一種RNAi干擾片段、RNAi干擾載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種用于干擾動物卵巢顆粒細胞中抑制素βA基因的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體。RNAi干擾載體具有所述RNAi干擾片段；所述RNAi片段的序列為TGCCC?TTGCT?TTGGC?TGAGA?GGATT或CATCG?GGACG?GAGGGCAGAA?ATGAA或GCTGC?ACTTT?GAGAT?TTCCC?AAGAA或CCATC?CGTCT?CTTTC?AACAGCAGAA。本發明提供的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體通過對綿羊卵巢顆粒細胞中抑制素基因進行沉默，間接影響發情相關激素和發情性狀，有效的促使綿羊發情，解決了綿羊非繁殖季節不發情、不產羔的繁殖問題。
【專利說明】—種RNAi干擾片段、RNAi干擾載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種用于調控綿羊發情與產羔相關性抑制素β A RNAi干擾片段、RNAi干擾載體及RNAi干擾載體的制備方法。
【背景技術】
[0002]新疆作為我國五大牧區之一，是擁有綿羊品種較多。綿羊季節性發情、排卵以及產羔的這種繁殖性狀導致了較長的世代間隔，使其利用率較低，是新疆綿羊工廠化，集約化養殖的主要難題之一。
[0003]現有研究主要是選擇與綿羊季節性生理變化密切相關的下丘腦-垂體-性腺軸上激素相關基因及卵巢內各種調節因子，如褪黑激素受體、抑制素基因、催乳素受體基因等進行相關性分析。為了進一步探討綿羊季節性繁殖性狀和發情性狀，篩選與綿羊發情性狀相關的調控基因，本發明在前期研究中采用抑制性消減雜交的方法，選擇常年發情的湖羊，季節性發情的中國美利奴羊，構建了湖羊和中國美利奴綿羊卵巢組織的消減cDNA文庫，成功篩選并確定抑制素βΑ為非季節繁殖的差異基因，本發明則是利用抑制素βΑ通過RNAi的方法探討該基因對發情性狀的影響。
[0004]RNA干擾是通過內源的或人工方法使小片段RNA在細胞內弓丨起與之同源互補mRNA的降解，并致使基因沉默的一種現象，最終阻止目的基因表達的有效手段之一。它以其序列特異性、高效性、選擇性和穩定性等優點，被廣泛應用與基因功能、疾病治療以及修復遺傳損傷等方面的研究。
[0005]抑制素是一種作用于下丘腦-垂體-性腺的重要調節激素，它的生理學作用就是選擇性的抑制垂體合成和分泌FSH，從而影響動物卵巢、卵泡的生長發育以及產仔數。自上世紀30年代左右，國內外研究者就利用各種方法對動物的多胎性狀進行研究，而抑制素這種即具有免疫原性，同時又與卵巢功能密切相關的基因也就順利的成為了學者的研究目標。Morris等研究表明，用抑制素主動免疫母牛，可顯著提高雙犢率。2006年，崔先利等用抑制素質粒免疫黃牛，結果發現免疫組成熟卵泡個數比未處理組個數多顯著多0.54個(P〈0.05)。免疫組誘發牛排雙卵率60.71%(51/84)，也顯著高于對照組13.75%(P〈0.05)。曹曉涵、王振華等采用新疆細毛羊抑制素成熟區序列重組融合蛋白免疫小鼠，結果顯示處理組產生了很高的抗抑制素抗體滴度，且極顯著的提高了 FSH的含量，促進了大鼠卵巢發育，增加了成熟以及優勢卵泡的數量。
[0006]國內外已有的研究證明，抑制素β A基因與動物的產仔數有顯著影響，而該基因在自分泌和旁分泌的形式來調節卵泡的生長發育以及排卵的同時也促進了動物卵巢的發育。本發明以抑制素β A基因作為候選基因，以RNAi技術為基礎，通過卵巢直接注射抑制素^ARNAi載體的方法，研究該基因對綿羊的發情性狀的影響。

【發明內容】

[0007]本發明的主要目的在于，提供一種用于干擾綿羊卵巢顆粒細胞中抑制素β A基因的RNAi干擾片段、RNAi干擾載體及其構建方法。本發明提供的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體可以使綿羊卵巢顆粒細胞中抑制素β A基因進行沉默，從而促進動物發情、繁殖，解決了綿羊非繁殖季節不發情、不產羔的繁殖問題。
[0008]本發明的目的及解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的。依據本發明提出的一種RNAi干擾片段，用于干擾動物卵巢顆粒細胞中的抑制素β A基因，所述RNAi干擾片段的序列為 TGCCC TTGCT TTGGC TGAGA GGATT 或 CATCG GGACG GAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGCACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCT CTTTC AACAG CAGAA。
[0009]進一步地，所述RNAi干擾片段作為制備干擾動物卵巢顆粒細胞中抑制素β A基因的藥物的應用。
[0010]本發明還提供一種用于干擾動物卵巢顆粒細胞中的抑制素β A基因，所述RNAi干擾載體具有RNAi干擾片段；所述RNAi干擾片段的序列為:TGCCCTTGCT TTGGC TGAGA GGATT或 CATCG GGACG GAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTTGAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCTCTTTC AACAG CAGAA。
[0011 ] 進一步地，所述RNAi干擾載體包括PLLU2G載體，所述PLLU2G載體與所述RNAi干擾片段連接。
[0012]進一步地，所述RNAi干擾載體在促進動物繁殖中的應用。
[0013]進一步地，所述RNAi干擾載體以卵巢直接注射、靜脈注射及肌肉注射中的一種方式注射至動物體內，用于促進動物繁殖。
[0014]本發明另一方 面還提供一種RNAi干擾載體的制備方法，該制備方法包括如下步驟:
[0015]步驟I，酶切PLLU2G載體；
[0016]步驟2，將RNAi干擾片段與酶切后的所述PLLU2G載體連接，得到連接產物；
[0017]其中，所述RNAi 干擾片段的序列為 TGCCC TTGCT TTGGC TGAGA GGATT 或 CATCGGGACG GAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCT CTTTCAACAG CAGAA ；
[0018]步驟3，將所述連接產物轉化至感受態細胞中，并篩選出陽性克隆菌液；
[0019]步驟4，送陽性克隆菌液進行測序鑒定，并將測序結果與所述RNAi干擾片段序列完全一致的菌液進行擴增；
[0020]步驟5，從所述擴增的菌液中提取RNAi干擾載體。
[0021 ] 進一步地，所述步驟3中的篩選方法為AMP抗性篩選和藍白斑篩選。
[0022]進一步地，所述步驟3還包括將所述陽性克隆菌液置于含抗的LB培養基中培養，并做菌落PCR鑒定。
[0023]借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點:
[0024]本發明提供的RNAi干擾片段以及RNAi干擾載體可以對綿羊卵巢顆粒細胞中的抑制素β A基因進行干擾，使其沉默；通過對抑制素β A基因的干擾，間接地影響綿羊發情相關激素和發情形狀的改變，在非繁殖季節有效的促進綿羊發情，從而解決了綿羊非繁殖季節不發情、不產羔的繁殖問題。
[0025]另外，本發明以卵巢直接注射的方式注射至綿羊卵巢，不會對綿羊的健康和卵巢功能產生影響，而且操作方便、簡單、快捷，成本低廉?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0026]圖1為PLLU2G載體的結構示意圖；
[0027]圖2為綿羊卵巢顆粒細胞在轉染RNAi干擾載體后在電子顯微鏡下的示意圖；
[0028]圖3為綿羊卵巢顆粒細胞在轉染RNAi干擾載體后在的熒光效果圖；
[0029]圖4分別為綿羊卵巢顆粒細胞中在轉染PLLU2G-shRNAl、PLLU2G_shRNA2、PLLU2G-shRNA3、PLLU2G_shRNA4后的抑制素β A基因mRNA表達量的示意圖；
[0030]圖5為干擾組以及對照組的綿羊在以卵巢直接注射的方式注射干擾載體后的血清中的INHBA水平的示意圖；
[0031]圖6為干擾組以及對照組的綿羊在以卵巢直接注射的方式注射干擾載體后的血清中的FSH水平的示意圖；
[0032]圖7為干擾組以及對照組的綿羊在以卵巢直接注射的方式注射干擾載體后的血清中的LH水平的示意圖；
[0033]圖8為干擾組以及對照組的綿羊在以卵巢直接注射的方式注射干擾載體后的血清中的E2A平的示意圖。
【具體實施方式】
[0034]為更進一步闡述本發明為達`成預定發明目的所采取的技術手段及功效，結合較佳實施例詳細說明如下。
[0035]實施例1
[0036]設計并合成用于干擾動物卵巢顆粒細胞中的抑制素β A基因的RNAi干擾片段。具體如下:
[0037]根據抑制素β A 基因(靶基因 INHBA (GenBank:NW_004080167.1))的 mRNA 序列設計RNAi干擾片段，并通過合成公司合成出四對shRNAi干擾片段。該四對RNAi干擾片段分別為shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4。該四對shRNAi干擾片段的序列以及用于干擾擾抑制素β A基因的mRNA序列的區域如表1所不。
[0038]表1
[0039]
【權利要求】
1.一種RNAi干擾片段，用于干擾動物卵巢顆粒細胞中的抑制素βΑ基因，其特征在于,所述 RNAi 干擾片段的序列為 TGCCC TTGCT TTGGC TGAGA GGATT 或 CATCG GGACG GAGGGCAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCT CTTTC AACAG CAGAA。
2.權利要求1所述的RNAi干擾片段作為制備干擾動物卵巢顆粒細胞中抑制素βΑ基因的藥物的應用。
3.—種RNAi干擾載體，用于干擾動物卵巢顆粒細胞中的抑制素βΑ基因，其特征在于，所述RNAi干擾載體具有RNAi干擾片段；所述RNAi干擾片段的序列為:TGCCC TTGCT TTGGCTGAGA GGATT 或 CATCG GGACG GAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或CCATC CGTCT CTTTC AACAG CAGAA。
4.根據權利要求3所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體包括PLLU2G載體，所述PLLU2G載體與所述RNAi干擾片段連接。
5.根據權利要求4所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體在促進動物繁殖中的應用。
6.根據權利要求5所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體以卵巢直接注射、靜脈注射及肌肉注射中的一種方式注射至動物體內，用于促進動物繁殖。
7.—種RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1，酶切PLLU2G載體； 步驟2，將RNAi干擾片段與酶切后的所述PLLU2G載體連接，得到連接產物； 其中，所述 RNAi 干擾片段的序列為 TGCCC TTGCT TTGGC TGAGA GGATT 或 CATCG GGACGGAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCT CTTTC AACAGCAGAA ； 步驟3，將所述連接產物轉化至感受態細胞中，并篩選出陽性克隆菌液； 步驟4，送陽性克隆菌液進行測序鑒定，并將測序結果與所述RNAi干擾片段序列完全一致的菌液進行擴增； 步驟5，從所述擴增的菌液中提取RNAi干擾載體。
8.根據權利要求7所述的RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，所述步驟3中的篩選方法為AMP抗性篩選和藍白斑篩選。
9.根據權利要求7所述 的RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，所述步驟3還包括將所述陽性克隆菌液置于含抗的LB培養基中培養，并做菌落PCR鑒定。
【文檔編號】C12N15/66GK103882024SQ201410160430
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】趙宗勝, 楊華, 賈斌, 陳寶麒, 林杉, 田占偉 申請人:石河子大學