一種具有凝乳酶活性的發酵液提取物的制備方法及其產物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有凝乳酶活性的發酵液提取物的制備方法，包括以下步驟：利用小麥麩皮培養基培養類芽孢桿菌CGMCC?No.8333，15℃～40℃，震蕩培養18～120小時得到發酵液，將所得發酵液離心后取上清液即得。所得提取物的凝乳酶活力最高達到6469.72±280.65SU/mL，而且其蛋白酶水解活力僅為10.54±0.65U/mL，兩者之比高達613.82。利用該發酵液提取物可使液態奶在短時間內發生凝乳，而且對酪蛋白的非特異水解低。本發明公開的具有凝乳酶活性的發酵液提取物制備干酪的得率很高，該發酵液提取物在原制干酪生產加工產業中具有廣闊應用前景。
【專利說明】一種具有凝乳酶活性的發酵液提取物的制備方法及其產物
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種具有凝乳酶活性的發酵液提取物的制備方法及其產物和應用。
【背景技術】
[0002]凝乳是生產原制干酪的關鍵步驟，凝乳酶在此過程中發揮至關重要的作用，并直接關系到干酪的品質和得率。傳統干酪加工中所使用的凝乳酶(rennet)來源于未斷奶小牛的第四胃(皺胃)，主要由凝乳酶(chymosin)和胃蛋白酶(pepsin)組成。商業化的小牛皺胃凝乳酶其凝乳酶所占比重在50~95%。凝乳酶介導凝乳反應涉及兩個步驟:(1)酶解酪蛋白:凝乳酶(Chymosin，E.C.3.4.23.4)對κ-CN具有高度特異性，主要水解κ-CN中的Pheltl5-Metltl6的肽鍵，生成由106-109殘基氨基酸組成的κ -酪蛋白巨肽(κ-caseinmacropeptide)和由1_105殘基氨基酸組成的副κ -酪蛋白(para- κ -casein),凝乳酶也能夠水解a sl_CN、a s2-CN、β -CN ; (2)當足夠的κ -CN被水解時，副κ -酪蛋白發生聚集形成三維網狀凝膠，Ca2+促發酪蛋白膠束聚集，進而引起酪蛋白膠束失穩并形成干酪凝塊。
[0003]干酪加工中使用的凝乳酶的早在50多年前凝乳酶的需求已超過其產量，與此同時自1961年以來，世界干酪產量大約增加了 3.5倍，小牛皺胃凝乳酶供應量確呈下降趨勢，目前，世界小牛皺胃凝乳酶的僅能滿足世界干酪產量所需凝乳酶的20~30%。小牛皺胃凝乳酶的供需矛盾和價格高昂、宗教(伊斯蘭教和猶太教)、飲食(素食主義)以及食品法規等因素，使得尋求其替代物成為乳品領域科學研究的熱點之一，尋求小牛皺胃凝乳酶替代物的研究主要動物、植物、基因重組以及微生物四個方面開展。動物和植物來源的凝乳酶主要用于特定種類的干酪，其來源和產量同樣受到限制；利用基因重組技術制備的凝乳酶具有成分單一等優點，但是，一些國家如法國、德國和荷蘭禁止使用重組凝乳酶。
[0004]微生物能夠產生許多種酶類，其中絕大部分`分泌量很小并涉及細胞代謝過程，胞外酶能夠消化不溶的纖維素、淀粉和蛋白質大分子物質，并轉移至胞內作為細胞生長的營養物質。許多微生物，尤其是霉菌和細菌來源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相似的性質，與植物和動物來源凝乳酶(MCEs)相比較，微生物來源的凝乳酶(MCEs)具有生產成本低、具有更加廣泛的生化多樣性以及基因改造方法簡便等優點。微生物來源凝乳酶可分為兩類:(a)來源于曲霉(Aspergillus spp.)和根霉菌(Rhizopus spp.)的類胃蛋白酶(pepsin-like) ； (b)來源于毛霉菌(Mucorspp.)、根霉菌(Rhizomucorspp.)和板栗疫病菌(Endothiaparasitica)的類凝乳酶(rennin-like)。目前，米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)和板栗疫病菌(Endotiaparasitica)三種來源的凝乳酶已用于大規模商業化生產中，已占到了全球蛋白酶市場的33%。然而，近年來微生物凝乳酶研究主要集中在芽胞桿菌屬(Bacillus)，所得蛋白酶通常具有較高的蛋白酶水解活力，并具有耐熱性較強、不易滅活，導致蛋白質降解并轉化為乳清，因此，對干酪得率具有負面作用，只有部分適合于干酪生產。因此盡管部分微生物凝乳酶已產業化，篩選新型產凝乳酶的微生物菌種仍是該領域的重要研究工作。
【發明內容】

[0005]因此，本發明要解決的技術問題就是針對目前存在的凝乳酶來源和產量嚴重不足的技術問題，提供了一種具有凝乳酶活性的發酵液提取物的制備方法及其產物和應用。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一是:一種具有凝乳酶活性的發酵液提取物的制備方法，其所述制備方法包括以下步驟:利用小麥麩皮培養基培養類芽孢桿菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC N0.8333,15°C~4CTC,震蕩培養 18 ~120小時得到發酵液，將所得發酵液離心后取上清液即得。
[0007]本發明所述小麥麩皮培養基包括小麥麩皮和水。其中所述的小麥麩皮為本領域常規的小麥麩皮，所述小麥麩皮的來源較佳地包括:山東、河南和江蘇，優選的來源為山東。
[0008]本發明所述小麥麩皮培養基中小麥麩皮的含量較佳地為1%~14%，更佳地為1%~10%，最佳地為3%，所述百分比為質量百分比。本發明所述菌株類芽孢桿菌CGMCC N0.8333的接種量較佳地為I~9%，更佳地為3%~7%，最佳地為5%，所述百分比為體積百分比。其中所述培養溫度較佳地為20°C~40°C，更佳地為25°C~35°C，最佳地為30°C ;所述震蕩速度較佳地為140~300r/min，更佳地為200~300r/min，最佳地為300r/min，所述培養的時間較佳地為18~120小時，更佳地為20~48小時，最佳地為20小時，其中所述離心的速度較佳地為9000~14000r/min。
[0009]本發明所述小麥麩皮培養基包含的營養成分較佳地為:蛋白質:18.6%,脂肪:
6.20%，總碳水化合物:63.9%，水分:7.89%，灰分:3.38%，所述百分比為質量百分比。
[0010]本發明所述具有凝乳酶活性的發酵液提取物的制備方法較佳地還包括菌種活化的步驟。所述菌種活化步驟包括:將本發明所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333接種在TYC培養基中，25°C~35°C培養18~48·小時作為種子；將活化好的菌種按I~9%的接種量接種于盛有1%~14%的小麥麩皮培養基的250mL錐形瓶中震蕩培養，250mL錐形瓶裝液量為20mL~IOOmL,搖床轉速為140~300r/min，培養溫度為20°C~40°C，培養時間為18~120小時，其中所述百分比為質量百分比。
[0011]其中所述菌株類芽孢桿菌CGMCC N0.8333接種量更佳地為I~5%，最佳地為3%，所述百分比為體積百分比；小麥麩皮培養基中的小麥麩皮含量較佳地為1%~14%，更佳地為1%~10%，最佳地為3%，所述百分比為質量百分比；250mL錐形瓶中裝液量較佳地為2OmL~IOOmL,更佳地為25mL~75mL，最佳地為30mL ;震蕩培養的震蕩速度較佳地為140~300r/min，最佳地為300r/min ;培養溫度較佳地為25°C~35°C，最佳地為30°C ;活化時間較佳地為18~48小時，更佳地為18~24小時，最佳地為18小時。
[0012]本發明所述具有凝乳酶活性的發酵液提取物的制備方法較佳地還包括將所得上清液經過精制干燥的步驟，所述精制干燥步驟為本領域常規的真空冷凍干燥步驟，所述真空冷凍干燥的溫度較佳地為_44°C~_40°C，優選地為_40°C。
[0013]本發明所述TYC培養基為本領域常規的TYC培養基，所述TYC培養基的配方及制備方法較佳地為:酪蛋白胨或胰蛋白胨15g，蔗糖50g，酵母膏5.0g, L-胱氨酸0.2g，乙酸鈉20g, Na2SO40.lg，NaCllg，Na2HPO4.12H202g，NaHC032g，瓊月旨 15_20g，加水至 lL,pH7.3,121°C滅菌15分鐘即得，上述原料的制備方法均為本領域常規制備方法，或者通過市售可得。
[0014]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之二是:如本發明所述制備方法所得的具有凝乳酶活性的發酵液提取物。本發明制備所得具有凝乳酶活性的發酵液提取物的凝乳酶活力比普通的微生物來源發酵液提取物的凝乳酶活力更高。
[0015]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之三為:本發明所述具有凝乳酶活性的發酵液提取物在制備凝乳酶中的應用。
[0016]本發明所述凝乳酶的制備方法為本領域常規的制備方法，只要以本發明所得具有凝乳酶活性的發酵液提取物為原料進行制備即得。
[0017]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之四為:本發明所述具有凝乳酶活性的發酵液提取物在制備發酵乳制品中的應用。
[0018]本發明所述發酵乳制品為本領域常規發酵乳制品，較佳地包括發酵乳，乳酸菌飲料，酸乳粉，發酵乳酪，更佳地為發酵乳酪，優選地為干酪。
[0019]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0020]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0021]本發明的積極進步效果在于:本發明所得具有凝乳酶活性的發酵液提取物的凝乳酶活力高達6469.72 ± 280.65SU/mL,并且所得發酵液提取物的蛋白酶水解活力僅為10.54±0.65~1^，二者之比高達613.82。本發明提供的具有凝乳酶活性的發酵液提取物能夠使液態奶在短時間內發生凝乳，并且所得發酵液提取物對酪蛋白的非特異水解活性極低，因此所述具有凝乳酶活性的發酵液提取物在原制干酪生產加工方面具有廣闊的應用前
旦
-5^ O`[0022]生物材料保藏信息
[0023]本發明的類芽孢桿菌BD3526，已于2013年10月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編:100101。該菌株的保藏編號為=CGMCC N0.8333。該菌株的分類命名是類芽孢桿菌Paenibacillus sp.，培養物名稱為BD3526。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]以下結合【專利附圖】

【附圖說明】本發明的特征和有益效果。
[0025]圖1為本發明所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333在TYC平板上的菌落圖。
[0026]圖2顯示本發明類芽孢桿菌CGMCC N0.8333的16S rRNA系統發育進化樹。
[0027]圖3為本發明所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333麩皮發酵上清凝乳形態圖。
【具體實施方式】
[0028]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。本發明中所述的室溫是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。
[0029]Paenibacillus hunanensis FeL05T (ACCC10718T=CGMCC N0.1.8907τ)與Paenibacillus polymyxa ATCC842T (CGMCC N0.1.4261T)購買自自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編:100101)。
[0030]實施例1菌株BD3526的初篩[0031]從西藏自治區當雄縣采集牦牛奶，以無菌方式取1ml，用無菌生理鹽水系列稀釋，通過涂布的方式將稀釋液均勻涂布于固體TYC培養基上(所述TYC培養基的組分為:酪蛋白胨或胰蛋白胨15g,鹿糖50g，酵母膏5.0g, L-胱氨酸0.2g,乙酸鈉20g,Na2SO40.lg,NaCllg,Na2HPO4.12H202g, NaHC032g，瓊脂15_20g，加水至1L，pH7.3，將上述組分溶解在蒸餾水中，121°C滅菌15分鐘即得)，30°C培養24-48小時。選取粘鼻涕狀、具有良好拉絲性的單菌落多個，分別轉接到新的固體TYC培養基上，得到純化的菌落。
[0032]實施例2菌株BD3526的獲得及其特征
[0033]Biolog微生物自動檢測儀(生產廠商:Biolog公司)鑒定實驗:
[0034]Biolog微生物自動檢測儀(生產廠商=Biolog公司)鑒定實驗,是Biolog公司獨創的碳源利用方法，利用微生物對不同碳源進行呼吸代謝的差異，篩選95種不同碳源或其他化學物質，配合顯色物質，固定于96孔板上(Al孔為陰性對照)。接種菌懸液培養一定時間，通過檢測微生物細胞利用不同碳源進行呼吸代謝過程中產生的化學還原物質欲顯色物質發生反應導致的吸光度以及由于微生物生長造成的濁度，生成特征指紋圖譜，與標準菌株圖譜數據庫進行比對，即可得到最終鑒定結果。
[0035]I)取如上所述實施例1中的單菌落多個，分別接種到液體TYC中，30°C培養24h。
[0036]2)在10000r/min下離心20min,棄去上清液,加ImL生理鹽水,在振蕩器上振動5min使之混勻；再于10000r/min下離心20min,重復2次,除去其中的碳源；棄去上清液,加ImL生理鹽水,在振蕩器上振動5min使之混勻，于2000r/min下離心lmin。
[0037]3)取上清液倒入裝有20mL已滅菌生理鹽水(NaCl，0.85%)的試管中，并使其OD59tl 維持在 0.13 ±0.02。
[0038]4)將如上所述稀 釋液加入Biolog ECO微平板中(150 μ L /孔)，然后在20°C下培養，每隔12h用Biolog細菌自動讀數儀讀取數據，連續測定2d。結果如表1所示。
[0039]表1菌株BD3526的Biolog鑒定結果
[0040]
【權利要求】
1.一種具有凝乳酶活性的發酵液提取物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟:利用小麥麩皮培養基培養類芽孢桿菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC N0.8333，15°C~40°C，震蕩培養18~120小時得到發酵液，將所得發酵液離心后取上清液即得。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述小麥麩皮培養基的組分包括小麥麩皮和水，其中小麥麩皮的含量為1%~14%，所述百分比為質量百分比。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述小麥麩皮培養基中小麥麩皮的質量百分比含量為1%~10%，所述震蕩培養的震蕩速度為140r/min~300r/min，震蕩培養的時間為20小時~48小時。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述離心的溫度為(TC~4°C，離心速度為 9000r/min ~14000r/min。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括菌種活化步驟，所述菌種活化步驟為:將所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333接種在TYC培養基中，25°C~35°C活化培養18~48小時作為種子使用；將活化好的菌種按體積百分比I~9%的接種量，接種于包含質量百分比為1%~14%小麥麩皮的小麥麩皮培養基中震蕩培養。
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，活化培養的時間為18小時~48小時，所述震蕩培養的震蕩速度為140~300r/min，震蕩培養的溫度為25°C~35°C ;震蕩培養的時間為18小時~120小時。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括將所得上清液經過精制干燥的步驟，所述精制干燥步驟為真空冷凍干燥，真空冷凍干燥的溫度為-44°C~-40°C。`
8.如權利要求1~7任一項所述制備方法所得的具有凝乳酶活性的發酵液提取物。
9.如權利要求8所述的具有凝乳酶活性的發酵液提取物在制備凝乳酶中的應用。
10.如權利要求8所述的具有凝乳酶活性的發酵液提取物在制備發酵乳制品中的應用，其中所述發酵乳制品為干酪。
【文檔編號】C12N1/20GK103865842SQ201410040762
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月27日 優先權日:2014年1月27日
【發明者】杭鋒, 郭本恒, 劉振民, 陳衛, 王欽博, 宋馨, 吳正鈞, 張灝, 朱軍偉 申請人:光明乳業股份有限公司