花生紫黃質脫環氧化酶基因及其編碼蛋白和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及花生紫黃質脫環氧化酶基因，核苷酸序列見序列表中序列1。花生紫黃質脫環氧化酶基因的氨基酸序列，氨基酸序列見序列表中序列2。花生紫黃質脫環氧化酶在保護光合機構中的應用。將花生紫黃質脫環氧化酶基因轉染到煙草得到轉基因植株，在過剩光能脅迫下，轉基因植株有著比野生型植株更高的NPQ和葉黃素循環的脫環氧化狀態，表明在過剩光能條件下，AhVDE的過量表達使葉黃素循環組分相對含量發生改變從而導致了脫環氧化狀態的改變，提高了葉黃素循環的熱耗散能力。轉基因植株耗散過剩光能的能力增強使PSII激發能壓力減少，從而減輕了PSII和PSI在過剩光能脅迫下光抑制程度，最終保護了光合機構。
【專利說明】花生紫黃質脫環氧化酶基因及其編碼蛋白和應用
[0001]【技術領域】
本發明屬于生物【技術領域】，特別涉及花生紫黃質脫環氧化酶基因(JAKM)和氨基酸序列及其在光系統保護方面的應用。
[0002]【背景技術】
花生是重要的油料作物和經濟作物，在我國農業生產乃至整個國民經濟中具有重要地位。高溫和強光往往會引起光抑制，影響了花生光合產物的積累，進而影響莢果的發育，產量降低。隨著環境的不斷惡化，如何提高作物防御光破壞能力已成為主要目標之一。當前發展迅速的基因工程技術為植物遺傳改良提供了新的途徑，利用在熱耗散過程中起重要作用的基因進行遺傳轉化是獲得新種質的重要手段。因此，發掘緩解光抑制方面的重要基因資源對提高花生產量和品質具有重要的意義，將為花生的遺傳改良奠定堅實基礎。
[0003]光能被捕獲以后，主要有三條相互競爭的出路:光化學電子傳遞、葉綠素熒光發射和熱耗散。葉綠素熒光猝滅與光合作用的量子效率呈負相關，表明了一種調節機理，即降低光飽和條件下的PSII的光化學效率，可以避免光抑制、光破壞的發生。但由于葉綠素熒光只消耗捕獲光能的很少一部分，因此光化學反應受阻時，熱耗散就成了消耗過剩光能的重要途徑，其中，依賴葉黃素循環的熱耗散在逆境脅迫中對植物起著非常重要的保護作用。葉黃素循環在自然界中廣泛存在，主要定位于所有高等植物、蕨類植物、苔蘚以及部分藻類植物的類囊體膜上。其過程是指葉黃素三個組分(紫黃質、花藥黃質和玉米黃質)依光照條件的改變而相互轉化的過程。當光合機構吸收的光能不能全部用于碳同化時，含雙環氧的紫黃質(Viofaxanthin ;V)在紫黃質脫環氧化酶(violaxanthin de-epoxidase, VDE)的催化下，通過單環氧的花藥黃質(Antheraxanthin ；A)轉化為無環氧的玉米黃質(zeaxanthin ；Z);而在弱光條件下，Z會在玉米黃質環氧化酶(zeaxanthin epoxidase, ZE)的催化下,通過A轉化為Z。其中A和Z的形成能夠誘導捕光復合物形成耗散狀態，有利于耗散過剩的激發能，使光合機構免受過量光能破壞，提高植物的抗逆性。成熟的VDE屬于類囊體腔蛋白，這類蛋白前體在核糖體被合成后，需要通過轉運肽的運輸作用，連續通過葉綠體外膜、內膜進入基質，再通過類囊體膜，最后到達類囊體腔內，與類囊體膜結合后催化由紫黃質(V)向玉米黃質(Z)的脫環氧化反應。目前在花生中還未見VDE基因克隆及其功能研究的報道。
[0004]
【發明內容】

為了進一步研究各種植物的紫黃質脫環氧化酶對葉黃素循環過程的影響，本發明提供了一種花生紫黃質脫環氧化酶GAKM)基因。
[0005]本發明還提供了由花生紫黃質脫環氧化酶基因編碼蛋白的氨基酸序列。
[0006]本發明通過將必切5'基因轉入煙草中，可以顯著提高轉基因植株的脫環氧化水平，保護光系統。
[0007]為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現: 一種花生紫黃質脫環氧化酶基因，堿基序列見序列表中序列I。
[0008]克隆所述花生基因的引物名稱與序列如下:
VDE-F:5’-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3’ (JbaI)；VDE-R:5’-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG-3’ (BamHI)。
[0009]所述的花生紫黃質脫環氧化酶基因編碼蛋白的氨基酸序列見序列表中序列2。
[0010]所述的表達蛋白在保護光合機構中的應用。
[0011]將花生必切5'基因在煙草中超量表達，轉基因幼苗的葉黃素循環脫環氧化狀態(A+Z) / (V+A+Z)在高溫強光脅迫條件下可達到80% ;低溫弱光條件下達到70%。
[0012]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
1、本發明從花生中克隆了 JAKM基因并分析得到其氨基酸序列。
[0013]2、轉基因植株有著比野生型植株更高的NPQ和葉黃素循環的脫環氧化狀態；本發明將KM基因在煙草過量表達后在高溫強光脅迫下可顯著提高葉黃素循環中的脫環氧化狀態；Ah-4和Ah-9轉基因株系中(A+Z) / (V+A+Z)分別增加到76%和80% ；
3、在低溫弱光條件下其(A+Z) / (V+A+Z)可增加至70%，與在煙草中超表達的番茄紫黃質脫環氧化酶基因(ZeKM)相比，其作用效果更加明顯，提高了轉基因植株依賴葉黃素循環的熱耗散能力。
[0014]4、轉基因植株耗散過剩激發能的能力增強，從而減輕了 PSII和PSI在過剩光能脅迫下光抑制程度，最終保護了光合機構。
[0015]結合附圖閱讀本發明的【具體實施方式】后，本發明的其他特點和優點將變得更加清
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`[0016]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳圖譜;A，AhVDE的中間保守區片段的PCR擴增；B，AhVDE 3’端片段的PCR擴增'C，AhVDE 5’端片段的PCR擴增；D，必切5'基因全長的PCR擴
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[0017]圖2為花生紫黃質脫環氧化酶基因所編碼蛋白的疏水性進行分析；
圖3為酶蛋白為膜蛋白，有兩個跨膜信號區；
圖4必切5'在不同器官中的表達；F^; R:根；S:莖；L:葉片；Fr:果實 圖5野生型花生植株在高溫強光處理過程中KM表達分析；
圖6高溫強光脅迫條件下野生型煙草和轉基因株系葉片的NPQ值變化(A)及葉黃素循環的脫環氧化狀態(B)。
[0018]圖7低溫弱光脅迫條件下野生型煙草和轉基因株系葉片的葉黃素循環的脫環氧化狀態(A+Z) / (V+A+Z)。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明:
實施例1
1.擴增花生紫黃質脫環氧化酶(JAKM)
利用RNA試劑盒(購于天根生化科技有限公司)提取花生葉片RNA并反轉錄。根據已知同源基因的高度保守區，設計簡并引物(5’ -CCTGAYGARACKGAATGTC-3’，5’ -TACCAGTCATCYTGRTAGTG-3’)，進行聚合酶鏈式反應(PCR)，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段與估計的片段大小符合(489 bp)(見圖1 A)。
[0020]將所得的PCR產物與pMD18-T克隆載體連接，轉化大腸桿菌。通過菌落PCR快速篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆的質粒，利用載體內部的酶切位點切割質粒，得到與PCR產物大小相同的條帶。將鑒定好的菌液寄往上海生物工程公司測序，用Blast，DNAman或DNAclub軟件將所得片段序列與來源于其他植物的同源序列進行序列比較，確定該片段為所要克隆的目的基因的中間片段。
[0021]根據所得的必切5'基因中間片段，設計特異引物VDE2(5’ -ATTTCACACAGAAGACAAC-3’)，和大連寶生物公司提供的接頭引物B26進行PCR擴增，得到一條大小895 bp的條帶，與目的基因的3’端片段大小相符(見圖1B)。連入pMD18-T克隆載體，經酶切鑒定，測序。
[0022]根據所得的必切5'基因中間片段，設計特異引物VDEl(5’ -CAAGTTTGTTGTCTTCTGTGTG-3)，利用大連寶生物公司提供的5’ RACE試劑盒進行克隆，得到一條為692 bp的條帶(見圖1C)。同樣的方法與pMD18-T克隆載體連接，提取質粒，酶切鑒定，測序。
[0023]根據所獲得的中間片段、5’片段和3’片段拼接出'全長cDNA，據此設計特異引物 VDE-F 和 VDE-R:
VDE-F:5’-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3’ (JbaI)；
VDE-R:5’-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG-3’ (BamHI)；` 經PCR擴增出約1410 bp帶(圖1D)，連入pMDlS-T Simple克隆載體，經酶切鑒定，測序。
[0024]2.必切5'基因的序列分析
①必KM基因序列特征 *長度:1410堿基對
*類型:核酸 *鏈型:雙鏈 *拓撲結構:線性 分子類型:cDNA 假設:否 反義:否 最初來源:花生
②AhVDE基因表達蛋白的序列特征 *長度:470氨基酸
*類型:氨基酸 *鏈型:單鏈 *拓撲結構:線性 分子類型:蛋白質 序列描述
將該基因編碼的氨基酸序列與GenBank中所有的氨基酸序列進行比對，結果顯示花生的紫黃質脫環氧化酶與擬南芥、煙草、大豆、番茄、小麥等植物的紫黃質脫環氧化酶具有同源性。這表明我們已經成功地克隆到了花生紫黃質脫環氧化酶基因的序列。利用DNAman軟件對這些植物的JAKM基因進行聚類分析，同源性分別為77%，79%，72%, 67%, 71%。[0025]3.基因編碼蛋白的生化特性分析 3.1基因編碼蛋白的疏水性分析
對花生紫黃質脫環氧化酶基因所編碼蛋白的疏水性進行分析，結果表明其極性氨基酸和疏水性氨基酸所占的比例相差不大(圖2)。其中親水性氨基酸所占比例稍高，表明該蛋白為水溶性蛋白。
[0026]3.2 KM基因表達產物跨膜特性分析
通過向互聯網上的在線PRED-TMR數據庫提交JAKM的氨基酸序列，預測到該酶蛋白為膜蛋白，有兩個顯著跨膜信號區(圖3中箭頭所示區域)。
[0027]4.KM基因在花生植株中的表達分析
4.1 JAKM在花生不同器官中的表達
為了解必切5'基因在不同器官中的內源表達情況，我們以花生必切5'基因3’端的一段cDNA為引物進行了熒光定量PCR分析。結果表明，KM基因在所有器官中均有表達，屬于組成型表達，在葉片中的表達明顯高于其他器官，在根中的表達量最低，說明AhVDE基因在葉綠體含量高的組織表達量較高(圖4)。
[0028]4.2高溫強光處理下KM基因在花生葉片中的表達
以25°C正常光照條件下生長的花生植株為對照，將野生型花生植株在高溫(40°C)和強光(1200 μ mo I HT2iT1)下處理8小時。熒光定量PCR結果顯示，高溫強光處理過程中Ah VDE表達量在2小時上升，隨后逐漸降低，(圖5 )。表明VDE的表達受溫度和光強的影響。
[0029]5.JAKM基因植物表達載體的構建
5.1擴增必KM基因
花生品種“花育22”由山東省農業科學院提供，通過RT-PCR擴增了 KM基因的編碼區。
[0030]VDE-F (5，-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3，) {Xbal)；
VDE-R (5’-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG-3’){BamHI)；
上述引物序列分別與KM基因第1-18堿基、第1460-1479堿基對應。
[0031]5.2 '基因與克隆載體pMD18-T Simple及植物表達載體pBI121的連接 回收PCR產物，并在T4 DNA連接酶作用下與克隆載體pMD18-T Simple (購買于
TaKaRa)進行連接,連接產物轉化大腸桿菌Trans5 α獲得了抗卡納的菌落。提取重組質粒，用油al熱BamHl進行雙酶切，回收含'基因的酶切片段，并克隆到植物表達載體PBI121的對應酶切位點中，獲得該基因的植物表達載體pBI121- AhVDE。
[0032]5.3根癌農桿菌LBA4404感受態細胞的制備與轉化 感受態細胞的制備步驟如下:
(1)挑取少許農桿菌LBA 4404，接種于5mLLB液體培養基(含50 mg/L STR)中，28°C、200 rpm培養過夜；
(2)取2mL培養物于LB液體培養基(含50mg/LSTR)中繼續培養，直至0D800為0.5左右。
[0033](3)培養物置冰浴中30 min,4°C,5000 rpm，離心5 min，棄去上清液；
(4)用10 mL冷的0.1 mol/L NaCl懸浮菌液；(5)4°C, 5000 rpm,離心5 min,棄去上清液；
(6)用ImL冷的CaCl2 (20 mmol/L)懸浮,分裝成50 μ L/管,液氮中冷凍后至_80°C保存。
[0034]凍融法農桿菌轉化步驟:
(1)冰浴中融化感受態細胞；
(2)在1.5mL Eppendorf離心管中加入2 μ L表達載體pBI121_必'質粒DNA,再加入50 μ L融化了的感受態細胞，混勻后冰浴30min，液氮中冷凍I min，接著在37°C水浴中放置5 min ；
(3)加入950mL無抗生素的LB液體培養基，28°C、200 rpm振蕩3h ;
(4)8000 rpm離心I min,倒掉上清液,用100 μ L LB回溶菌體；
(5)取50μ L菌液涂到LB固體培養基上(含有50 mg/L Kan, 100 mg/L Rif)，28°C倒置培養2-3 d0
[0035]6.利用農桿菌介導轉化煙草
6.1農桿菌培養:
挑取上述步驟5得到的農桿菌單菌落于5 mL LB液體培養基(含有100 mg/L Rif和50 mg/L Kan)中培養36 h (28°C >200 rpm)，然后取1%接種至上述同樣培養基，28 °C >200rpm培養12 h，取2 mL菌液離心(4°C、4000rpm、lOmin)，然后用20 mL MS液體培養基懸浮菌體，用于轉化試驗。
[0036]6.2煙草轉化、再生體系的建立:
(I)煙草Nc89種子，催芽后，播種于塑料盤中，常規管理，至2-3片真葉期，備用；
(2)取煙草葉片，用70%乙醇消毒30S，再0.l%HgCl2消毒8_10 min，用無菌水沖洗數次后，剪成小塊(0.5*0.5cm2)；
(3)將剪好的煙草葉片置于MS分化培養基中，28°C，光照時間16h/d，光照強度2000LX，預培養2天；
(4)將預培養后的煙草葉片浸入菌液5-10min，然后用滅菌的濾紙吸干多余菌液，接入MS培養基；28°C暗培養2天；
(5)共培養后的外植體用含250mg/L頭孢的滅菌水洗滌3次，然后用滅菌濾紙吸干，轉入含有卡那霉素100mg/L，頭孢250mg/L的分化培養基上，恒溫培養(條件同預培養)；每15
天更換一次培養基；
(6)待芽長至I cm左右時，切下，移入MS生根培養基(附加卡那霉素50 mg/L，頭孢250 mg/L)中，促其生根。待根系發育好后，移入盛有無菌土的花盆中，用塑料薄膜保濕2天
后，溫室常規管理。
[0037]6.3.轉基因植株的PCR檢測
提取再生植株的基因組DNA，利用上述載體序列和KM基因序列設計引物進行PCR擴增。PCR 反應程序 為:95°C、5min ;95°C、50s，53°C、50s，72°C、l min 30s，30 個循環；72°C、IOmin0轉基因植株PCR陽性率達到72.7%。熒光定量PCR的方法選出表達量較高的兩個株系 Ah_4 和 Ah_9。
[0038]7.必切5'的過量表達明顯減輕了高溫強光脅迫下PSII和PSI光抑制的敏感性 7.1轉基因煙草植株中葉黃素循環組分的變化為了驗證JAKM基因的過量表達是否影響葉黃素循環的組分V、A、Z，我們分別測定了野生型，轉基因株系Ah-4和Ah-9在高溫(40°C)強光(I200 μ mol.m-2.s—1)脅迫下葉片中葉黃素循環各組分的相對含量(表1)。與野生型植株相比，轉基因株系中A和Z的含量升高，但V含量降低，并且經高溫強光處理后，轉基因株系中V的含量仍低于野生型，A和Z含量高于野生型。這與JAKM的過量表達增強了由V向Z的環氧化過程有關。這些結果表明KM基因的過量表達明顯改變了葉黃素循環各組分的含量。
[0039]表1
【權利要求】
1.花生紫黃質脫環氧化酶基因，其喊基序列如序列表中序列I所不。
2.擴增花生紫黃質脫環氧化酶基因的引物，其特征在于引物名稱與序列如下:
VDE-F:5’-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3’ (JbaI)；
VDE-R:5’-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG-3’ (BamHI)。
3.—種權利要求1所述的花生紫黃質脫環氧化酶基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
4.一種權利要求3所述的花生紫黃質脫環氧化酶編碼蛋白在保護光合機構中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用， 其特征在于將花生紫黃質脫環氧化酶基因轉染到煙草中得到轉基因煙草。
【文檔編號】C12N15/53GK103695444SQ201410015635
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月14日 優先權日:2014年1月14日
【發明者】楊莎, 萬書波, 李新國, 郭峰, 孟靜靜, 張佳蕾, 黃超, 楊連群 申請人:山東省農業科學院生物技術研究中心