 金黃節桿菌(Arthrobacter aurescens)、梓棱節桿菌(Arthrobacter citreus)、球形節桿菌(Arthrobacter globformis)、r 一 ^ 口 N、夕夕一.匕卜'、口力一水夕 、卟夕豸力 7 (Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、邁索爾節桿菌(Arthrobacter mysorens)、煙草節桿菌(Arthrobacter nicotianae)、石錯節桿菌(Arthrobacter paraffineus)、原玻璃蟲黽節桿菌(Arthrobacter protophormiae)、玫瑰色石錯節桿菌(Arthrobacter roseoparaffinus)、硫石黃節桿菌(Arthrobacter sulfureus)、產尿節桿菌(Arthrobacter ureafaciens)、巴氏著色菌(Chromatium buderi )、微溫著色菌(Chromatium tepidum)、酒色著色菌(Chromatium vinosum)、沃氏著色菌(Chromatiumwarmingii )> L- (Chromatium f luviatile)、卩策夏抱歐
文氏菌(Erwinia uredovora)、古月楚卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、M t氏菌(Erwinia ananas)、草牛.歐文氏菌(Erwinia herbicola)、工卟匕'二了.八 > 夕夕夕(Erwinia punctata)、工卟匕二了.r卜々叉(Erwinia terreus)、羅得西亞甲基桿菌(Methylobacterium rhodesianum)、扭月兌甲基桿菌(Methylobacterium extorauens)、7 才卟 S 于.' 4 々 Λ.工 7 匕。一 (Phormidium sp.) ATCC29409、夾膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus)、類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)、牛.芽紅細菌(Rhodopseudomonasblastica)、海紅菌(Rhodopseudomonas marina)、血色紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、深紅紅螺菌(RhodospiriIIum rubrum)、需鹽紅螺菌(RhodospiriIIumsalexigens)、鹽場紅螺菌(Rhodospiri I Ium sal inarum)、產二素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)、金霉素鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金色鏈霉菌(Streptomycesaureus)、殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰產色鏈霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)>(Streptomyces griseus)、淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)、撤攬灰鏈霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝鏈霉菌(Streptomycesrameus)、田無鏈霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒紅鏈霉菌(Streptomycesvinaceus)、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等；作為理想的原核生物,如屬于埃希氏菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、假單孢菌屬或鏈霉菌屬等的細菌，例如上述的屬于埃希氏菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、假單孢菌屬或鏈霉菌屬等細菌；作為更理想的細菌，如大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、產氨棒桿菌、乳酸發酵棒桿菌、黃色棒桿菌、Corynebacterium eff iciens、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、粘質沙雷氏菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、天藍色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌，特別優選大腸桿菌。
[0167]作為生產氨基酸的微生物的具體例子，作為L-谷氨酰胺生產株，如大腸桿菌JGLEl和大腸桿菌JGLBEl等、作為L-丙氨酸生產株，如保持?基因表達質粒的大腸桿菌JMlOl株等、作為L-苯丙氨酸生產株，如帶有ΡΡΗΕΑ2和/或逛扯基因表達質粒的大腸桿菌JMlOl株等、作為L-谷氨酰胺和L-丙氨酸生產株，如保持?基因表達質粒的大腸桿菌JGLEl和大腸桿菌JGLBEl等、作為L-丙氨酸和L-苯丙氨酸生產株，如保持?基因表達質粒和抗反饋型PheA基因和/或抗反饋型aroF基因表達質粒的大腸桿菌JMlOl等、作為L-蘇氨酸和L-苯丙氨酸生產株，如保持抗反饋型DheA基因和/或抗反饋型aroF基因表汰質粒的ATCC21277株等。
[0168]另外，作為具有生產氨基酸能力的微生物的具體例子，作為L-谷氨酸生產株，如FERM BP-5807 和 ATCC13032 等、作為 L-谷氨酰胺生產株，如 FERM P-4806 和 ATCC14751等、作為L-蘇氨酸生產株，如ATCC21148、ATCC21277和ATCC21650等、作為L-賴氨酸生產株，如 FERM P-5084 和 ATCC13286 等、作為 L-蛋氨酸生產株，如 FERM P_5479、VKPM B-2175和ATCC21608等、作為L-異亮氨酸生產株，如FERM BP-3757和ATCC14310等、作為L-纈氨酸生產株，如ATCC13005和ATCC19561等、作為L-亮氨酸生產株，如FERM BP-4704和ATCC21302等、作為L-丙氨酸生產株，如FERM BP-4121和ATCC15108等、作為L-絲氨酸生產株，如ATCC21523和FERM BP-6576等、作為L-脯氨酸生產株，如FERM BP-2807和ATCC19224等、作為L-精氨酸生產株，如FERM P-5616和ATCC21831等、作為L-鳥氨酸生產株，如ATCC13232等、作為L-組氨酸生產株，如FERM BP-6674和ATCC21607等、作為L-色氨酸生產株，如DSM10118、DSM10121、DSM10123和FERM BP-1777等、作為L-苯丙氨酸生產株，如ATCC13281和ATCC21669等、作為L-酪氨酸生產株，如ATCC21652等、作為L-半胱氨酸生產株，如W3110/pHC34(特表2003-511086記載)等、作為L-4-羥基脯氨酸生產株，如W096/27669記載的大腸桿菌SOLR/pRH71等、作為L-3-羥基脯氨酸生產株，如FERM BP-5026和FERM BP-5409等、作為L-瓜氨酸生產株，如FERM P-5643和FERM P-1645等。
[0169]而上述的FERM編號表示的菌株可以從獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄托中心(日本)、ATCC編號表示的菌株可以從Amer1can Type Culture Collect1on(美國)、VKPM 編號表不的菌株可以從 Russ1an Nat1onal Collect1on of 1ndustr1alM1croorgan1sms (俄羅斯)、DSM編號表不的菌株可以從Deutsche Sammlung vonM1kroorgan1smen und Zellkulturen (德國)分別獲得。
[0170](iii)具有生產具有由1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質能力，而且具有生產該1種以上的氨基酸中的至少1種氨基酸的能力的微生物的制備
[0171]具有生產具有由1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質能力，而且具有生產該1種以上的氨基酸中的至少1種氨基酸的能力的微生物可以通過以下(a)~(d)的方法等可以制備。
[0172](a)在可用上述(ii)方法制備的具有生產1種以上的氨基酸能力的微生物導入可以通過上述(1)方法制備的編碼具有由1種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA的方法、
[0173](b)通過上述(ii)的方法賦予導入了通過上述(i)方法制備的編碼具有由1種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA微生物生產1種以上的氨基酸的能力的方法、
[0174](c)通過上述(i)的方法向原來具有生產1種以上的氨基酸能力的微生物導入編碼具有由1種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA的方法、或
[0175](d)通過上述(ii)方法賦予原來具有生產具有由1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質能力的微生物生產1種以上的氨基酸能力的方法。
[0176]通過將能夠用上述(i)的方法制備的編碼具有由1種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA導入微生物，可以賦予該微生物生產具有由1種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的能力。作為賦予微生物生產具有由1種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的能力的方法，可以使用 Molecular Clon1ng 第 3 版、Current Protocols 1n MolecularB1ology等記載的方法等,例如通過以下方法使在用上述(i)的方法制備的DNA在宿主細胞中表達的方法。
[0177]以用上述(i)的方法制備的DNA作為基礎，根據需要，制備含有編碼蛋白質的部分的適當長度的DNA片段。另外，通過將編碼該蛋白質部分的堿基序列置換成最適于宿主表達的密碼，可以使該蛋白質的產率提高。
[0178]通過將該DNA片段插入到適當的表達載體的啟動子的下游，可以制作重組DNA。
[0179]通過將該重組DNA導入適合該表達載體的宿主細胞可以獲得生產該蛋白質的轉化體。[0180]作為宿主細胞，只要是能夠表達目的基因的微生物，可以使用任一種，優選原核生物、更優選細菌。作為理想的原核生物如上述(ii)的原核生物。
[0181]該微生物可以具有生產I種以上的氨基酸的能力，也可以不具有該能力。當使用不具有該能力的微生物作為宿主細胞時，通過下面的方法將用上述方法得到的重組DNA導入該微生物制備轉化體后，通過用上述(ii)的方法賦予該轉化體生產I以上的氨基酸的能力，可以獲得本發明制造方法中使用的微生物。
[0182]作為表達載體，使用可在微生物細胞中自我復制或轉運到染色體中，在能夠轉錄本發明制造方法中使用的DNA的位置含有啟動子的載體。
[0183]使用原核生物作為宿主細胞時，具有本發明制造方法中使用的DNA的重組DNA最好是在原核生物中可自我復制，同時由啟動子、核糖體結合序列、本發明的制造方法中使用的DNA、轉錄終止序列構成的重組DNA。也可以含有調控啟動子的基因。
[0184]作為表達載體，例如pBTrp2、pBTacl、pBTac2 (都是 Boehringer Mannheim 公司生產)、pHelixl (Roche Diagnostics 公司生產)、pKK233_2 (Amersham PharmaciaBiotech 公司生產)、pSE280 (Invitrogen 公司生產)、pGEMEX-1 (Promega 公司生產)、pQE-8 (Qiagen 公司生產)、pET-3 (Novagen 公司生產)、pKYPIO (特開昭 58-110600)、PKYP200 [Agric.Biol.Chem.，48, 669 (1984) ]、pLSAl [Agric.Biol.Chem.，53, 277 (1989)]、pGELl [Proc.Natl.Acad.Sc1., USA, 82, 4306 (1985) ]、pBluescriptll SK (+)、pBluescriptII KS(-) (Stratagene 公司生產)、pTrS30 [由大腸桿菌 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制備]、pTrS32[由大腸桿菌 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制備]、pPAC31 (TO98/12343)、pUC19[Gene, 33, 103(1985)]、pSTV28 (Takara Bio 公司生產)、pUC118 (Takara Bio 公司生產)、pPAl (特開昭 63-233798)、pffH1520 (MoBiTec 社制)、pCS299P (W000/63388)、pVLT31[Gene,123,17 (1993)]和 pIJ702 (Genetic Manipulation of Streptomyces: aLaboratory Manual: John Innes Foundation)等。
[0185]使用屬于埃希氏菌屬的微生物作為宿主細胞時，作為啟動子只要是可在大腸桿菌內發揮功能的，無論那一種都可以，例如來自大腸菌的啟動子啟動子(P-)、
啟動子、Pk啟動子、
[0186]Pse啟動子等，或來自噬菌體等的啟動子，例如SPOl啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。也可以使用人為設計使Ptap改變為兩個串聯的啟動子、啟動子、lacT7啟動子、let I啟動子那樣的啟動子等。
[0187]另外也可以使用用于使基因在屬于芽孢桿菌屬的微生物中表達的IllA啟動子[Appl.Microbiol.Biotechnol., 35, 594-599 (1991)]、用于使基因在屬于棒桿菌屬的微生物中表達的 P54-6 啟動子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，53, 674-679 (2000)]、用于使基因在屬于假單孢菌屬的微生物中表達的啟動子[Gene，d 17-24 (1993)]、用于使基因在屬于鏈霉菌屬的微生物中表達的xylA啟動子(Genetic Manipulation ofStreptomyces: a Laboratory Manual: John Innes Foundation)等。
[0188]優選使用將作為核糖體結合序列的Shine-Dalgarno序列與起始密碼子之間距離調節到適當距離(例如6~18堿基)的質粒。
[0189]在使本發明制造方法中使用的DNA與表達載體結合的重組DNA中，不一定需要轉錄終止序列，但最好是在緊靠結構基因的下面配置轉錄終止序列。[0190]作為這樣的重組DNA，例如pPE43。
[0191]作為將重組DNA導入微生物細胞的導入方法，只要是將DNA導入該細胞的方法，可以使用任一種方法，例如、使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sc1.,USA, M, 2110(1972)]、原生質體法(特開昭 63-248394)、電穿孔法[Nucleic AcidsRes.,16, 6127(1988)]等。
[0192]另外，作為在上述(C)方法中使用的原來具有生產I種以上的氨基酸能力的微生物，可例舉具有生產上述(ii )的氨基酸能力的眾所周知的菌株等。
[0193]作為在上述(d)方法中使用的原來具有生產具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質能力的微生物，如(A)屬于芽孢桿菌屬的微生物、更優選具有桿菌溶素合成活性的屬于芽孢桿菌屬的微生物、再優選枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌等屬于各種屬的微生物、最好是枯草芽孢桿菌ATCC15245、枯草芽孢桿菌ATCC6633、枯草芽孢桿菌IAM1213、枯草芽孢桿菌IAM1107、枯草芽孢桿菌IAM1214、枯草芽孢桿菌ATCC9466、枯草芽孢桿菌IAM1033、枯草芽孢桿菌ATCC21555、解淀粉芽孢桿菌IF03022和短小芽孢桿菌NRRL B-12025中的任一菌株的微生物、和(B)屬于鏈霉菌屬的微生物、優選具有生產albonoursin能力的屬于鏈霉菌屬的微牛.物、更優選屬于小白鏈霉菌(Streptomyces albulus)或諾爾斯氏鏈霉菌(Streptomycesnoursei)的微生物。
[0194](iv)肽酶和具有肽轉運活性的蛋白質的活性低下或喪失的微生物[0195]作為本發明的制造方法使用的微生物，如在通過上述(iii)的方法制備的微生物中，I種以上肽酶和I種以上肽轉運蛋白質的活性低下或喪失的微生物、或3種以上肽酶的活性低下或喪失的微生物。
[0196]該微生物可以通過例如如下的方法獲得，Ca)通過上述(iii)的方法賦予I種以上肽酶和I種以上肽轉運蛋白質的功能低下或喪失的微生物、或3種以上肽酶的功能低下或喪失的微生物具有生產具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質能力、和生產該I種以上的氨基酸中的至少I種氨基酸的能力的方法，(b)使通過上述(iii)的方法能夠制備的微生物的a) I種以上肽酶和I種以上肽轉運蛋白質、或b)3種以上肽酶的功能低下或喪失的方法，該微生物具有生產具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的能力、和具有生產該I種以上的氨基酸中的至少I種氨基酸的能力。
[0197]作為I種以上肽酶和I種以上肽轉運蛋白質的活性低下或喪失的微生物，只要是該微生物能正常生長繁殖，如任意I種以上肽酶和任意I種以上肽轉運蛋白質的活性低下或喪失的微生物，優選I種以上9種以下、更優選I種以上7種以下、再優選I種以上4種以下的肽酶的活性低下或喪失，而且優選I種以上5種以下、更優選I種以上3種以下、再優選I種以上2種以下、特別優選I種的肽轉運蛋白質活性低下或喪失的微生物。
[0198]作為該微生物，更具體講，如在該微生物的基因組DNA上存在的編碼肽酶的基因(以下、略為肽酶基因)和編碼肽轉運蛋白質的基因(以下、肽轉運蛋白質基因)中，由于在I種以上妝酶基因的喊基序列和I種以上妝轉運蛋白質基因的喊基序列中缺失該喊基序列的全部或一部分，或由于在該堿基序列中存在堿基的置換或附加，該肽酶和該肽轉運蛋白質的活性低下或喪失的微生物。
[0199]所謂肽酶的活性低下指的是與上述的堿基沒有缺失、置換或附加的基因編碼的肽酶相比，肽分解活性低下，通常低至80%以下、優選50%以下、更優選30%以下、再優選20%以下、特別優選10%以下、最好優選5%以下。
[0200]微生物的肽分解活性可以使作為底物的肽和微生物菌體在水性介質中共存，進行肽分解反應后，通過眾所周知的方法、例如使用HPLC等的分析法對殘存的肽量進行定量來測定。
[0201]作為上述肽酶，只要是具有肽分解活性的蛋白質就可以，優選二肽分解活性高的蛋白質、更優選二肽酶。
[0202]作為更具體的肽酶，例如存在于大腸桿菌的具有序列號45表示的氨基酸序列的PepA、具有序列號46表示的氨基酸序列的PepB、具有序列號47表示的氨基酸序列的PepD、具有序列號48表示的氨基酸序列的PepN、PepP[GenBank accession n0.(以下略為GenBank)AAC75946] ,PepQ (GenBank AAC76850)、P印E (GenBank AAC76991 )、P印T (GenBankAAC74211)、Dcp (GenBank AAC74611)和 IadA (GenBank AAC77284)等；存在于枯草芽孢桿菌的 AmpS (GenBank AF012285)、P印T (GenBank X99339), YbaC (GenBank Z99104), YcdD(GenBank Z99105)、YjbG (GenBank Z99110)、YkvY (GenBank Z99111)、YqjE (GenBankZ99116), YwaD (GenBank Z99123)等；存在于谷氨酸棒桿菌的具有 BAB97732、BAB97858、BAB98080, BAB98880, BAB98892, BAB99013, BAB99598 和 BAB99819 (都是日本 DNA 數據庫的登錄號)表示的氨基酸序列的蛋白質等；作為二肽酶，如具有序列號45~48表示的氨基酸序列的PepA、PepB、PepD和PepN、以及PepQ、PepE、IadA。另外與序列號45~48中的任一個氨基酸序列具有80%以上、優選90%以上、更優選95%以上同源性，而且具有肽酶活性的蛋白質也可以作為二肽分解活性高的蛋白質。氨基酸序列或堿基序列的同源性可以使用上述的BLAST和FASTA等來決定。
[0203]而所謂肽轉運蛋白質的活性低下指的是與編碼上述的沒有進行堿基缺失、置換或附加的基因的肽轉運蛋白質相比，肽轉運活性變低通常指的是降低到80%以下、優選50%以下、更優選30%以下、再優選20%以下、特別優選10%以下、最好優選5%以下。
[0204]微生物的肽轉運活性可以通過使作為底物的肽和微生物菌體共存于水性介質中進行肽轉運反應后，利用眾所周知的方法、例如使用HPLC等分析法對殘存于水性介質中的肽量進行定量來測定。
[0205]作為上述肽轉運蛋白質，是由染色體DNA上形成操縱子的基因編碼的蛋白質，在細胞膜上形成復合體后表達肽轉運活性的蛋白質、和作為單獨的蛋白質具有肽轉運活性的蛋白質等只要是參與微生物的肽轉運的蛋白質，任一種都可以，優選二肽轉運活性高的蛋白質。
[0206]作為更具體的肽轉運蛋白質，例如存在于大腸桿菌的具有序列號49表示的氨基酸序列的DppA、具有序列號50表示的氨基酸序列的DppB、具有序列號51表示的氨基酸序列的DppC、具有序列號52表示的氨基酸序列的DppD、具有序列號53表示的氨基酸序列的DppF,OppA (GenBank AAC76569)、OppB (GenBank AAC76568)、OppC (GenBank AAC76567)、OppD (GenBank AAC76566)、 OppF (GenBank AAC76565)、YddO (GenBank AAC74556)、YddP (GenBank AAC74557)、YddQ (GenBank AAC74558)、YddR (GenBank AAC74559)、YddS (GenBank AAC74560)、YbiK (GenBank AAC73915)、MppA (GenBank AAC74411)、SapA (GenBank AAC74376)、 SapB (GenBank AAC74375)、 SapC (GenBank AAC74374)、SapD (GenBank AAC74373)、和 SapF (GenBank AAC74372)等；存在于枯草芽孢桿菌的DppA (GenBank CAA40002)、DppB (GenBank CAA40003)、DppC (GenBank CAA40004)、DppD (GenBank CAA40005)、DppE (GenBank CAA40006)、 OppA (GenBank CAA39787)、OppB (GenBank CAA39788)、OppC (GenBank CAA39789)、OppD (GenBank CAA39790)、OppF(GenBank CAA39791),AppA(GenBank CAA62358),AppB(GenBank CAA62359),AppC(GenBankCAA62360),AppDCGenBank CAA62356)、AppF(GenBank CAA62357)、Yc1F(GenBank CAB12175)和YkfD (GenBank CAB13157)等；存在于谷氨酸棒桿菌的具有BAB99048、BAB99383、BAB99384、BAB99385、BAB99713、BAB99714、BAB99715、BAB99830、BAB99831、BAB99832 (都是日本DNA數據庫的登錄號)表示的氨基酸序列的蛋白質等；另外作為二肽轉運活性高的蛋白質，如具有序列號49~53表示的氨基酸序列的DppA、DppB、DppC、DppD、DppF和與它們中任一個的氨基酸序列具有80%以上、優選90%以上、更優選95%以上同源性的蛋白質也可作為肽轉運活性高的肽轉運蛋白質。
[0207]上述氨基酸序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序決定。
[0208]作為3種以上肽酶的活性低下或喪失的微生物，以該微生物能正常生長繁殖為限，如任意3種以上肽酶的活性低下或喪失的微生物，優選3種以上9種以下、更優選3種以上6種以下、再優選3種或4種肽酶的活性低下或喪失的微生物。
[0209]作為具體的肽酶，如存在于上述的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌的肽酶和二肽酶。而由與序列號45~48中的任一個氨基酸序列有80%以上、優選90%以上、更優選95%以上同源性的氨基酸序列構成、而且具有肽酶活性的蛋白質也可以作為二肽分解活性聞的蛋白質。
[0210]上述氨基酸序列的 同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序決定。
[0211](V)肽酶和肽轉運蛋白質的活性低下或喪失的微生物的制備
[0212]肽酶和肽轉運蛋白質的活性低下或喪失的微生物只要是能夠取得該微生物的方法，其取得方法沒有限制，例如通過在以下所示的微生物的染色體DNA的肽酶基因或肽轉運蛋白質基因導入堿基的缺失、置換或附加的方法可以取得。
[0213]作為在微生物的染色體DNA的基因導入堿基缺失、置換或附加的方法，如利用同源重組的方法。作為利用一般的同源重組的方法，如使用將導入了堿基缺失、置換或附加的突變基因與在希望導入堿基缺失等的宿主細胞內含有不能自我復制的抗藥性基因的質粒DNA連接制作的同源重組用質粒的方法。
[0214]通過常法將該同源重組用質粒導入宿主細胞后，以抗藥性作為指標，選擇通過同源重組在染色體DNA上轉運了該同源重組用質粒的轉化株。通過將得到的轉化株于不含有該藥劑的培養基中培養數小時~I天后，涂布于含有該藥劑瓊脂培養基和不含有該藥劑的瓊脂培養基，選擇在前者培養基中不生長繁殖，而在后者培養基能夠生長繁殖的株，可以取得在染色體DNA上發生第2次同源重組的株。通過決定染色體DNA上導入缺失等的基因存在區域的堿基序列，可以確認染色體DNA上的目的基因中導入堿基的缺失、置換或附加。
[0215]作為通過上述方法，能夠在染色體DNA上的目的基因中導入堿基的缺失、置換或附加的微生物，例如屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬或棒桿菌屬的微生物。
[0216]而作為利用向多個基因有效導入堿基的缺失、置換或附加的同源重組的方法，如使用直鏈DNA的方法。[0217]具體來說，是使含有希望導入堿基缺失、置換或附加的基因的直鏈DNA轉運到細胞內，在染色體DNA與導入的直鏈DNA之間發生同源重組的方法。本方法只要是可有效地轉運直鏈DNA的微生物，也可以適用于任一種微生物，作為理想的微生物，如屬于埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬的微生物、更優選大腸桿菌、再優選表達來自λ噬菌體的重組蛋白質組(Red重組系)的大腸桿菌。
[0218]作為表達λ Red重組系的大腸桿菌，如帶有含λ Red重組系基因的質粒DNA的PKD46 [可從大腸桿菌基因儲備中心(美國耶魯大學)獲得]的大腸桿菌JMlOl株等。
[0219]作為可用于同源重組的DNA，如可例舉:
[0220](a)在抗藥性基因的兩端含有與位于存在于作為堿基的缺失、置換或附加的導入對象的染色體DNA上區域的兩外側的DNA具有同源性的DNA的直鏈DNA、
[0221](b)直接連接了與存在于作為堿基的缺失、置換或附加的導入對象的染色體DNA上區域的兩外側的DNA具有同源性的DNA的直鏈DNA、
[0222](c)在含有抗藥性基因和能夠用于負選擇的基因的DNA的兩端含有與存在于作為堿基的缺失、置換或附加的導入對象的染色體DNA上的區域的兩外側的DNA具有同源性的DNA的直鏈DNA、
[0223](d)在上述(a)的直鏈DNA中，在抗藥性基因和與存在于染色體DNA上區域的兩外側的DNA具有同源性的DNA之間，還含有來自酵母的Flp重組酶〔Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，82, 5875 (1985)〕識別堿基序列的 DNA。
[0224]作為抗藥性基因，只要是對于宿主微生物表現出敏感性的藥劑，賦予抗藥性的抗藥性基因，也可以使用任一種抗藥性基因。作為宿主微生物使用大腸桿菌時，作為抗藥性基因，例如、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、慶大霉素抗性基因、大觀霉素抗性基因、四環素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因等。
[0225]所謂能夠用于負選擇的基因指的是當在宿主微生物中使該基因表達時，在一定培養條件下，使該微生物致死的的基因，作為該基因，例如來自屬于芽孢桿菌屬的微生物的sacB 基因 i Appl.Environ.Microbiol..59.1361-1366 (1993)〕、和來自屬于埃希氏菌屬的微牛物的 rpsL 某閔〔Genomics, II，99-104 (2001)〕等。
[0226]存在于上述的直鏈DNA的兩末端的、與存在于成為染色體DNA上的置換或缺失的導入對象的區域兩端外側的DNA具有同源性的DNA在直鏈DNA中被配置在與染色體DNA上的方向相同方向，其長度優選IObp~IOObp左右,更優選bp~50bp左右、進一步優選30~40bp左右。
[0227]所謂來自酵母的Flp重組酶識別的堿基序列只要是該蛋白質識別、催化同源重組的喊基序列，沒有特別限定，優選具有序列號54表不的喊基序列的DNA、和具有在該DNA中缺失、置換或附加了 I個~數個堿基的堿基序列、而且來自酵母的Flp重組酶識別的、催化同源重組的堿基序列的DNA。
[0228]所謂具有同源性是上述直鏈DNA在染色體DNA上的目的區域，具有發生同源重組的程度的同源性，作為具體的同源性，如80%以上、優選90%以上、更優選95%以上、最優選100%的同源性。
[0229]上述堿基序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序決定。
[0230]上述直鏈DNA可以通過PCR制作。另外將含有上述直鏈DNA的DNA構建在質粒上后，經限制酶處理也可以得到目的直鏈DNA。
[0231]作為在微生物的染色體DNA中導入堿基的缺失、置換或附加的方法，如以下的方法I~4。
[0232]方法1:將上述(a)或(d)的直鏈DNA導入宿主微生物，以抗藥性為指標選擇通過同源重組該直鏈DNA被插入到染色體DNA上的轉化株的方法。
[0233]方法2:向通過上述方法I取得的轉化株導入上述(b)的直鏈DNA，通過消除經該方法插入到染色體DNA上的藥劑基因，使微生物的染色體DNA上的區域置換或缺失的方法。
[0234]方法3:
[0235][I]將上述(C)的直鏈DNA導入宿主微生物，以抗藥性為指標選擇通過同源重組該直鏈DNA被插入到染色體DNA上的轉化株、
[0236][2]合成在與染色體DNA上方向同一方向連接了與位于染色體DNA上的置換或缺失的對象區域兩端外側的DNA具有同源性的DNA的DNA，導入到上述[I]中得到的轉化株，
[0237][3]在可用于負選擇的基因表達的條件下，對進行了上述[2]操作的轉化株進行培養，選擇在該培養條件下可生長繁殖的株作為從染色體DNA上削除了抗藥性基因和可用于負選擇的基因的菌株的方法。
[0238]方法4:
[0239][I]將上述 (d)的直鏈DNA導入宿主微生物，以抗藥性為指標選擇通過同源重組該直鏈DNA被插入到染色體DNA上的轉化株、
[0240][2]向上述[I]中得到的轉化株導入Flp重組酶基因表達質粒，使該基因表達后，取得對上述[I]中使用的藥劑有敏感性的菌株的方法。
[0241]作為將在上述方法中使用的直鏈DNA導入宿主微生物的方法，只要是將DNA導入該微生物的方法,可以使用任一種方法,例如、使用鈣離子的方法〔Proc.Nat1.Acad.Sc1.,USA, 69, 2110(1972)〕、原生質體法(特開昭 63-248394)、電穿孔法(Nucleic AcidsRes.,16, 6127(1988)〕等。
[0242]在方法2或方法3 [2]中使用的直鏈DNA中，通過使用在該DNA的中央部附近轉運希望插入到染色體DNA上的任意基因的直鏈DNA，在削除抗藥性基因等的同時，可以將任意基因插入到染色體DNA上。
[0243]上述方法2~4由于是對于最終得到的轉化株的染色體DNA上不保留抗藥性基因和可用于負選擇的基因等外源基因的方法，所以通過使用同一抗藥性基因和可用于負選擇的基因，反復進行該方法的操作，容易制造在染色體DNA上位置不同的2個以上區域帶有堿基的缺失、置換或附加的微生物。
[0244](vi)本發明的二肽的制造方法
[0245]通過對用上述(iii)和(V)的方法得到的微生物在培養基中培養，使二肽在培養物中生成、蓄積，從該培養物中回收二肽，可以制造二肽。
[0246]將該微生物在培養基中進行培養的方法可以根據微生物培養中使用的通常方法來進行。
[0247]即，只要是含有該微生物可利用的碳源、氮源、無機鹽類等的可有效進行該微生物培養的培養基，可以使用天然培養基、合成培養基中的任一種。
[0248]在該培養基中雖然不需要含有構成目的二肽的氨基酸，但在天然培養基、或用于培養氨基酸需求性菌株的培養基中有時也含有該氨基酸。在本發明制造方法中使用的培養基中也可以含有本發明使用的微生物生長繁殖所必需的量的氨基酸。即，通常培養基中含有的氨基酸量由于與通過本發明制造方法中使用的微生物生產的該氨基酸量相比非常少，所以通常培養基中含有的該氨基酸量并不是由于該氨基酸的有無導致本申請發明制造的二肽產量變化那樣程度的量，因此在本發明的制造方法中使用的培養基中也可以含有如此程度的該氨基酸。
[0249]作為本發明中使用的培養基中含有的氨基酸量，例如如果是天然培養基，通常含不足2.5g/L、優選0.5g/L以下、更優選0.lg/L以下、再優選20mg/L以下的該氨基酸；如果是合成培養基，通常含lg/L以下、優選50mg/L以下、更優選lmg/L以下、再優選0.5mg/L以下的該氨基酸。但是，當通過本申請發明的制造方法制造2種不同氨基酸構成的二肽時，當使用的微生物只有生產構成該二肽的氨基酸中的I種氨基酸的能力時，也可以向本發明中使用的培養基中添加該微生物不能生產的另外I種氨基酸。此時添加的氨基酸量通常為0.5g/L ~100g/L、優選 2g/L ~50g/L。
[0250]作為碳源，只要是該微生物可利用的就可以，可以使用葡萄糖、乳糖、蔗糖、含有這些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物，醋酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類等
[0251]作為氮源可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無機酸或有機酸的銨鹽、其它的含氮化合物、以及胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸潰液、酪蛋白水解物、大豆柏和大豆柏加水分解物、各種發酵菌體、及其消化物等。
[0252]作為無機鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
[0253]培養在通常振蕩培養或深部通氣攪拌培養等好氧條件下進行。培養溫度為15~400C比較好、培養時間通常為5小時~7日間。培養中pH保持3.0~9.0。pH的調整使用無機或有機的酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進行。
[0254]另外根據培養中需要，也可以向培養基中添加氨芐青霉素或四環素等抗生素。
[0255]當對用作為啟動子使用誘導性的啟動子的表達載體轉化的微生物進行培養時，根據需要也可以向培養基中添加誘導物。例如、對用使用了 Iac啟動子的表達載體轉化的微生物進行培養時，可以添加異丙基_β-D-硫代半乳糖苷等，當用使用了啟動子的表達載體轉化的微生物進行培養時，也可以向培養基添加吲哚丙烯酸等。
[0256]作為用上述方法制造的二肽，如I種或2種的氨基酸經α鍵形成的二肽，優選該氨基酸是L-氨基酸或甘氨酸的二肽、更優選在式(I)
[0257]R1-R2 (I)
[0258]表示的二肽中，R1和R2為相同或不同、從L-丙氨酸(L-Ala)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、L-谷氨酸(L-Glu)、甘氨酸(Gly)、L-纈氨酸(L_Val)、L-亮氨酸(L_Leu)、L-異亮氨酸(L-1Ie)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-色氨酸(L-Trp)、L-蛋氨酸(L-Met)、L-絲氨酸(L-Ser)、L-蘇氨酸(L-Thr)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-賴氨酸(L-Lys)、L-精氨酸(L_Arg)、L-組氨酸(L-His)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-α -氨基丁酸(L-α -AB)、L_4_羥基脯氨酸(L_4_HYP)、L_3_羥基脯氨酸(L-3-HYP)、L-鳥氨酸(L-Orn)和L-瓜氨酸(L-Cit)選出來的氨基酸的二肽、再優選R1為L-Ala、Gly、L-Met、L-Ser 或 L-Thr 時、R2 為 L-Gln、L-Glu、Gly、L-Val、L-Leu、L-1le、L_Pro、L-Pheλ L-Trpλ L-MetΛ L-SerΛ L-ThrΛ L-CysΛ L-AsnΛ L-TyrΛ L-LysΛ L-ArgΛ L_His、L-AspΛL- α -ΑΒ、L-4-HYP、L-3-HYP、L-Orn 或 L-Cit 的二肽、特別優選 R1 為 L-Ala 時，R2 為 L_Gln、Gly、L-Val、L_Leu、L_IIe、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg, L-His、L- a -AB 或 L-Cit 的二 肽、R1 為 Gly 時，R2 為 L-Gln, Gly、L-Phe, L-Trp,L-Met, L-Ser、L-Thr、L-Cys, L-Tyr、L-Lys, L-Arg, L- a -AB 或 L-Cit 的二肽、R1 為 L-Met時，R2 是 L-Phe, L-Met, L-Cys, L-Tyr、L-Lys 或 L-His 的二肽、R1 為 L-Ser 時，R2 是 L-Gln,Gly、L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr、L-Tyr、L-His 或 L- a -AB 的二肽、R1 為 L-Thr 時，R2 是L-Gln, L-Leu, L-Phe, L-Met, L-Ser、L-Thr 或 L- a -AB 的二肽、R1 為 L-Gln 時，R2 是 L-Phe或 L- a -AB 的二肽、R1 為 L-Phe 時，R2 是 L-Gln 的二肽、R1 為 L-Trp 時，R2 是 Gly 的二肽、R1 是 L-Cys 時，R2 是 L-Ala, L-Gln, Gly、或 L-Met 的二肽、R1 為 L-Lys 時，R2 是 L-Ala, Gly或 L-Met 的二肽、R1 為 L-Arg 時，R2 是 L- a -AB 的二肽、R1 為 L-His 時，R2 是 L-Met 的二肽、和 R1 為 L- a -AB 時，R2 是 L-Ala, L-Gln, Gly、L-Ser、L-Thr、L-Arg 或 L- a -AB 的二肽，最好優選L-丙氨酰-L-丙氨酸(L-Ala-L-Ala)、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L_Ala-L_Gln)、L-丙氨酰-L-苯丙氨酸(L-Ala-L-Phe)、L-蘇氨酰-L-苯丙氨酸(L-Thr-L-Phe)、L-丙氨酰-L-酪氨酸(L-Ala-L-Tyr)、L-丙氨酰-L-蛋氨酸(L-Ala-L-Met)、L-丙氨酰-L-纈氨酸(L-AI a_L_V al)、L-丙氛酸-異売氛酸(L-AI a_L_ lie)、L-丙氛酸-L-売氛酸(L-AI a-L-Leu )和L-絲氨酰-L-苯丙氨酸(L-Ser-L-Phe )。
[0259]培養物中生成、蓄積的二肽的回收可以通過使用活性炭或離子交換樹脂等通常的方法、或通過利用有機溶劑萃取、結晶、薄層層析、高效液相層析等進行。
[0260]以下給出了編碼具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的DNA取得方法等實驗例，該DNA的取得方法等并不限定于該實驗例。
[0261]【實驗例I利用數據庫檢索具有二肽合成活性的蛋白質】
[0262]以來自枯草芽孢桿菌168株的D-Ala-D-Ala連接酶基因的氨基酸序列[Nature，390, 249-256(1997)]作為質詢，使用作為枯草芽孢桿菌168株的基因組DNA的數據庫的Subtilist (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/)的同源性檢索功能,對存在于枯草芽孢桿菌168株的基因組DNA序列中的編碼具有同源性的蛋白質的基因進行檢索。
[0263]結果在提取的序列中，將編碼作為D-Ala-D-Ala連接酶基序[Biochemistry, 30, 1673 (1991)]的序列號33、34或35表示的氨基酸序列，同時編碼其功能已經被鑒定的蛋白質的基因排除后，選擇表現出與D-Ala-D-Ala連接酶基序最高同源性(29.1%)的序列作為功能未知基因YwfE0
[0264]iwfE的堿基序列如序列號9所示，由該堿基序列編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列號I所示。
[0265]【實驗例2wfE基因表汰株的構津】
[0266]根據實驗例I得到的堿基序列信息，象以下那樣操作可以取得枯草芽孢桿菌的HfE基因片段。
[0267]首先將枯草芽孢桿菌168株(ATCC23857)接種于LB培養基[10g/l細菌培養用胰化蛋白胨(Difco公司生產)、5g/l酵母提取物(Difco公司生產)、5g/l氯化鈉]，于30°C下靜置培養過夜。培養后通過使用Current Protocols in Molecular Biology所述的飽和酚方法，對該微生物的染色體DNA進行分離純化。[0268]使用Perseptive Biosystems公司制造8905型DNA合成儀,合成具有序列號19~22表示的堿基序列的DNA (以下分別稱之為引物A、引物B、引物C和引物D)。引物A是附加在枯草芽孢桿菌染色體DNA的含有HfE起始密碼子的區域5’端的含有XMI識別序列的堿基序列。引物B是附加在與含有HfE的終止密碼子的序列互補的堿基序列號5’端的含有MmHI識別序列的堿基序列。引物C是附加在含有iin啟動子的表達載體pTrS30 [從大腸桿菌JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制備]的啟動子區域的堿基序列號5’端的含有EmRI識別序列的堿基序列。引物D是附加在與含有ii衛啟動子的表達載體pTrS30的
啟動子區域的序列互補的序列號5’端的含有邊21識別序列的堿基序列。
[0269]在基因片段的擴增中使用上述引物A和引物B、枯草芽孢桿菌的染色體DNA作為模板，在ii衛啟動子區域的片段擴增中使用引物C和引物D、pTrS30作為模板進行PCR。PCR通過制備含有作為模板的0.1 μ g的染色體DNA或IOng的pTrS30、0.5 μ mol/L的各引物、2.5units的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司牛.產)、4 μ L的Pfu DNA聚合酶用XlO緩沖液(Stratagene 公司生產)、各 200 μ mol/L 的 dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)的反應液40 μ L，按照94°C下I分鐘、55°C下2分鐘、72°C下3分鐘為一個循環，反復進行30次來實施。
[0270]將該反應液的1/10量進行瓊脂糖凝膠電泳，確認在使用引物A和引物B的PCR中擴增了相當于IlfE基因片段的約1.4kb、在使用引物C和引物D的反應中擴增了相當于啟動子區域的DNA片段的約0.3kb的DNA片段后，添加與剩下反應液等量的TE[10mmol/LTris-HCl (pH8.0) UmmoI/L EDTA]飽和酚/氯仿(lvol/lvol)溶液，并混合。向該溶液經離心分離后得到的上層加2倍容量的冷乙醇，并混合，于_80°C下放置30分鐘。將該溶液離心分離使DNA沉淀后，將該DNA溶解于20 μ L的TE。
[0271 ] 使用各個該溶液各5 μ L，將用引物A和引物B擴增的DNA用限制酶迪和MlHI進行酶切，而使用引物C和引物D擴增的DNA用限制酶EmRI和邊21進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段分離后，使用geneclean II試劑盒(GENECLEAN II kit、B10101社制)，分別回收含有IlfE的1.4kb和含有ii衛啟動子區域的0.3kb的DNA片段。
[0272]將含有ii衛啟動子的表達載體pTrS30 [由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制備]0.2 μ g用限制酶EmRI和MmHI酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，通過與上述同樣的方法，回收4.5kb的DNA片段。
[0273]使用連接試劑盒(Takara Bio公司生產),使上述得到的含有ywfE的1.4kb片段、含有--η啟動子區域的0.3kb片段和4.5kb的片段于16°C下反應16小時，進行連接。
[0274]通過使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sc1., USA, 69, 2110 (1972)]用該反應液轉化大腸桿菌匪522株(Stratagene公司生產)后，涂布于含有50 μ g/ml的氨節青霉素的LB瓊脂培養基，于30°C下培養過夜。
[0275]根據眾所周知的方法從生長繁殖下來的轉化體菌落提取質粒，通過使用限制酶解析其構造，確認取得了在iin啟動子下游連接了 ywfE的表達載體PPE43 (圖1)。
[0276]【實驗例3二肽的生產】
[0277]將實驗例2得到的帶有pPE43的大腸桿菌匪522 (大腸桿菌匪522/pPE43株)接種在加入了含有50 μ g/ml氨芐青霉素的8ml LB培養基的大型試管中，于28°C下培養17小時。對該培養液進行離心分離、取得濕菌體。[0278]制備由終濃度60mg/ml的該濕菌體、120mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH7.4)、60mmol/L 的氯化續、60mmol/L 的 ATP、30mmol/L 的 L_Ala、30mmol/L 的 L_Gln、0.4% 的 NymeenS-215構成的0.1ml的反應液，于37 °C下反應3分鐘。
[0279]反應結束后，將反應生成物用二硝基酚化法衍生后，通過HPLC法進行分析。在通過HPLC法進行的分析中，分離柱使用關東化學社制的Lichrosorb-RP-18柱，洗脫液使用1%(ν/ν)磷酸、25%(v/v)乙腈，以0.7ml/分鐘的流速進行。其結果確認反應液中生成蓄積120mg/L 的 L-丙氨酸-L-谷氨酸胺(L-Ala-L-Gln)。
[0280]在作為對照菌株只含有載體的大腸桿菌匪522/pTrS30株的菌體中沒有確認L-Ala-L-Gln 的生成。
[0281]【實驗例4C末端附加His-tag重組型二肽合成酶的純化】
[0282]使用上述DNA合成儀，合成具有序列號23和24表示的堿基序列的DNA (以下、分別稱為引物E、引物F)。引物E是含有將HfE的起始密碼子(atg)置換為識別序列(ccMgg)的區域的堿基序列。引物F是含有將MfE的終止密碼子置換為_HI識別序列(Kgatcc)的區域的堿基序列。
[0283]以枯草芽孢桿菌168株(ATCC23857)的染色體DNA作為模板，使用上述引物E和引物F作為引物組進行PCR。PCR通過制備含有0.1μ g的染色體DNA、0.5ymol/L的各引物、2.51111^8的￡包DNA聚合酶、4μ L的￡包DNA聚合酶用X 10緩沖液、200 μ mol/L的各dNTP的反應液40μ L，按照94°C下I分鐘、55°C下2分鐘、72°C下3分鐘為一個循環，反復進行30次來實施。[0284]將該反應液的1/10量進行瓊脂糖凝膠電泳，確認擴增了相當于HfE片段的約1.4kb后，添加與剩下反應液等量的TE飽和酚/氯仿溶液，并混合。向該溶液經離心分離后得到的上層加2倍容量的冷乙醇，并混合，于_80°C下放置30分鐘。將該溶液離心分離得到的DNA沉淀溶解于20 μ L的TE。
[0285]使用各個該溶液各5 μ L，將擴增的DNA用限制酶和_ΗΙ進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段分離后，使用GENECLEAN II試劑盒回收含有登￡￡的1.4kb的DNA片段。
[0286]將C末端附加His-tag重組體表達載體pQE60 (Qiagen公司生產)0.2g用限制酶 和_HI酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段分離后，使用與上述同樣的方法回收
3.4kb的DNA片段。
[0287]使用連接試劑盒，使上述得到的含有MfE的1.4kb DNA片段和3.4kb DNA片段于16°C下反應16小時，進行連接。
[0288]通過使用鈣離子的方法用該連接反應液轉化大腸桿菌匪522株后，涂布于含有50 μ g/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養基，于30°C下培養過夜。
[0289]通過眾所周知的方法從生長繁殖的轉化體菌落提取質粒，使用限制酶對其構造進行解析，確認取得了 C末端附加His-taR型ywfE表達載體的pQE60ywfE (圖2)。
[0290]將帶有pQE60ywfE的大腸桿菌NM522 (大腸桿菌NM522/pQE60ywfE株)接種在加入了含有50 μ g/ml的氨芐青霉素的8ml的LB培養基的大型試管，于28°C下培養17小時。將該培養液接種在加入了含有50 μ g/ml的氨芐青霉素的50ml的LB培養基的250ml容量三角燒瓶，于30°C下培養3小時后，按照終濃度達到lmmol/L那樣添加異丙醇-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再于30°C下培養4小時。對該培養液進行離心分離取得濕菌體，使用HisTrap(附加His-tag蛋白質純化試劑盒、Amersham Pharmasia Biotech社制),根據說明書從該濕菌體純化附加His-tag重組型酶。
[0291]【實驗例5使用附加His-tag重組型酶生產二肽(I)】
[0292](i)制備由實驗例4中取得的純化了的附加His-tag重組型酶0.04mg>IOOmmol/L 的 Tris-HCl (pH8.0).BOmmoI /I,的氯化續、60mmol/L 的 ATP、30mmol/L 的 L_Ala、30mmol/L的L-Gln構成的0.1ml反應液，于37°C進行16小時反應。
[0293]反應結束后，通過與上述實驗例3同樣的方法分析反應生成物，確認反應液中生成蓄積 3.7g/L 的 L-Ala-L-Gln 和 0.3g/L 的 L-丙氛酸-L-丙氛酸(L-Ala-L-Ala)。
[0294](ii)除了酶為 0.01mg、取代 L-Gln 含有 L-Phe、L-Met、L-Leu 或 L-Val 以外，制備與上述(i)的反應液組成相同的反應液，于上述(i)的反應條件下進行反應。
[0295]反應結束后，通過與上述實驗例3同樣的方法對反應生成物進行分析，確認反應液中分別生成蓄積7.0g/L的L-丙氨酰-L-苯丙氨酸(L-Ala-L-Phe)、7.0g/L的L-丙氛酸-L-蛋氛酸(L-Ala-L-Met)和 0.03g/L 的 L-Ala-L_Ala、5.0g/L 的 L-丙氛酸-L-売氨酸(L-Ala-L-Leu)和 0.2g/L 的 L-Ala-L-Ala,或 1.6g/L 的 L-丙氨酰-L-纈氨酸(L-Ala-L-Val)和 0.3g/L 的 L-Ala-L-Ala0
[0296](iii)除了酶為 0.0 lmg、取代 L-Ala 含有 Gly、取代 L-Gln 含有 L-Phe 或 L-Met 以外，制備與上述(i)的反應液 的組成相同的反應液，在上述(i)的反應條件使其反應。
[0297]反應結束后，通過與上述實驗例3同樣的方法對反應生成物進行分析，確認反應液中分別生成蓄積5.2g/L的甘氨酰-L-苯丙氨酸(Gly-L-Phe)或1.lg/L的甘氨酰-L-蛋氨酸(Gly-L-Met )。
[0298]如果從上述反應液組成中去除ATP，完全不能生成二肽。
[0299]以上結果表明MfE基因產物在ATP存在下具有生成L-Ala和L_Gln、由L_Phe、L-Met> L-Leu 或 L-Val 生成 L-Ala-L-Gln 和 L_Ala_L_Ala、L-Ala-L-Phe> L-Ala-L-Met 和L-Ala-L-Ala、L-Ala-L-Leu 和 L_Ala_L_Ala、或 L-Ala-L-Val 和 L-Ala-L-Ala 的活性、由 Gly和 L-Phe 或 L-Met 生成 Gly-L-Phe 或 Gly-L-Met 的活性。
[0300]【實驗例6使用附加His-tag重組型酶生產二肽(2)】
[0301]制備由實驗例4中得到的純化了的附加His-tag重組型酶0.04mg> 100mmol/L的Tris-HCl (pH8.0)、60mmol/L的氯化鎂、60mmol/L的ATP構成的0.1ml反應液，按照分別達到30mmol/L那樣向反應液中添加由表1的第I行和最左列的氨基酸的組合構成的各種L-氨基酸、Gly或β-Ala，于37°C下進行16小時反應。反應結束后，對反應生成物進行HPLC分析，確認生成表1所示的二肽。
[0302]【表1-1】
【權利要求】
1.二肽的制造方法，其特征是將具有生產具有由I種以上的氨基酸生成二肽活性的蛋白質的能力，而且具有生產該I種以上的氨基酸中的至少I種氨基酸的能力的微生物在培養基中進行培養，使二肽在該培養基中生成、蓄積，從該培養基回收二肽， 其中在微生物只能生產I種氨基酸時，所述培養基是添加另外I種氨基酸的培養基，其中微生物是屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的微生物，以及其中具有由I種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質是由序列號9~16和36中的任一個表 示的堿基序列構成的DNA編碼的蛋白質，二肽是式R1-R2表示的二肽，式中，
R1 為 L-Ala 時，R2 是 L-Cys, L-Lys, L- a AB 或 L-Cit ；
R1 為 L-Gly 時，R2 是 L-Trp, L-Cys, L-Lys, L- a AB 或 L-Cit ；
R1 為 L-Gln 時，R2 是 L-Phe ；
R1 為 L-Ser 時，R2 是 L-a AB ;
R1 為 L-Cys 時，R2 是 L-Gln 或 L-Met ；
R1 為 L-Met 時，R2 是 L-Lys 或 L-His ；以及
R1 為 L- a AB 時，R2 是 L-Gln、L-Thr、L-Arg 或 L- α ΑΒ。
2.權利要求1所述的制造方法，其中生產氨基酸的能力是通過選自以下[I]~[5]中的方法獲得的: [1]緩和或解除至少一個調控該氨基酸生物合成的結構的方法， [2]對至少一個參與該氨基酸生物合成的酶表達增強的方法， [3]使至少一個參與該氨基酸生物合成的酶基因的拷貝數增加的方法， [4]對至少一個由該氨基酸生物合成途徑到該氨基酸以外的代謝產物的旁路的代謝途徑進行弱化或阻斷的方法， [5]與野生型株相比，選擇對該氨基酸的類似物的抗性高的細胞株的方法。
3.權利要求1所述的制造方法，其中屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的微生物是大腸桿菌(Escherichia coli)。
4.權利要求1~3中的任一項所述的制造方法，其中微生物是選自下述[I]的I種以上的肽酶和選自下述[2]的具有I種以上肽轉運活性的蛋白質的活性低下或喪失的微生物， [1]肽酶是由序列號45~48中的任一個表示的氨基酸序列構成的蛋白質、 [2]由序列號49~53中的任一個表示的氨基酸序列構成的蛋白質。
5.權利要求1~3中的任一項所述的制造方法，其中微生物是選自下述[I]的3種以上肽酶的活性低下或喪失的微生物， [I]肽酶是由序列號45~48中的任一個表示的氨基酸序列構成的蛋白質。
6.權利要求4或5所述的制造方法,其中微生物是屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的微生物。
7.權利要求6所述的制造方法,其中屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的微生物是大腸桿菌(Escherichia coli)。
【文檔編號】C12N9/00GK103642882SQ201310593697
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2005年6月24日 優先權日:2004年6月25日
【發明者】橋本信一, 田畑和彥 申請人:協和發酵生化株式會社