花生青枯病菌環介導等溫擴增檢測引物及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種花生青枯病菌的LAMP檢測引物及其快速檢測方法，可用于花生青枯病菌的特異性檢測。通過設計花生青枯病菌的LAMP檢測引物，包括外側引物F3：5’-TCTTGATAAGGCGGGGGT-3’，B3：5’-AAACACCGATCTCTCGATGC-3’；內側引物FIP：5’-CCAGTTCACGGCAAGATCGCTTTCAAGTCCTACCAGACCCA-3’，BIP：5’-ACCTGCTTTGCAAGCAGGGG-GCGTTTGGCTACCACAAGG-3’。經恒溫擴增，采用SYBRgreenⅠ顯色劑顯色或瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到綠色熒光或出現LAMP特征性的梯形帶。所發明的LAMP引物及檢測方法可用于生產實踐中花生青枯病菌感染的植株或者發病潛伏期時花生青枯病菌的快速、靈敏、準確的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測、鑒定，為防治花生青枯病菌引起的病害提供可靠的技術和理論依據。
【專利說明】花生青枯病菌環介導等溫擴增檢測引物及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農作物病害檢測、鑒定及防治【技術領域】，具體涉及一種花生青枯病菌的LAMP檢測引物及其快速檢測方法，可用于花生青枯病菌的高靈敏度、快速的特異性分子檢測，還可用于花生青枯病的早期診斷和病菌的監測和鑒定。
【背景技術】
[0002]花生青枯病是由WWoflia SoJaflacearw引起的一種細菌性維管束病害。該病害于1905年在印度尼西亞首次報道，隨后在20多個國家和地區相繼發生或出現報道。目前，主要以中國、印度尼西亞和越南危害較重。我國關于花生青枯病的報道始見于30年代后期，現在主要分布于中部和南方地區，每年全國實際病地面積在40萬hm2以上，受危害程度居世界首位。花生青枯病發病率一般在10% - 30%左右，減產20%以上；重病區發病率可在50%以上，甚至導致完全絕收。近年來有報道顯示，花生青枯病表現出向北蔓延的趨勢，給花生生產帶來更大威脅。除引起減產外，青枯病的發生還會降低花生品質，并增加黃曲霉毒素的污染。同時，花生青枯病是一種土傳病害，可經雨水、土壤、病殘體等從發病區向未發病區傳播，且其侵染能力強，在較短的時間內可造成植株枯萎死亡。隨著設施農業的高度集約化生產，復種指數高，品種單一，導致該類病害的發生越來越嚴重。因此，開展花生青枯病菌的快速檢測，對該病害的早期診斷和及時防治具有十分重要的意義。
[0003]目前，關于花生青枯菌的檢測方法包括傳統分離培養法、血清學和分子生物學等方法。青枯病菌的傳統檢測方法是采用選擇性培養基對病原物進行分離純化，然后進行一系列的生理生化實驗進行診斷，該方法易受外界因素的影響且靈敏度較低。而應用血清學方法時血清的制備過程耗時耗力，且可能存在交叉反應，造成檢測結果的假陽性，難以滿足對花生青枯病診斷的實際需要。因此，建立一套快速、靈敏、準確的花生青枯病菌檢測診斷技術不僅非常必要，而且十分迫切。
[0004]PCR技術為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的新途徑，然而目前PCR特異性檢測技術仍然需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，限制了 PCR檢測方法的推廣應用。環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,簡稱 LAMP)是 2000 年由日本榮研株式會社Notomi等人開發的一種新型循環恒溫核酸擴增技術。LAMP反應針對靶基因的6個位點設計出4條引物,利用一種鏈式置換活性的DNA聚合酶DNA polymerase),在恒溫條件下(60 - 65°C )保溫30 - 90分鐘，即可完成擴增反應。由于LAMP反應的高效性和等溫快速擴增的特點，在90分鐘內可擴增IO9 - 101°倍，其擴增產物的檢測一般采用熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度觀察等方法。由于LAMP反應簡單、快速、高效、經濟等特征，因而具有極為廣泛的應用前景。目前LAMP檢測主要應用于人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測，在植物病原菌檢測中報道極少，將LAMP方法應用于花生青枯病菌的檢測國內外均未見報道。
【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供花生青枯病菌的LAMP檢測引物及其快速檢測方法，本方法易于操作、特異性強、靈敏度高，可得到準確可靠的實驗結果。
[0006]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
花生青枯病菌的LAMP檢測引物及其快速檢測方法，其具體步驟如下:
1、LAMP引物的設計:根據花生青枯病菌的16S-23S rDNA ITS序列采用PrimerExplorer V4軟件設計一種LAMP檢測引物,包括一對外引物和一對內引物，引物序列如下:
外側引物 F3:5’ -TCTTGATAAGGCGGGGGT-3’ (SEQ ID N0:1)；
B3:5’ -AAACACCGATCTCTCGATGC-3’ (SEQ ID NO:2)；
內側引物 FIP:5’ -CCAGITCACGGCAAGATCGCITTCAAGTCCTACCAGACCCA-3’ (SEQ IDNO:3)；
BIP:5’ -ACCTGCTTTGCAAGCAGGGG-GCGTTTGGCTACCACAAGG-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0007]2.花生青枯病菌快速檢測體系的建立:
1)采用NaOH快速裂解法提取花生青枯病菌的DNA，具體步驟如下:
a.將花生病莖用清水洗凈、晾干；
b.按Img病莖加入10(0.5mol/L NaOH, 0.5%PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，12000rpm 離心 5min ；
c.取上清液20u I與等體積的0.1 mo I/L的Tris-HCl (pH8.0)混合，所得溶液稀釋10倍作為LAMP反應的DNA模板。
[0008]2)利用所設計的LAMP檢測引物進行擴增，LAMP反應體系為25 U 1，包括5 ii M外側引物F3和B3各0.25iU，40iiM內側引物FIP和BIP各0.25μl，反應混合液18.0u 1,8ubst DNA聚合酶1 μl，DNA模板25ng，用滅菌超純水補足至25 U 1 ; LAMP反應條件為65 °C溫育 60 min,82°C保溫 IOmin ；
所述的反應混合液中各組分的濃度為40mM Tris-HCl, 20mM (NH4)2S04, 20mM KC1，16 mMMgSO4,0.2% Triton X_100，1.6M Betaine, 2.8 mM dNTPs。
[0009]3、結果測定:采用熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進行測定。采用熒光染料目測觀察法，在LAMP反應的最終擴增產物中加入顯色劑SYBR green I 1 U 1，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；采用瓊脂糖凝膠電泳法，取2iU PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0010]本發明可用于花生青枯病潛伏期或者發病期時的病害檢測。建立針對花生青枯病菌的快速、簡便、特異性強、靈敏度高的監測技術體系，對于花生青枯病菌引起病害顯癥之前的早期監測，及確定病害防治的最佳時期具有十分重要的意義。
[0011]本發明有益效果:
本發明方法適用于花生青枯病菌感染的植株或發病潛伏期時花生青枯病菌的快速可靠的檢測、鑒定，對于防治農業生產中花生青枯病菌引起的病害具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果:
1、特異性強:本發明所設計的LAMP檢測引物是針對花生青枯病菌16S-23S rDNA ITS序列中6個不同區域設計出4條特異性引物，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故特異性強。
[0012]2、靈敏度高:本發明所設計出的LAMP引物，對花生青枯病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10fg。
[0013]3、實用性好:本發明所設計出的LAMP引物，可用于花生青枯病菌感染的植株或者發病潛伏期時的高靈敏度快速檢測，對花生青枯病的早期診斷和及時防治具有十分重要的意義。
[0014]4、操作簡便快速:應用本發明檢測方法，對花生青枯病菌感染的植株或者發病潛伏期的植株檢測可在數小時內完成，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需一個水浴鍋即可，不需要復雜的儀器設備和昂貴的分子試劑，結果肉眼直接可見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發明對花生青枯病菌的特異性檢測結果圖，圖A為瓊脂糖凝膠電泳結果，圖B為熒光染料顯色結果。
[0016]圖2為本發明對花生青枯病菌的靈敏性檢測結果圖，圖A為瓊脂糖凝膠電泳結果，圖B為熒光染料顯色結果。
[0017]圖3為本發明對人工接種花生青枯病菌植物組織的檢測結果圖，圖A為瓊脂糖凝膠電泳結果，圖B為熒光染料顯色結果。
【具體實施方式】
[0018]根據花生青枯病 菌的16S-23S rDNA ITS序列設計一種LAMP檢測引物，包括一對外引物和一對內引物，引物序列如下:
外側引物 F3:5’ -TCTTGATAAGGCGGGGGT-3’ (SEQ ID NO:1)；
B3:5’ -AAACACCGATCTCTCGATGC-3’ (SEQ ID NO:2)；
內側引物 FIP:5’-CCAGITCACGGCAAGATCGCITTCAAGTCCTACCAGACCCA-3’(SEQ IDNO:3)；
BIP:5’ -ACCTGCTTTGCAAGCAGGGG-GCGTTTGGCTACCACAAGG-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0019]實施例1本發明對花生青枯病菌的特異性檢測 1.花生青枯病菌的LAMP特異性檢測
I)以花生青枯病菌和25株其他菌株為供試材料，采用CTAB法提取花生青枯病菌DNA。具體方法如下:將花生青枯病菌接種于NA液體培養基，28°C、200rpm過夜培養；取1.5ml培養物12000rpm離心2min，棄上清后加入567 U I TE緩沖液重新懸浮菌體，加入30 yl10%SDS溶液和3 u I 20mg/ml的蛋白酶K，輕輕混勻，于37°C溫育Ih ;加入100 u I 5mol/LNaCl溶液充分混勻，再加入80 u I CTAB/NaCl溶液，混勻后65°C溫育IOmin ;加入800 U I的酚/氯仿/異戊醇溶液(三者體積比為25:24:1)混勻，12000rpm離心5min，取上清液，加A 0.6-0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀，12000rpm離心15 min收集沉淀；加入1000u I無水乙醇,混勻，12000 rpm離心5 min ;棄上清液后在超凈工作臺上自然晾干,加200 u I TE溶液溶解沉淀，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至50ng/U I待用；2)利用所設計的LAMP檢測引物進行擴增，LAMP反應體系為25U 1，包括5 y M外側引物F3和B3各0.25 ii 1，40 ii M內側引物FIP和BIP各0.25 y 1，反應混合液18.0 u l,mBstDNA聚合酶I ii 1，DNA模板25ng，用滅菌超純水補足至25 u I ；LAMP反應條件為65°C溫育60 min,82°C保溫 IOmin ；
所述的反應混合液中各組分的濃度為40mM Tris-HCl, 20mM (NH4) 2S04, 20mM KC1，16 mMMgSO4,0.2% Triton X-100,1.6M Betaine,2.8 mM dNTPs ；
3)在LAMP反應的最終擴增產物中加入顯色劑SYBRgreen I I u 1，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2 Ul擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0020]2.檢測結果
圖1為采用本發明測定花生青枯病菌的LAMP特異性檢測結果圖，圖A為瓊脂糖凝膠電泳結果，圖B為熒光染料顯色結果，其中:泳道M為2000bp DNA分子量marker，泳道I為陰性對照，泳道2為花生青枯病菌，泳道3-11為其他參試菌株。
[0021]從圖1 (A)可見，泳道2可觀察到花生青枯病菌的特異性綠色熒光；從圖1(B)可見泳道2出現LAMP特征性的梯形帶，其余25株其他菌株顯色結果為橙色，瓊脂糖凝膠電泳均沒有出現擴增條帶，說明本發明對花生青枯病菌具有很強的特異性。
[0022]實施例2本發明對花生青枯病菌的靈敏性檢測 1.花生青枯病菌的LAMP靈敏性檢測
采用10倍濃度系列稀 釋法將提取的花生青枯病菌DNA稀釋成10ng，lng, 100 pg，10pg, I pg, 100 fg, 10 fg, Ifg 和 100 ag 共 9 個不同濃度梯度。
[0023]①按實施例1中的反應體系及條件進行擴增；
②在LAMP反應的最終擴增產物中加入顯色劑SYBR green I I yl，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2 Ul擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0024]2.檢測結果:
圖2為采用本發明測定花生青枯病菌的LAMP靈敏性檢測結果圖，圖A為瓊脂糖凝膠電泳結果，圖B為熒光染料顯色結果，其中:泳道M為2000bp DNA分子量marker，泳道1-9為不同濃度的花生青枯病菌DNA,其濃度依次為IOng, Ing, 100 pg, 10 pg, I pg, 100 fg,10 fg, I fg和IOOag/ 泳道10為陰性對照。
[0025]由圖2可見，在泳道1-7上均可觀察到綠色熒光，瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶，表明本發明的檢測靈敏度可達10fg。
[0026]實施例3本發明對人工接種花生青枯病菌植物組織的檢測
1.人工接種花生青枯病菌植物組織的檢測
采用浸種法接種花生青枯病菌。隨機選取2株顯癥植株和3株尚未顯癥植株進行檢測，同時以花生青枯病菌基因組DNA作為陽性對照，健康花生植株作為陰性對照。采用NaOH快速裂解法提取花生青枯病菌DNA。
[0027]按下述方法進行LAMP檢測:
①按實施例1中的反應體系及條件進行擴增；
②在LAMP反應的最終擴增產物中加入顯色劑SYBRgreen I I yl，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2 Ul擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0028]2.檢測結果
圖3為采用本發明測定人工接種花生青枯病菌植物組織的檢測結果圖，圖A為瓊脂糖凝膠電泳結果，圖B為熒光染料顯色結果，其中:泳道M為2000bp DNA分子量marker，泳道I為陽性對照，泳道2-3為發病植物組織，泳道4-6為發病潛伏期植物組織，泳道7為健康植物組織，泳道8為陰性對照。
[0029]由圖3可見，泳道2-6均可觀察到綠色熒光及LAMP特征性的梯形帶，健康組織和陰性對照的顯色結果為橙色，瓊脂糖凝膠電泳均無擴增條帶出現。表明本發明可用于花生青枯病潛伏期或者感病初期時的病害檢測。
[0030]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范 圍。
【權利要求】
1.一種花生青枯病菌的LAMP檢測引物，其特征在于:根據花生青枯病菌的16S-23SrDNA ITS序列設計一種LAMP檢測引物，包括一對外弓丨物和一對內引物,外側引物F3序列為SEQ ID N0:1 ;B3 序列為 SEQ ID NO: 2 ;內側引物 FIP 序列為 SEQ ID NO: 3 ;BIP 序列為 SEQID N0:4。
2.權利要求1所述的花生青枯病菌的LAMP檢測引物的應用方法，其特征在于:利用所設計的LAMP檢測引物進行擴增，LAMP反應體系為25 yl，包括5 y M外側引物F3和B3各.0.25ii l，40iiM內側引物FIP和BIP各0.25 y I，反應混合液18.0 y l,mBst DNA聚合酶.1111，0嫩模板25叩，用滅菌超純水補足至25 u I ;LAMP反應條件為65°C溫育60 min，82°C保溫IOmin ； 所述的反應混合液中各組分的濃度為40mM Tris-HCl, 20mM (NH4)2S04, 20mM KC1，16 mMMgSO4,0.2% Triton X_100，1.6M Betaine, 2.8 mM dNTPs。
3.根據權利要求2所述的花生青枯病菌的LAMP檢測引物的應用方法，其特征在于:在LAMP反應的擴增產物中加入顯色劑SYBR green I I yl，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；或取2iU擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現梯形條帶判斷為陽性，沒有出現則判斷為陰性。
【文檔編號】C12N15/11GK103614474SQ201310609810
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】謝世勇, 李本金, 陳慶河, 游泳, 丁雪玲, 劉裴清 申請人:福建省農業科學院植物保護研究所