利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法
【專利摘要】本發明屬于微生物發酵，特別是指一種利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法。在有氧及避光條件下，含有碳源、氮源及無機組分的無菌發酵培養基中培養血紅密孔菌(Pycnoporus?sanguineus)CGMCC?No.2932，發酵培養基中由玉米粉、麩皮粉、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、琥珀酸鈉、五水合硫酸銅、六水合氯化鉀、七水合硫酸鋅、表面活性劑、消泡劑及水組成，發酵過程中調解通風量并流加營養物質，本發明解決了現有技術存在的再現性差、酶活低等問題，具有方法再現性好，所產的漆酶酶活高，所產酶系較純，酶的溫度穩定性好，pH適應性能好等優點。該漆酶可廣泛應用于染料降解、生物漂白、木材膠合、生態修復等領域。
【專利說明】利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵，特別是指一種利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方 法。

【背景技術】
[0002] 漆酶是一種含銅多酚氧化酶，能催化酚類物質的氧化還原反應。漆酶具有底物非 特異性的特殊性能，對許多結構不同、難降解的高分子有機物質具有廣譜的降解能力，其 應用涉及造紙、紡織、木材加工、飲料食品、土壤修復和生物能源等多個領域。漆酶作為生物 催化劑，與物理的和化學的方法相比，其生物催化更具有高效率、低能耗的優點。
[0003] 當前，國內市場漆酶的主要來源是美國Sigma公司和丹麥諾維信公司，由于其價 格昂貴等原因嚴重制約了其在國內相關領域的應用。自然菌種中漆酶產量普遍較低，遠不 能滿足生產和研究的需要，能否獲得大量用于生產和研究的價格合理的漆酶制劑成為制約 漆酶應用的關鍵因素之一。
[0004] 中科院微生物研究所在專利號為200910083514. 7的發明專利中公開了"一種漆 酶及其制備方法與專用生產菌株"，該專利中利用血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus) CGMCCNo. 2932發酵制備的漆酶酶活可達到300u/ml，但公布的配方和工藝均為搖瓶發酵參 數，在發酵罐上放大培養的可再現性較差，因此，研究適用于規模化工業生產，且產酶活較 高的漆酶生產工藝是目前存在的主要技術難題。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法，采用該 方法所制備的漆酶適于工業化生產，且酶活較高。
[0006] 本發明的整體技術構思是：
[0007] 利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法，包括在有氧及避光條件下，含有碳 源、氮源及無機組分的無菌發酵培養基中培養血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus)CGMCC No. 2932,還包括如下步驟：
[0008] 發酵培養基采用如下質量份數的組分組成：
[0009] 玉米粉20-40,麩皮粉3-10,酒石酸銨1-5,磷酸二氫鉀1-1. 5,七水合硫酸鎂 0. 2-0. 2,琥珀酸鈉0. 8-1. 0,五水合硫酸銅0. 15-0. 25,六水合氯化鉀0. 01-0. 05,七水合硫 酸鋅0· 01-0. 04,表面活性劑0· 1-0. 5,消泡劑0· 01-0. 05,水1000, pH自然；
[0010] 發酵的條件是：
[0011]接種量為8%-10%，0-3天：通風比為1:0.3-0.4-111，溫度301：-321：;4-6天 ：通 風比為 1:0. 7-0. 9vvm，溫度 30°C -32°c ;7-9 天：通風比為 1:1. 0-1. 4vvm，溫度 30°C -32°c ; 10-11天：通風比為1:1. 0-1. 2vvm，溫度30°C -32°c ;第三天流加甲醇誘導劑8-15ul ;在第 3天、第5天、第7天、第9天每天流加補水500-1000ml，第5-8天每天流加濃度為5mg/l硫 酸銅溶液l_3ml，發酵周期為10-12天。
[0012] 本發明的具體技術內容還有：
[0013] 所述的表面活性劑選用吐溫-80,消泡劑選用泡敵。
[0014] 為縮短發酵周期，常見且優選的技術實現方式是，將血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus) CGMCC No. 2932保藏的試管斜面種子接入平皿，擴大培養后再接入搖瓶制成種 子液；將種子液接種至發酵罐無菌發酵培養基進行培養。
[0015] 其中較為優選的實現方式是，所述的擴大培養是將斜面菌種直接制成克氏瓶種 子。
[0016] 為進一步縮短培養周期，更為優選的實現方式是，擴大培養中克氏瓶培養基采用 如下方法制備：將麥芽汁培養基稀釋至12柏林，加入瓊脂15克。
[0017] 所述的擴大培養方法如下：將斜面菌種室溫活化2-4小時后接種至滅菌后的克氏 瓶培養基，在28°C -32°C條件在培養3-4天制成克氏瓶種子。
[0018] 本發明漆酶活力的測定是用2, 2'-連氮-雙- (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（英 文簡稱 ABTS) {2, 2，-azin〇-bis-[3-ethylthiazoline-6_sulphonate]}來測定的。一個酶 活力單位U的定義：在下述條件下，每分鐘內催化1 μ Μ底物的酶量。
[0019] 酶活力的計算公式為U = A · V/( ε · L · Τ)
[0020] 公式中：Α表示紫外分光光度計吸收值的變化
[0021] V表示反應體系的體積（單位：mL)，
[0022] ε = 3· 6X 104M · cnT1 = 36(μ mol/mir1 · cnT1，為氧化型 ABTS 的摩爾消光系數， L為比色皿的光徑（單位：cm)，T為反應的時間（單位：分鐘）。
[0023] 本發明中酶活力測定條件為：反應體積V = lmL，比色皿的光徑L = 0. 5cm，反應時 間T = 30秒，反應溫度為30°C。其中lmL反應體系內含有500μ L的50mM的酒石酸緩沖 液（pH = 4)，390 μ L水，100 μ L500 μ Μ的ABTS，10 μ L發酵液，選用波長為420nm。如果發 酵液含有漆酶活力太高，可適當稀釋。
[0024] 本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于：
[0025] 申請人:經過對血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus) CGMCCNo. 2932的發酵條件及 培養基組成進行科學的選配，在生產工藝上實現了漆酶在發酵罐上的穩定成功生產，漆酶 酶活可達344U/ml。所產酶系較純，酶的溫度穩定性好，pH適應性能好。該漆酶可廣泛應用 于染料降解、生物漂白、木材膠合、生態修復等領域，并對活性艷藍和靛藍有很好的褪色作 用。對活性艷藍5分鐘內脫色達到90%以上。木質素72小時的降解率達到60%，用于牛 仔褲水洗比化學法脫色，陳舊效果更好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1是本發明制備的發酵液過濾離心后的上清液進行SDS-凝膠電泳得到的圖譜。
[0027] 由圖譜可知，產酶酶系較單一。這在實際規模化生產中節約了大量分離純化成本。
[0028] 圖2是本發明所制備漆酶在常溫保存下的試驗結果。
[0029] 將制備的酶液置于30°C保存，分別在1、3、5、7、10、14、18、22、26、30(1測定酶活，由 圖2可見，酶在30°C條件下保存一個月，酶活損失4. 2%。說明其常溫穩定性很好。
[0030] 圖3是本發明所制備漆酶的高溫耐受測定結果。
[0031] 將制備的酶液置于70°C水浴，分別在5、10、15、30、60min測定酶活變化情況，由圖 3可見，酶液置于70°C水浴中1小時酶活損失15. 7%。表明酶的高溫穩定性較好。
[0032] 圖4是本發明所制備漆酶的pH穩定性測定結果。
[0033] 將濃縮后的酶液用 pH = 2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0 的緩沖液稀釋， 30分鐘測定酶活，由圖4可見，漆酶在pH = 2. 0-5. 5的緩沖液中失活不明顯，pH大于5. 5 后，活性下降較快。其pH穩定范圍為2. 0-5. 5。

【具體實施方式】
[0034] 以下結合實施例對本發明做進一步描述，但不作為對本發明的限定，本發明的保 護范圍以權利要求記載的內容為準，任何依據說明書做出的等效技術手段替換，均不脫離 本發明的保護范圍。
[0035] 本實施例的整體技術構思如下：
[0036] 利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法，包括在有氧及避光條件下，含有碳 源、氮源及無機組分的無菌發酵培養基中培養血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus)CGMCC No. 2932,還包括如下步驟：
[0037] 發酵培養基采用如下質量份數的組分組成：
[0038] 玉米粉20-40,麩皮粉3-10,酒石酸銨1-5,磷酸二氫鉀1-1. 5,七水合硫酸鎂 0. 2-0. 2,琥珀酸鈉0. 8-1. 0,五水合硫酸銅0. 15-0. 25,六水合氯化鉀0. 01-0. 05,七水合硫 酸鋅0· 01-0. 04,表面活性劑0· 1-0. 5,泡敵0· 01-0. 05,水1000, pH自然；
[0039] 發酵的條件是：
[0040] 接種量為8%-10%，0-3天：通風比為1:0.3-0.4-111，溫度301：-321：;4-6天：通 風比為 1:0. 7-0. 9vvm，溫度 30°C -32°c ;7-9 天：通風比為 1:1. 0-1. 4vvm，溫度 30°C -32°c ; 10-11天：通風比為1:1. 0-1. 2vvm，溫度30°C -32°c ;第三天流加甲醇誘導劑8-15ul ;在第 3天、第5天、第7天、第9天每天流加補水500-1000ml，第5-8天每天流加濃度為5mg/l硫 酸銅溶液l_3ml，發酵周期為10-12天。
[0041] 所述的表面活性劑選用吐溫-80。
[0042] 將血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus) CGMCC No. 2932擴大培養后制成種子液； 將種子液接種至無菌發酵培養基進行培養。
[0043] 所述的擴大培養是將斜面菌種制成克氏瓶種子。
[0044] 擴大培養中克氏瓶培養基采用如下方法制備：將麥芽汁培養基稀釋至12柏林，力口 入瓊脂15克。
[0045] 將斜面菌種室溫活化2-4小時后接種至滅菌后的克氏瓶培養基，在28°C -32°C條 件在培養3-4天制成克氏瓶種子。
[〇〇46] 申請人:對利用本實施例中的方法所得到的漆酶進行了如下試驗（試驗結果見附 圖說明）。
【權利要求】
1. 利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法，包括在有氧及避光條件下，含有碳 源、氮源及無機組分的無菌發酵培養基中培養血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus)CGMCC No. 2932,其特征在于還包括如下步驟： 發酵培養基采用如下質量份數的組分組成： 玉米粉20-40,麩皮粉3-10,酒石酸銨1-5,磷酸二氫鉀1-1. 5,七水合硫酸鎂0. 2-0. 2， 琥珀酸鈉〇. 8-1. 0,五水合硫酸銅0. 15-0. 25,六水合氯化鉀0. 01-0. 05,七水合硫酸鋅 0· 01-0. 04,表面活性劑 0· 1-0. 5,消泡劑 0· 01-0. 05,水 1000, pH 自然； 發酵的條件是： 接種量為8%-10%，0-3天：通風比為1:0.3-0.4-111，溫度301：-321：;4-6天 ：通風比 為 1:0. 7-0. 9vvm，溫度 3(TC -32°C;7-9 天：通風比為 1:1. 0-1. 4vvm，溫度 3(TC -32°C;10-11 天：通風比為1:1. 0-1. 2vvm，溫度3(TC-32? ;第三天流加甲醇誘導劑8-15ul ;在第3天、 第5天、第7天、第9天每天流加補水500-1000ml，第5-8天每天流加濃度為5mg/l硫酸銅 溶液l_3ml，發酵周期為10-12天。
2. 根據權利要求1所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法，其特征在于所 述的表面活性劑選用吐溫-80,消泡劑選用泡敵。
3. 根據權利要求1所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法，其特征在于還 包括如下工藝步驟：將血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus)CGMCC No. 2932擴大培養后制 成種子液；將種子液接種至無菌發酵培養基進行培養。
4. 根據權利要求3所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法，其特征在于所 述的擴大培養是將斜面菌種制成克氏瓶種子。
5. 根據權利要求4所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法，其特征在于所 述的擴大培養中克氏瓶培養基采用如下方法制備：將麥芽汁培養基稀釋至12柏林，加入瓊 脂15克。
6. 根據權利要求1或5中任一項所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發酵液的方法， 其特征在于所述的擴大培養方法如下：將斜面菌種室溫活化2-4小時后接種至滅菌后的克 氏瓶培養基，在28°C -32°C條件在培養3-4天制成克氏瓶種子。
【文檔編號】C12N9/02GK104099304SQ201410342986
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】章淑艷, 趙從波, 郭林, 秦艷梅, 李偉, 李軍, 王云鵬, 鄭翔, 李賓, 高慶華, 韓濤, 劉麗娜, 羅同陽, 薛剛 申請人:河北省微生物研究所, 中國科學院微生物研究所