一株莎車芽孢桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種莎車芽孢桿菌BacillusshacheensisHNA-14T（=KCTC33145=DSM26902=CICC10559）。通過從新疆莎車縣鹽堿土分離、篩選、生理生化鑒定等工作，確定該菌株為短桿狀革蘭氏陽性菌，嚴格好氧，產芽孢，具有運動性，細胞大小為0.5-0.8×1.0-1.5μm，菌落呈黃色。NaCl耐受范圍為3%-20%（最佳鹽濃度為7%-15%），pH生長范圍為6.5-10.0（最佳pH范圍為7.5-8.0），溫度生長范圍為5-40℃（最佳生長溫度為25-30℃）。本發明的新疆莎車嗜鹽菌BacillusshacheensisHNA-14T（=KCTC33145=DSM26902=CICC10559）能有效分解明膠和淀粉，具有Esterase（C4）、Esteraselipase（C8）、Valinearylamidase、Acidphosphatase和Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase酶活性，同時該菌株具有較高的鹽濃度適應性，能在較高的鹽濃度下生存，該中度嗜鹽菌可廣泛地應用在次級代謝產物高鹽濃度下的生產。
KCTC 33145
2013.03.26

CICC 10559
2012.11.28
【專利說明】一株莎車芽孢桿菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物菌種及其應用領域，具體地說本發明涉及一種芽孢桿菌及其應 用的【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 中度嗜鹽菌并非分類學上的專業名詞，而是對一類最佳耐鹽濃度在3%_15%的極 端微生物的統稱。它廣泛分布在各類高鹽環境中，如海洋、鹽湖、鹽堿地、鹽池這些自然環境 及很多發酵食品中都能被發現。
[0003] 中度嗜鹽菌因其獨特的生長環境與耐鹽機制，從而具有很多顯著的特點：（1)可 在較高的鹽濃度下生長，降低發酵過程中染菌風險；(2)不需要較為復雜的營養條件，碳氮 源利用范圍廣泛；（3)生理生化特性多樣，潛在應用價值巨大。
[0004] 近些年來，隨著中度嗜鹽菌研究的不斷深入，越來越多的新種被發現，人們對它們 所表現出來的潛在應用價值興奮不已。現今，中度嗜鹽菌的應用研究主要集中在以下幾個 方面： (1)食品工業上的應用。傳統的食品發酵工業中，嗜鹽微生物的應用由來已久，如食品 調味醬就是通過將小麥、谷子和大豆等農作物密封浸泡在19%左右的NaCl溶液中，經發酵 9-10個月而成。科學家們發現，在此過程中，有一蝸筆％ Tetragenococcus halophilus飽 中度嗜鹽菌起到了主要的發酵推動與承擔作用，其高達108 CFU/mL的培養基細胞濃度不僅 能抑制其他細菌生長，還能保證在混合氨基酸缺乏的環境下醬的風味濃郁不散而且美味可 口。在韓國，人們經常喜歡將海產品進行腌制，而這過程中起到主要作用的菌株也是一類中 度嗜鹽菌，名為許多中度嗜鹽菌的菌落也十分好看，多呈橙色或 粉紅色，而其中的有益品種亦被用來生產天然食品添加劑。
[0005] (2)酶制劑生產上的應用。工業生產通常需要滿足很多特殊的物化條件，然而卻 常常難以與酶反應所需的最佳條件相匹配，這就對酶的適應條件提供了更高的要求。中度 嗜鹽菌產生的酶恰恰具有廣泛的鹽度、溫度耐受范圍，還有容易純化的優點，故而受到廣泛 關注，有著良好的商業應用前景。
[0006] (3)基因工程和化妝品領域的應用。在高鹽環境下，中度嗜鹽菌常常可以積累許 多相容性物質，如海藻糖，四氫嘧啶，甜菜堿，脯氨酸，羥基四氫嘧啶等。因其具有良好的滲 透保護功能，受到分子基因工程與化妝品領域的廣泛關注。其中，四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶 是一種被稱為分子伴侶的穩定劑，它們具有在極端環境如高鹽、高溫、干燥或低溫下穩定和 保護生物大分子酶、DNA的作用。同時它們還具有防止皮膚干燥，減緩皮膚衰老的作用，是 一種很好的化妝品保濕劑。
[0007] (4)多聚體生產方面的應用。石油沉積后往往會形成較高的鹽濃度，一般的表面 活性劑與生物乳化劑常常難以適應，這為石油的回收利用增加了難度。中度嗜鹽菌形成的 胞外多聚體無疑具有顯著優勢。
[0008] (5)環保方面上的應用。現代工業污水中含有很多難以處理的化學物質如高鹽離 子和有毒有機物等，用傳統生物方法常常收效甚微。而有些中度嗜鹽菌由于其強大的適應 能力及獨特的生理生化特性，在很高鹽濃度中就能夠完成對甲醛、有機磷、芳烴如苯酚等有 毒物質的降解且綠色環保，在處理環境污染方面日益受到人們關注。
[0009] (6)其他方面的應用。除了以上方面的應用，中度嗜鹽菌在其他很多方面依然表 現出很好的應用前景。如抗生素等活性物質的生產，新型酶如限制性內切酶等的提取，以及 乳化劑的合成等方面都有廣泛的用途。


【發明內容】

[0010] 針對國內外有關嗜鹽芽孢桿菌的研究現狀，本發明提供一種新的嗜鹽芽孢桿菌及 其應用，所述的嗜鹽芽孢桿菌堿性磷酸酶陰性、纈氨酸芳基酰胺酶陽性β-葡萄糖醛酸酶 陰性，同時與該屬所有其他菌株16S rDNA最高相似度分布在95. 655%至96. 348% (NCBI)， 這些特征明顯區別于已公開報道的嗜鹽芽孢桿菌有效種。
[0011] 本發明具體提供一種莎車芽孢桿菌(ifeciBiAS )。
[0012] 本發明通過以不同的溫度、PH值、鹽濃度和培養基為富集條件，從新疆莎車 鹽湖中取樣，分離純化培養到多株菌，經過多級篩選確定一株嗜鹽芽孢桿菌 sAacAeeflsis HNA- 14τ)，命名為莎車芽孢桿菌該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微 生物國際保藏單位：韓國典型菌種保藏單位（KCTC)，保藏時間為2013年3月26日，保藏 號分別是KCTC 33145, KCTC地址為韓國大田市儒城區韓國生物科學和技術研究所，郵編 是305-806,經微生物多相分類鑒定為莎車芽孢桿菌(ifeci77i/5· 該菌為好 氧菌，革蘭氏陽性，運動性，呈短桿狀，大小范圍為〇. 5 - 0. 8X 1. 0 - 1. 5 μ m，端生孢子，孢 子囊些微腫脹，菌落呈黃色，形狀呈圓形規則，邊緣光滑。NaCl耐受范圍為3%-20%(最佳 鹽濃度為7%-15%)，pH生長范圍為6. 5-10. 0(最佳pH范圍為7.5-8. 0)，溫度生長范圍為 5-40°C (最佳生長溫度為25-30°C)。氧化酶和過氧化氫酶陽性，不具有硝酸還原能力，可 以水解淀粉和明膠，不能水解吐溫-80和纖維素。其生長過程中不產生H2S和吲哚，M.R.和 V.P.實驗陰性。能利用碳源：D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二 糖、水蘇糖、四唑紫、D-蜜三糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-水楊苷、D-山梨醇、 D-阿拉伯醇、肌醇、果膠、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡羅酰胺、L-乳酸、D-蘋果酸、L-蘋 果酸、氧化鋰、吐溫-40、α-羥基丁酸、α-羥基丁酸、β-羥基丁酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、 丁酸鈉和溴酸鈉；不能利用碳源：糊精、萬古霉素、四唑藍、D-蜜二糖、Ν-乙酰-D-氨基葡萄 糖、Ν-乙酰-β -D-甘露糖胺、Ν-乙酰-D-半乳糖胺、Ν-乙酰-神經氨酸、a -D-葡萄糖、 D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-匍萄糖、D-巖澡糖、L-巖澡糖、L-鼠李糖肌苷、 1%乳酸鈉、梭鏈孢酸、D-絲氨酸、D-甘露醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、 D-天門冬氨酸、D-絲氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素、二甲胺四環素、明膠、氨基乙酰-L-脯氨 酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天門冬氨酸、L-左旋谷氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨 酸、林可霉素、鹽酸胍、硫酸四癸鈉、D-半乳糖醛酸L-半乳糖酸內酯、粘酸、奎尼酸、D-葡糖 二酸、Ρ-羥基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、D-乳酸、甲酯、L-乳酸檸檬酸、α -氧代戊二酸、溴代 丁二酸、萘啶酮酸、亞碲酸鉀、Υ -氨基丁酸、α -氧代丁酸、甲酸和氨曲南。細胞主要脂肪酸 為anteis〇-C15:0和is 〇-C15:0,主要醌類型為ΜΚ-7,細胞壁肽聚糖類型主要為內消旋二氨 基庚二酸（meso-DAP)，主要極性脂為雙磷脂酰甘油（DPG)，磷脂酰乙醇胺（PE)，磷脂酰肌醇 (PI)。DNA(G+C)含量為 48. 6 mol%。
[0013] 該莎車芽孢桿菌你 ciBws sAacAeeesis HNA-14T(=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)的酶學特性采用API ZYM系統檢測，碳源利用情況采用Biolog全自動細菌鑒定系 統，主要脂肪酸類型及含量參考《放線菌系統學》，并采用氣質聯用分析，極性脂類型分析參 考《放線菌系統學》，呼吸醌組分以及G+Cmol%均采用高效液相（HPLC)來分析。
[0014] 本發明通過提取總得DNA、16S rDNA基因的擴增和測序，根據測序結果，在NCBI上 用Blast進行比對分析，整理出相似度較高的相關菌株的16S rDNA序列，Clustal XI. 83 進行多序列匹配排列后，通過MEGA5. 0程序中的鄰接法（Neighbor-Joining)和最大似然法 (Maximum-Likelihood)構建系統發育樹。
[0015] 經測定莎車芽孢桿菌sAacAeeesis HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)的 16S rRNA 序列長 1570bp，如下：TCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACG CTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACCAAAGGGAGCTTGCTCCCGGAGGTTAGCGGCGGACGGGTGA GTACCACGTGGGCAACCTGCCCCATGGACAGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAAGACCGACCTT CGCCTGGAGGTTGGTTGAAAGATGGCCTTTAAGGCTATCACCAAGGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTA AGGTAAAGGCTTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAATGCCGCGTGAGTGA GGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGCGAGGGAAGAAGCAAGTACCGGTGGATAACGCCGGTACCCTGACGGT ACCTCGCCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTA TTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCTGATGTGAAATCTTGGGGCTCAACCCCGAGCGGCCATTGGA AACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAAC ACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGTTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATGCCCGTAGTGCCGAAGTCAACACAT TAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAG CATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACCCTGGAGACAGGGCTT CCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTAATCTTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGA AGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGGGT AGCGAAGCCGTGAGGTGAAGCCAATCCCAGAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAA GCCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACA CCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGG GTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTAAGCTTGGTACCCGGGAATCTCTA 從基于16S rDNA基因構建的系統發育樹可以明顯地看出莎車芽孢桿菌 HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)與三株芽孢桿菌屬的 模式菌株聚為一支，與最親近的三個模式菌株你 ciBm chmii KSM-K16T、 DSM 8716τ、Α<3α7ΛΛ5 SC-N012M3相似度分別為96·348%、95·951% 和95. 883%，均低于常用來劃定新種的相似度閾值97%。基于對莎車芽孢桿菌 HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)的表型、生理生化、基因 型的分析，初步確定莎車芽孢桿菌sAacAeeesis HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)為芽孢桿菌屬的一個新種。
[0016] 基于新疆莎車嗜鹽菌能有效分解淀粉，具有 Esterase (C4)、Esterase lipase (C8)、Valinearylamidase、Acid phosphatase 和 Naphthol-AS-Bl-phosphohydrolase酶活性，有較高的鹽濃度適應性，能使明膠液化和牛奶 胨化等特性，本發明提供的莎車芽孢桿菌iacAeeasis HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)能廣泛的應用于食品工業、酶制劑和基因工程等領域。
[0017] 將該菌種的種子液以5%的接種量接種到15%鹽濃度TSB培養基中，37°C、200rpm 條件下發酵培養3天，12000rpm離心去除雜質和菌體，1°C下65%硫酸銨鹽析，12000rpm離 心后收集沉淀，1°C 25mM Tris-HCl重新溶解后，在含有5mM Ca2+、mM Tris-HCl中1°C條件 下透析10小時，結束后12000rpm離心去雜質，上清液即為淀粉酶。
[0018] 通過實施本發明具體的技術指標，可達到以下效果。
[0019] 本發明的莎車芽孢桿菌feci/AAS· 能用于高鹽濃度條件下發酵生產 淀粉酶、明膠酶，同時能應用在 Esterase (C4)、Esterase lipase (C8)、Valinearylamidase、 Acid phosphatase 和 Naphthol-AS-Bl-phosphohydrolase 相關領域。

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1是掃描電子顯微鏡10000倍下觀察到的菌株HNA-14的形貌。圖2是采用鄰接法 構建菌株HNA-14與相關分類的16S rRNA基因序列系統發育樹；Bar表示每單位核苷酸替 換數為〇. 01。

【具體實施方式】
[0020] 實施例一：莎車芽孢桿菌的篩選與分離 樣品采集與菌株篩選分離 樣品采集于新疆維吾爾族自治區莎車縣。樣品來自多個區域，分布于東經 76° Γ 57"至77° 46' 30"、北緯37° 27' 30"至39° 15"之間。用無菌玻璃瓶收 取距表層5-lOcm 土壤，經風干，研磨，過篩，置于4°C保存，用于后續分離。篩選培養基選用 苯酚富集培養基（PT)，腐殖酸富集培養基（HVA)，鑰酸鈉富集培養基（HNA)和高鹽富集培養 基（YCSS)，純化培養基選用胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB+10% NaCl)，通過接種不同的富 集培養基對菌株進行篩選。將lg 土樣加入裝有25ml液體培養基的搖瓶中，在28°C下振蕩 培養7天。然后用移液槍吸取富集液，作10倍梯度稀釋，取200 μ 1 ΚΓ^ΚΓ4倍數稀釋液分 別涂布到對應培養基平板上，置于28°C下繼續培養一周。觀察生長狀況與形態特征，將長出 的菌落轉接至TSB固體培養基，經多次劃線，再挑取單菌落轉接至TSB斜面培養基，置于4°C 作短期保藏。同時取新鮮菌液混合25%濃度甘油，置于-80°C作長期保藏。（所有培養基配 方見下表） 苯酚富集培養基（PT):酪蛋白胨7. 5g，氯化鈉100g，酵母浸出物10g，苯酚690μ1，MS 混合液 1 unit，無菌水 1000ml，ρΗ8· 2-8. 5。
[0021] 腐殖酸富集培養基（HVA):腐殖酸lg，氯化鈉150g，MS混合液1 unit，無菌水 1000ml，pH8. 2-8. 5。
[0022] 鉬酸鈉富集培養基（HNA):酪蛋白胨7.5g，氯化鈉150g，酵母浸出物10g，MS混合 液 1 unit，無菌水 1000ml，pH8. 2-8. 5。
[0023] 高鹽富集培養基（YCSS):酪蛋白胨7. 5g，氯化鈉250g，酵母浸出物10g，MS混合 液 1 unit，無菌水 1000ml，ρΗ8· 2-8. 5。
[0024] MS混合液：濃度為0. 05g/L相容性物質（甜菜堿，脯氨酸，甘氨酸，D-山梨醇，谷氨 酸鹽）混合液1. 5ml ;濃度為0. 05g/L氨基酸(天冬氨酸，組氨酸，賴氨酸，蛋氨酸，纈氨酸， 亮氨酸，酪氨酸，谷氨酸）混合液15ml ;濃度為0. 025mg/L維生素（VB1，VB2, VB12, VB6, VH， VM，VPP)混合液 0. 25ml。
[0025] 胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB+10% NaCl):胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g， NaCllOOg，瓊脂粉 18g，蒸餾水 1000ml，ρΗ8· 0-8. 2。
[0026] 菌種描述： 本發明所述的莎車芽孢桿菌為好氧菌，革蘭氏陽性，運動性，呈短桿狀，大小范圍為 0. 5 - 0. 8Χ 1. 0 - 1. 5 μ m，端生孢子，孢子囊些微腫脹，菌落呈黃色，形狀呈圓形規則，邊 緣光滑。NaCl耐受范圍為3%-20%(最佳鹽濃度為7%-15%)，pH生長范圍為6. 5-10. 0 (最 佳pH范圍為7. 5-8.0)，溫度生長范圍為5-40°C (最佳生長溫度為25-30°C)。氧化酶 和過氧化氫酶陽性，不具有硝酸還原能力，可以水解淀粉和明膠，不能水解吐溫-80和 纖維素。其生長過程中不產生H2S和吲哚，M.R.和V.P.實驗陰性。細胞主要脂肪酸為 anteis〇-C15:0和is〇-C15:0,主要醌類型為MK-7,細胞壁肽聚糖類型主要為內消旋二氨基 庚二酸（meso-DAP)，主要極性脂為雙磷脂酰甘油（DPG)，磷脂酰乙醇胺（PE)，磷脂酰肌醇 (PI)。
[0027] 實施例二：莎車芽孢桿菌HNA-14T=CICC 10559表性特征 通過BI0L0G GEN皿MicroStation自動微生物鑒定系統，得到HNA-14碳源利用情況 如下表所示。其中HNA-14的參比菌株為chMii DSM 8716τ 能利用碳源：D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、 四唑紫、D-蜜三糖、a -D-乳糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-水楊苷、D-山梨醇、D-阿拉伯 醇、肌醇、果膠、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡羅酰胺、L-乳酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸、氧化 鋰、吐溫-40、α-羥基丁酸、α-羥基丁酸、β-羥基丁酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、丁酸鈉和 溴酸鈉；不能利用碳源：糊精、萬古霉素、四唑藍、D-蜜二糖、Ν-乙酰-D-氨基葡萄糖、Ν-乙 酰-β -D-甘露糖胺、Ν-乙酰-D-半乳糖胺、Ν-乙酰-神經氨酸、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、 D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-葡萄糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖肌苷、1%乳酸鈉、梭 鏈孢酸、D-絲氨酸、D-甘露醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-天門冬氨 酸、D-絲氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素、二甲胺四環素、明膠、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨 酸、L-精氨酸、L-天門冬氨酸、L-左旋谷氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、林可霉 素、鹽酸胍、硫酸四癸鈉、D-半乳糖醛酸L-半乳糖酸內酯、粘酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、ρ-羥 基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、D-乳酸、甲酯、L-乳酸檸檬酸、α -氧代戊二酸、溴代丁二酸、萘啶 酮酸、亞碲酸鉀、氨基丁酸、α-氧代丁酸、甲酸和氨曲南。
[0028] 實施例三：莎車芽孢桿菌HNA-14T=CICC 10559基因組的提取以及16S rDNA測序 采用SDS法提取細菌總DNA，通過PCR法擴增菌株16S rRNA基因序列，DNA測序由上 海生工生物工程技術服務有限公司完成。到GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)數 據庫將各菌株測得的16S rRNA基因部分序列提交注冊獲得序列號。再在NCBI (National Center for Biotechnology Information)上進行BLAST比對，找到親緣關系最近的菌 株。通過BioEdit將親緣性最近的相應菌株進行序列比對，然后在軟件MEGA 5. 0上分別使 用Neighbor-Joinin(N-J)法，最大似然法（ML法）構建系統進化樹，進化樹bootstrap為 1000。PCR相應引物、反應體系、條件如下：PCR 引物：PA8: 5'-CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3'，ΡΒ^ 5'-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' ；反應體系（25μ 1 體 系）：Mg2+ S.SyLPAJ.SyLPBJ.SyLdNTP 0·75μ1，Η20 14yl，Taq 酶 0·25μ1，反應 條件95°C預變性5min，94°C變性45s，50°C退火45s，延伸lmin，重復35個循環，72°C保溫 lOmin。構建的進化樹見圖2。
[0029] 實施例四：莎車芽孢桿菌HNA-14T=CICC 10559的應用 用試管配制明膠液化培養基，121°C滅菌20min，將菌株穿刺接種，在30°C恒溫箱 中靜置培養30天，分別在5,10,20,30天觀察記錄明膠液化程度。觀察前將試管冷卻 20-30min或用自來水沖洗30min，可以更清晰的觀察到液化程度。結果分析莎車芽孢桿菌 HNA-14T=CICC 10559可使明膠液化。
[0030] 實施例五：莎車芽孢桿菌HNA-14T=CICC 10559的應用 用試管配制牛奶凝固與胨化培養基，煮沸30min，然后置于高速離心機中3000r/min離 心30min，去除上清液，112°C，間歇滅菌30min 2-3次。接種待測菌株，在30°C恒溫箱中靜 置培養30天，分別在5, 10. 20, 30天觀察記錄牛奶凝固與胨化程度。結果分析，莎車芽孢桿 菌HNA-14T=CICC 10559使牛奶出現凝塊即為凝固，凝固后凝塊水解為液體，證明其可以使 牛奶胨化。
[0031] 實施例六：莎車芽孢桿菌HNA-14T=CICC 10559的應用 配制淀粉水解平板培養基，121°C下，滅菌20min，用點接法接種待測菌株，接種直徑不 宜超過5mm ;在30°C恒溫箱中靜置培養48h，觀察生長情況，待生長良好時，向菌落周圍滴加 碘液進行檢測，結果分析莎車芽孢桿菌HNA-14T=CICC 10559周圍出現透明暈圈且不變色， 證明其有水解淀粉的能力。
【權利要求】
1. 一株莎車芽孢桿菌（Bacillus shacheensis)HNA-14T (=KCTC 33145=DSM 26902=CICC 10559)。
2. 如權利要求1所述的莎車腰包桿菌（Bacillus shacheensis)HNA_14T (=KCTC 33145=DSM 26902=CICC 10559)，其特征在于細胞好氧，革蘭氏陽性，運動性，呈短桿狀， 大小范圍為0. 5 - 0. 8X 1. 0 - 1. 5 μ m，端生孢子，孢子囊些微腫脹，菌落呈黃色，形狀呈 圓形規則，邊緣光滑，NaCl耐受范圍為3%-20%(最佳鹽濃度為7%-15%)，pH生長范圍為 6. 5-10. 0 (最佳pH范圍為7. 5-8. 0)，溫度生長范圍為5-40°C (最佳生長溫度為25-30°C )， 氧化酶和過氧化氫酶陽性，不具有硝酸還原能力，可以水解淀粉和明膠，不能水解吐溫-80 和纖維素，其生長過程中不產生H 2S和吲哚，M.R.和V.P.實驗陰性，能利用碳源：D-麥芽糖、 D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、四唑紫、D-蜜三糖、α-D-乳 糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-水楊苷、D-山梨醇、D-阿拉伯醇、肌醇、果膠、D-葡萄糖酸、 D-葡萄糖醛酸、葡羅酰胺、L-乳酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸、氧化鋰、吐溫-40、α -羥基丁酸、 α -羥基丁酸、β -羥基丁酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、丁酸鈉和溴酸鈉；不能利用碳源：糊精、 萬古霉素、四唑藍、D-蜜二糖、Ν-乙酰-D-氨基葡萄糖、Ν-乙酰-β -D-甘露糖胺、Ν-乙 酰-D-半乳糖胺、Ν-乙酰-神經氨酸、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲 基-葡萄糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖肌苷、1%乳酸鈉、梭鏈孢酸、D-絲氨酸、D-甘露 醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-天門冬氨酸、D-絲氨酸、醋竹桃霉素、利 福霉素、二甲胺四環素、明膠、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天門冬氨酸、 L-左旋谷氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、林可霉素、鹽酸胍、硫酸四癸鈉、D-半乳 糖醛酸L-半乳糖酸內酯、粘酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、ρ-羥基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、D-乳 酸、甲酯、L-乳酸檸檬酸、α -氧代戊二酸、溴代丁二酸、萘啶酮酸、亞碲酸鉀、γ -氨基丁酸、 α -氧代丁酸、甲酸和氨曲南，細胞主要脂肪酸為anteiS〇-C15:(l和is〇-C 15:(l，主要醌類型為 MK-7,細胞壁肽聚糖類型主要為內消旋二氨基庚二酸（meso-DAP)，主要極性脂為雙磷脂酰 甘油（DPG)，磷脂酰乙醇胺（PE)，磷脂酰肌醇（PI)，DNA(G+C)含量為48. 6 mol%。
【文檔編號】C12N1/20GK104232503SQ201410160307
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】田永強, 劉波, 雷祖超 申請人:四川大學