一種抗凍性k-卡拉膠寡糖的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗凍性K-卡拉膠寡糖的制備方法及應用。應用現代生物技術對卡拉膠進行酶解，對降解的卡拉膠寡糖進行Sevage法除蛋白和透析除鹽，對純化得到的卡拉膠寡糖進行研究。該制備方法與現有的卡拉膠寡糖的制備方法相比，制備出的卡拉膠寡糖通過驗證具有抗冷凍能力，具有廣泛的應用范圍，可作為細胞冷藏、凍存過程中的添加劑，同時能用于護膚品中起到皮膚防凍的功效。
【專利說明】一種抗凍性K-卡拉膠寡糖的制備方法及應用
[0001]【技術領域】
本發明涉及一種抗凍性K-卡拉膠寡糖的制備方法及應用。
[0002]【背景技術】
卡拉膠寡糖是卡拉膠的降解產物，分子量較小，溶解性較好，易于吸收，穩定性和安全性都有所改善，同時因分子鏈上的活性基團充分暴露，使其活性較卡拉膠顯著提高，拓寬了卡拉膠的應用領域。目前，由于卡拉膠寡糖種類不同，其成分不同，需要各自相對應的制備方法，需要不同的控制條件及試劑。卡拉膠寡糖的制備方法包括物理法、化學法及微生物酶解法，目前，利用酶解法獲得具有生物活性卡拉膠寡糖的制備方法很多，如中國專利號03138975.9 —種具有抗腫瘤活性的硫酸半乳聚糖的制備方法、中國專利號為200610070792.5 —種具有抗氧化活性的卡拉膠寡糖硫酸酯的制備方法、中國專利號為200810238763.4 一種具有抗病毒活性的卡拉膠硫酸寡糖的制備方法，但尚未有關于利用酶解法制備具有抗凍性K-卡拉膠寡糖及其應用的報道。
[0003]細胞的抗凍主要是通過降低細胞內液的冰點或者是在細胞周圍形成一層保護膜兩種方法，而卡拉膠寡糖的溶解性好，成膜性較差，所以主要通過降低細胞內液冰點來提高細胞的抗凍性。
[0004]
【發明內容】

本發明是為了彌補現有技術存在的缺陷，提供了一種抗凍性K-卡拉膠寡糖的制備方法及應用。
[0005]為了實現上述目的 ，本發明所采用的技術方案為:一種抗凍性K-卡拉膠寡糖的制備方法，其特征在于:
(I)種子液制備:將N5-3 iCellulophaga lytica strain)菌種接種于液體培養基中，培養條件為30°C，150rpm，培養時間為20h ;液體培養基組成為:k_卡拉膠:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陳海水適量。
[0006](2)粗酶液的制備:按2%的接種量接種種子液于發酵液中，12h發酵完成后將發酵液在4°C條件下，5000r/min離心30min，所得上清液為粗酶液；發酵液的培養基成分:k_卡拉膠:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002%。
[0007](3) k-卡拉膠寡糖粗品的制備:按照0.5%卡拉膠:粗酶液:蒸餾水=2:1:1的比例配制好后，置于培養條件為30°C，150rpm的搖床上發酵48h，4°C條件下5000r/min離心30min去掉未降解的卡拉膠，取上清液于70°C下旋轉蒸發濃縮，得到卡拉膠寡糖粗制品濃縮液。
[0008](4) k-卡拉膠寡糖粗制品的純化:按照所得卡拉膠寡糖濃縮液體積的1/5加入氯仿，隨后加入1/5氯仿體積的正丁醇混勻，160r/min震蕩30min,取出經過IOmin離心5000r/min，，取上清液重復上述操作兩次，對上清液在70°C下進行旋轉蒸發濃縮，置于通風處揮發8-10h，得到除去蛋白質的卡拉膠寡糖粗制品濃縮液；將所得的濃縮液裝入500截留分子量的透析袋透析除鹽，透析外液為蒸餾水，置于4°C透析，直到透析外液中加入AgNO3溶液后無白色沉淀產生為止，將透析液在70°C下進行旋轉蒸發濃縮，將所得濃縮液置于-20°C下冷凍24h后于冷凍真空干燥儀上干燥，最終得到較為純凈的卡拉膠寡糖粉末。
[0009]一種抗凍性K-卡拉膠寡糖的應用，其特征在于卡拉膠寡糖可用于細胞冷藏、凍存過程中的抗凍保護添加劑，除了長期保存外，還可用于上述生物體的運輸、購買、轉贈；需要冷凍保存的主要有細胞、組織、器官、肢體，上述冷凍保存還可以向凍存液中添加卡拉膠寡糖粉末，配制成凍存液來凍存細胞、組織、器官、肢體；還可以將卡拉膠寡糖添加到護膚品中，如護手霜、爽膚水、保濕乳、面霜等，提高護膚產品的抗凍能力。
[0010]該制備方法與現有的卡拉膠寡糖的制備方法相比，制備出的卡拉膠寡糖通過驗證具有抗冷凍能力，具有廣泛的應用范圍，可作為細胞冷藏、凍存過程中的添加劑，同時能用于護膚品中起到皮膚防凍的功效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖14°C下卡拉膠寡糖處理24小時后細胞相對活力。
[0012]圖2_20°C下卡拉膠寡糖處理1.5小時后細胞相對活力。
[0013]圖3卡拉膠寡糖跟10%DMS0聯合對_20°C處理3h的細胞相對活力的影響。
[0014]圖44°C下卡拉膠寡糖處理24小時后細胞培養液中LDH漏出率。
[0015]圖5_20°C下卡拉膠寡糖處理2h后細胞培養液中LDH漏出率。
【具體實施方式】
[0016]一種抗凍性K-卡拉膠寡糖的制備方法，其特征在于:
(I)種子液制備:將N5-3 (Cellulophaga lytica strain)菌種接種于液體培養基中，培養條件為30°C，150rpm，培養時間為20h ;所述的液體培養基組成為:k_卡拉膠:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陳海水適量。
[0017](2)粗酶液的制備:按2%的接種量接種種子液于發酵液中，12h發酵完成后將發酵液在4°C條件下，5000r/min離心30min，所得上清液為粗酶液；所述的發酵液的培養基成分:k-卡拉膠:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陳海水適量。
[0018](3) k-卡拉膠寡糖粗品的制備:按照0.5%卡拉膠:粗酶液:蒸餾水=2:1:1的比例配制好后，置于培養條件為30°C，150rpm的搖床上發酵48h，4°C條件下5000r/min離心30min去掉未降解的卡拉膠，取上清液于70°C下旋轉蒸發濃縮，得到卡拉膠寡糖粗制品濃縮液。
[0019](4) k-卡拉膠寡糖粗制品的純化:按照所得卡拉膠寡糖濃縮液體積的1/5加入氯仿，隨后加入1/5氯仿體積的正丁醇混勻，160r/min震蕩30min,取出經過IOmin離心5000r/min，，取上清液重復上述操作兩次，對上清液在70°C下進行旋轉蒸發濃縮，置于通風處揮發8-10h，得到除去蛋白質的卡拉膠寡糖粗制品濃縮液；將所得的濃縮液裝入500截留分子量的透析袋透析除鹽，透析外液為蒸餾水，置于4°C透析，直到透析外液中加入AgNO3溶液后無白色沉淀產生為止，將透析液在70°C下進行旋轉蒸發濃縮，將所得濃縮液置于-20°C下冷凍24h后于冷凍真空干燥儀上干燥，最終得到較為純凈的卡拉膠寡糖粉末。
[0020]本發明通過作用于人正常肝細胞發現卡拉膠寡糖能夠顯著提高細胞的抗凍能力。
[0021]因此，本發明另一方面提供了能夠證明K-卡拉膠寡糖對細胞具有抗凍能力的方法，具體實施如下:UMTT:將處于對數生長期的人正常肝細胞以5 X IO4個/ml接種于96孔板中，每孔接種200ul，置于37°C，5%C02的培養箱中繼續培養24h，加入不同濃度的卡拉膠寡糖溶液(10、25、50、100、150,200, 250、300 ug/ml)，以不加寡糖的為對照組(0)，每組設6個平行樣,將96孔板放入4°C冰箱中24h，之后每孔加入20ul MTT,放培養箱中繼續培養4h，再將孔內液體吸出，加入150ul DMSO，用酶標儀于570nm下測每孔的OD值。發現加入卡拉膠寡糖組的OD值比對照組的OD值大，說明細胞活力提高，卡拉膠寡糖能提高低溫(4°C)下細胞的活力。
[0022]將處于對數生長期的人正常肝細胞以5X IO4個/ml接種于96孔板中，每孔接種200ul，置于37°C，5%C02的培養箱中繼續培養24h，加入不同濃度的卡拉膠寡糖溶液(10、25、50、100、150、200、250,300 ug/ml)，以不加寡糖的為對照組(0)，每組設6個平行樣，將96孔板放入_20°C冰箱中1.5h，1.5h后快速融化孔內液體，之后每孔加入20ul MTT,放培養箱中繼續培養4h，再將孔內液體吸出，加入150ul DMS0，用酶標儀于570nm下測每孔的OD值。發現加入卡拉膠寡糖組的OD值比對照組的OD值大，說明細胞活力提高，卡拉膠寡糖能提高低溫(_20°C)下細胞的活力。
[0023]將處于對數生長期的人正常肝細胞以5X IO4個/ml接種于96孔板中，每孔接種2 O O u I，置于3 7 °C，5 %C02的培養箱中繼續培養2 4h，加入不同濃度的卡拉膠寡糖溶液(10、25、50、100、150、200、250,300 ug/ml)(均含有 10%DMS0)，以不加寡糖的為對照組(10%DMS0),每組設6個平行樣，將96孔板放入_20°C冰箱中3h，3h后快速融化孔內液體，之后每孔加入20ul MTT，放培養箱中繼續培養4h，再將孔內液體吸出，加入150ul DMS0，用酶標儀于570nm下測每孔的OD值。發現加入卡拉膠寡糖組的OD值比對照組的OD值大，說明細胞活力提高，卡拉膠寡糖能提高低溫(_20°C)下細胞的活力。
[0024]2、細胞培養液中LDH漏出率的測定:將處于對數生長期的人正常肝細胞消化下來后以I X IO5個/ml接種于24孔板中，每孔接種Iml，置于37°C，5%C02的培養箱中繼續培養24h，加入不同濃度的卡拉`膠寡糖溶液(25、50、100、150、200 ug/ml),以不加寡糖的為對照組(0)，每組設三個平行樣，將培養板放入4°C冰箱中冷凍24h(或者-20°C冷凍2h后換為無血清培養基繼續培養24h)后，收集每孔的上清液，并做好標記，然后每孔中加入與上清液體積相等的細胞裂解液裂解細胞30min后，收集每孔裂解液對應上清液做好標記。放4°C備用。
[0025]比色法測定細胞培養液中乳酸脫氫酶(LDH)的漏出率:操作步驟如下:
【權利要求】
1.一種抗凍性K-卡拉膠寡糖的制備方法，其特征在于: (1)種子液制備:將N5-3iCellulophaga lytica strain)菌種接種于液體培養基中，培養條件為30°C，150rpm，培養時間為20h ； 其中，液體培養基組成為:k-卡拉膠:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陳海水適量； (2)粗酶液的制備:按2%的接種量接種種子液于發酵液中，12h發酵完成后將發酵液在4°C條件下，5000r/min離心30min,所得上清液為粗酶液； 其中，發酵液的培養基成分:k-卡拉膠:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陳海水適量； (3)k-卡拉膠寡糖粗品的制備:按照0.5%卡拉膠:粗酶液:蒸餾水=2:1:1的比例配制好后，置于培養條件為30°C, 150rpm的搖床上發酵48h, 4°C條件下5000r/min離心30min去掉未降解的卡拉膠，取上清液于70°C下旋轉蒸發濃縮，得到卡拉膠寡糖粗制品濃縮液； (4)k-卡拉膠寡糖粗制品的純化:按照所得卡拉膠寡糖濃縮液體積的1/5加入氯仿，隨后加入1/5氯仿體積的正丁醇混勻，160r/min震蕩30min,取出經過IOmin離心5000r/min,，取上清液重復上述操作兩次，對上清液在70°C下進行旋轉蒸發濃縮，置于通風處揮發8-10h，得到除去蛋白質的卡拉膠寡糖粗制品濃縮液；將所得的濃縮液裝入500截留分子量的透析袋透析除鹽，透析外液為蒸餾水，置于4°C透析，直到透析外液中加入AgNO3溶液后無白色沉淀產生為止，將透析液在70°C下進行旋轉蒸發濃縮，將所得濃縮液置于-20°C下冷凍24h后于冷凍真空干燥儀上干燥，最終得到卡拉膠寡糖粉末。
2.如權利要求1所述的K-卡拉膠寡糖其應用于細胞冷藏、凍存過程中的抗凍保護添加劑。
【文檔編號】C12P19/14GK103820512SQ201410040800
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月28日 優先權日:2014年1月28日
【發明者】吳海歌, 姚子昂, 張玉娟 申請人:大連大學