一種檢測17α-羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測17α-羥化酶缺乏癥相關基因突變樣品制備試劑盒。具體的涉及一種應用大規模平行測序平臺技術檢測17α-羥化酶缺乏癥相關基因的產品，該試劑盒包括：：A.獨特設計并制備捕獲探針，針對基因CYP17A1全部外顯子片段；B.設計獨特帶有標簽序列的接頭；C.通用引物對探針序列進行PCR擴增；D.設計獨特的混合后目的片段的捕獲操作。這個方法和試劑盒制備的大規模平行測序平臺樣品通量大、效率高、操作簡便，極大地降低了測序檢驗成本。
【專利說明】一種檢測1 7 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學診斷和生物技術，涉及一種檢測17α-羥 化酶缺乏癥相關基因突變的體外診斷試劑盒，是一種應用于新一代測序平臺技術的一種檢 測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒?；驒z測：CYP17A1基因。 技術背景
[0002] 17 α-羥化酶缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳病，在中國報道的先天性腎上腺增 生中，并不是一種最少見的類型。臨床主要表現為低腎素性高血壓、低血鉀、女性性幼稚、原 發性閉經及男性假兩性畸形。
[0003] 發病機制：
[0004] 17 α-羥化酶是腎上腺和性腺中留體激素合成過程中的關鍵酶，在腎上腺和性腺 中表達[1]，該酶屬于混合功能氧化酶，兼有17α-羥化酶和17,20_裂解酶兩種活性。腎上 腺17 α -羥化酶缺乏可導致皮質醇分泌受阻，對垂體的負反饋抑制減弱，ACTH高分泌，刺激 11-去氧皮質酮和皮質酮產生增多，而去氧皮質醇發揮鹽皮質激素活性，使患者產生低腎素 性高血壓和低血鉀。性腺類固醇激素分泌降低在46, ΧΥ男性患者導致外生殖器男性化不 足，性腺發育障礙，而在46, XX女性則表現為原發性閉經，缺乏青春期發育。
[0005] 17 α-羥化酶缺乏癥是由于CYP17A1基因異常引起的17 α-羥化酶缺乏。CYP17A1 基因位于染色體10q24. 3,文獻報道的CYP17A1基因突變超過50種，可引起17 α -羥化酶 /17,20-裂解酶缺陷或單獨的17,20-裂解酶缺陷。其中，8號外顯子〇.1517_1525(^1缺失 突變和6號外顯子c. 985_987delinsAA突變是中國最常見的突變類型，據報道，大約90%的 患者包含上述至少一種突變。
[0006] 完全型17 α-羥化酶缺乏癥，即17 α-羥化酶/17, 20-裂解酶缺陷，其典型臨床表 現包括原發性閉經及青春期第二性征發育不良，患者有不同程度的高血壓，并且高血壓發 病年齡較早，藥物控制不佳，部分患者有疾病的家族史。血清雌二醇、睪酮、皮質醇和血鉀顯 著降低，而黃體生成素、卵泡刺激素和促腎上腺皮質激素均升高 [2]。
[0007] 對于不完全型17 α -羥化酶缺乏癥患者，他們受到性激素影響的程度不同，如46， XX患者在青春期可出現乳房發育、月經稀少或繼發性閉經、多發性卵巢囊腫等，血清孕酮或 17 α羥孕酮水平升高?；颊呖赡懿怀霈F低血鉀和高血壓[2]。
[0008] 對于17 α -羥化酶缺乏癥的鑒別診斷傳統的方法主要依靠生化檢查和影像學檢 查。血生化檢查：ACTH水平、血皮質醇、孕酮、24小時尿游離皮質醇水平、血鉀、促性腺激素、 性腺激素等。這些手段存在很大的缺點：如上所述.檢查種類繁多；操作起來.靈敏度和 特異度低；以上各項檢測任意一項都易受藥物和精神狀況等因素的影響；且對檢測時間要 求苛刻，不是隨時可接受檢查。
[0009] 基因診斷的優勢在于：
[0010] 1.方便，安全，快捷：僅抽取2-4毫升血；
[0011] 2.任何時間都可以檢查；
[0012] 3.不限制飲食，服藥，任何身體狀況都可以檢測；
[0013] 4.相比反復，多項傳統檢查，更為經濟；
[0014] 5.發病前，疾病極早期診斷的唯一方式；
[0015] 6.源頭確診，一次檢測，終身受益。
[0016] 這一切都揭示了基因診斷在臨床上有巨大的應用前景。
[0017] 近年，大規模 DNA 平行測序平臺（massively parallel DNA sequencing platform)已經發展為主流的測序技術，這項測序技術的出現不僅令DNA測序費用降到了 以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的"特權"能夠被眾多研究 人員分享。
[0018] 但是直接使用大規模DNA平行測序平臺檢測的成本目前仍然令個人難以承受。本 發明可以同時把多個甚至幾十病人的17 α-羥化酶缺乏癥相關基因精確的選擇性捕獲，然 后用于大規模測序平臺，可以極大地降低基因診斷的成本，使之廣泛應用于臨床成為可能。


【發明內容】

[0019] 本發明的目的是，提供一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的目標捕獲再 測序的試劑盒。該試劑盒提高了基因捕獲的通量和基因平行測序的通量，操作簡便、成本 低。
[0020] 為實現上述目的，本發明采用捕獲目的CYP17A1基因全部外顯子片段以及鄰近 50bp的非編碼區的探針；用于擴增待測片段的通用引物；測序接頭序列；緩沖液；dNTP ;高 保真聚合酶；鏈霉素磁珠。本發明采用的技術方案是：一種新的目標捕獲再測序方法，包括 以下步驟：
[0021] A.設計并制備用于捕獲17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的探針。并將這些探針 結合在磁珠、薄膜或者玻片上。探針序列見序列表。
[0022] Β.將待測基因 DNA樣品分別片段化至200-400bp，然后將末端補平，加入的ΑΤΡ使 片段兩端引入粘性末端。
[0023] C.分別加入Illumina公司Nextera?DNA Sample Prep Kit中設計好的一端帶有 標簽序列的接頭序列片段，加入連接酶，使每個片段都與的一對接頭連接，形成新的片段。
[0024] D.調節反應溫度激活DNA聚合酶，用一對Illumina公司Nextera? Index Kit-PCR primers通用引物，對步驟c所得不同基因組完成連接的片段序列混合后進行PCR 擴增反應；
[0025] E.將步驟d所得全部樣品的PCR擴增反應產物與步驟a所設計的捕獲探針雜交， 然后經過多次洗脫純化反應，得到待測片段。
[0026] F.將待測片段通過illumina公司Miseq測序儀的標準方案進行大規模平行測序。
[0027] G.將得到的測序結果同標準數據庫進行比較，得到診斷結果。
[0028] 為實現上述技術方案，步驟A所述的捕獲探針是脫氧核糖核酸（DNA)，或是核糖核 酸（RNA)組成，但不僅限于DNA和RNA。探針為120bp的與目標互補的片段組成。探針可以 是結合在磁珠上的，也可以結合在載玻片上，但不僅限于這些介質。鏈霉素磁珠材質是鋁鎳 鈷系永磁合金或是鋇鐵氧體、釹鐵硼永磁材料、釹鐵硼永磁材料、橡膠磁，但不僅限于這些 材質。
[0029] 其中，步驟A所述的捕獲探針，包括覆蓋以下基因 SCNN1B和SCNN1G全部編碼外顯 子片段和兩端50bp范圍內的序列。這些探針以疊瓦式設計，片段長度為50bp-180bp，最優 為75bp ;片段長度為60bp-200bp，最優為80bp ;片段長度為65bp-220bp，最優為85bp ;片段 長度為70bp-240bp，最優為90bp ;探針之間重疊部分為5-20bp，最優為8bp ;目標區堿基的 探針覆蓋度為IX至10X，最優為3X。
[0030] 本發明的主要優點在于：
[0031] 1.本發明可以在一次測序反應中同時進行多個不同來源樣本全部17α-羥化酶 缺乏癥相關基因的檢測；全部序列直接測出，準確率可以達到99. 99 %。
[0032] 2.本發明的試劑盒可以一次完成1-48個樣品的平行捕獲，提高了捕獲效率，極大 地降低了樣品準備的成本。
[0033] 3.本發明的試劑盒可以一次完成1-1152個樣品的全部Liddle' s相關基因，近 4000條序列的平行檢測，充分利用設備的高通量特性，極大降低了每個樣品的測序成本。
[0034] 4.本發明的試劑盒可以一次反應同時分辨錯義、插入和缺失突變。大大增加了臨 床檢出率和準確性。
[0035] 5.本發明的檢測方法步驟簡單，減少重復操作的環節，因而避免了復雜操作過程 中存在的諸多不確定引物，提高了檢測準確率和穩定性。
[0036] 6.本發明所提供的檢測方法所需時間大大少于sanger法的測序技術.
[0037] 實例：在完成同樣的檢測量（100人份的檢測量），sanger法需要2個人工同時工 作一周。我們的方法只需要一個人在一天內完成全部的檢測量。
[0038] 7.檢測的準確度大大優于基因芯片技術，更符合臨床檢測要求?；蛐酒荒軝z 測堿基錯義突變，而插入和缺失突變無法同時檢測。我們的方法可以同時檢測錯義、插入、 缺失和可變剪切的基因突變。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1為目標區域序列和探針。A是腺嘌呤；T是胸腺嘧啶；C是胞嘧啶；G是鳥嘌呤
[0040] 圖2為目標區域序列。
[0041] 圖3為目探針。
[0042]
[0043]
[0044]

【具體實施方式】 [0045]
[0046] 下面用實施例僅是對本發明實際應用的舉例描述，本發明的實際應用不僅限于以 下實施例：
[0047] 實施例一、
[0048] 一、探針設計：
[0049] 按表合成鏈霉素標記的探針。探針溶液采用agilent公司的SureSelect緩沖系 統體系。
[0050] 二、基因組提取：
[0051] 采用 Qiagen FlexiGene DNA Kit (Code No :51204)進行提取待測 96 份樣本的基 因組， 〇〇26〇/280 值達到1. 8-2. 0,各取l-3g做為起始模板。
[0052] 三、測序前樣品制備
[0053] 1.目的基因片段化：
[0054] 取定量過的270份基因組DNA，稀釋至20-35ng/L。取130L，用超聲破碎儀分別進 行片段化。
[0055] 2. AMpure XP 片段化選擇
[0056] 1.取96孔板，加入80-100L磁珠后，再加入樣品DNA，移液器反復吹打混勻；
[0057] 2.混合液 26°C 放置 5min ;
[0058] 3.將96孔板靜置在磁板上3min ;
[0059] 4.小心移取全部上清至新的孔中，小心不要碰到磁環；
[0060] 5.再在移至新孔的上清中加入100-150L磁珠，移液器反復吹打，充分混勻；
[0061] 6.混合液 26°C 放置 5min ;
[0062] 7.將96孔板靜置在磁板上3min，小心移去上清；
[0063] 8.加入70 %乙醇200L，靜置30s，小心移去上清；
[0064] 9.重復步驟8操作一次；
[0065] 10.將96孔板從磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分揮發；
[0066] 11.加入40L10mMpH = 8. OTris-HCl，移液器反復吹打混勻；
[0067] 12.將96孔板靜置在磁板上lmin，至溶液變清；
[0068] 13.小心移取上清至新的PCR管內，得到純化后的基因組DNA。
[0069] 3.末端平齊和純化
[0070] 1.取96孔板，按下表所示，在冰盒上加入各種試劑，保持冰浴狀態。
[0071]

【權利要求】
1. 一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒，其包括：捕獲目的CYP17A1 基因全部外顯子片段以及鄰近50bp的非編碼區的探針；用于擴增待測片段的通用引物；測 序接頭序列；緩沖液；dNTP ;高保真聚合酶；鏈霉素磁珠。
2. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"，全部 探針在3'采用生物素修飾。
3. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"這種 探針是寡聚核糖核酸（RNA)，或寡聚脫氧核糖核酸（DNA)，但是不僅限于RNA和DNA，可以包 括生物素、熒光或者同位素等修飾后的DNA或者RNA。
4. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"的探 針是結合在磁珠上的，或結合在載玻片上，但不僅限于這些介質。
5. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"的探 針針對目標區域以高密度疊瓦式設計，探針序列與SCNN1B、SCNN1G為互補序列。
6. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"探針 長度在50-180bp，最優為75bp。
7. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"探針 長度在60-200bp，最優為80bp。
8. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"探針 長度在65-2200bp，最優為85bp。
9. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"探針 長度在70-240bp，最優為90bp。
10. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"探針 重疊部分適宜范圍為5bp-20bp，最優為8bp。
11. 根據權利要求1所述"一種檢測17 α -羥化酶缺乏癥相關基因突變的試劑盒"鏈 霉素磁珠材質是鋁鎳鈷系永磁合金或是鋇鐵氧體、釹鐵硼永磁材料、釹鐵硼永磁材料、橡膠 磁，但不僅限于這些材質。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232753SQ201410347940
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月22日 優先權日:2014年7月22日
【發明者】劉哲 申請人:百世諾（北京）醫療科技有限公司