蘋果潛隱病毒和類病毒的多重rt-pcr檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種可同時檢測蘋果樹葉片、枝條、花和果實是否攜帶3種潛隱病毒(蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖溝病毒和蘋果莖痘病毒)和蘋果銹果類病毒屬3種類病毒(蘋果銹果類病毒、蘋果凹果類病毒、蘋果皺果類病毒)的多重RT-PCR檢測方法。利用該方法進行檢測，具有檢測結果易于判別、操作簡便、反應快速、靈敏度高等優勢，克服了現有技術中耗時、步驟繁瑣、條帶不易區分、靈敏度低等缺點，為蘋果病毒病的檢測提供了一種便于推廣應用的快速檢測方法。
【專利說明】蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及植物保護領域及分子生物學檢測領域，具體地說，涉及蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法。

【背景技術】
[0002]在蘋果栽培生產過程中，病毒病害一直是嚴重影響果品產量和品質的主要因素之一。蘋果樹被病毒侵染后，終生帶毒，病毒在樹體內增殖，干擾、破壞樹體的正常生理機能，導致長勢減退，產量下降，品質變劣，不耐貯藏，給我國的蘋果生產造成了嚴重的經濟損失。目前，我國已發現和鑒定的病毒主要包括:蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus, ACLSV)、蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)、蘋果莖痕病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)、蘋果鎊果類病毒(Apple scar skin viroid, ASSVd) >蘋果凹果類病毒(Apple dimple fruit viroid, ADFVd) ? 前 3 種(ACLSV、ASGV、ASPV)為潛隱性病毒，侵染蘋果樹不引起明顯癥狀，但導致樹勢衰弱，果實產量和品質嚴重下降；后2種(ASSVd和ADFVd)為類病毒，同為蘋果銹果類病毒屬(Apscarviroid)成員，在果實上表現銹果、花臉、凹陷等癥狀，嚴重降低果實經濟價值，甚至完全喪失經濟價值。ADFVd是于2013年在我國首次發現并報道的危險性類病毒，在我國蘋果主產區山東和新疆局部發生，但有快速蔓延趨勢。此外，日本學者報道了蘋果皺果類病毒(AFCVd)的發生和危害，盡管AFCVd還未在我國發現，因其危害嚴重，有必要進行監測。
[0003]與其他病害相比，蘋果病毒病的發生與危害有幾大明顯特點，一是多數為潛隱性發生，難以通過觀察癥狀判斷是否有病毒；二是類病毒對蘋果果實危害嚴重，在枝條和幼樹上無任何癥狀，經3~5年生長到了結果期，果實發病，果農損失慘重，所以育苗和生產中對蘋果銹果類病毒屬的3種類病毒應為零容忍；三是一旦被侵染，果樹將終生帶毒，受到長期且持續的危害；四是目前沒有有效的藥劑防治，特別是類病毒病發生后，應將病樹刨除。這些特點給病害的診斷和控制造成了困難，在蘋果嫁接生產過程中不能輕易分辨健康苗和帶毒苗，容易造成帶毒苗的亂用，使得后續病害大范圍快速擴散。為此，亟待開發一種簡單、快速、靈敏的檢測方法用于檢測蘋果樹和果實是否攜帶病毒和類病毒。
[0004]目前常見的檢測病毒的方法有2種，一是以ELISA為主的血清學檢測方法，因該方法靈敏度低，果樹病毒含量低，該方法不適合蘋果病毒的檢測；二是常規PCR方法，由于侵染蘋果的病毒種類多，需對每種病毒進行PCR檢測，操作繁瑣，耗時長，花費高。近些年逐漸發展起來的多重PCR(Multiplex Polymerase Chain React1n),由于可以在一個反應管中同時擴增多個序列，大大縮短了檢測時間，實現了對多種病毒的同步檢測，逐漸被廣泛用于病毒病的檢測工作中。相比常規PCR，多重PCR效率高，系統性強，節省了檢測成本與檢測時間，在果樹病害的檢測中多有報道，但沒有關于同時檢測3種潛隱病毒與蘋果銹果類病毒屬3種類病毒的相關文獻和專利。
【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測引物組合。
[0006]本發明的另一目的是提供含有上述引物組合的用于多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒的試劑盒。
[0007]本發明的再一目的是提供蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法。
[0008]為了實現本發明目的，首先參考現有文獻與GenBank中已報道的序列，篩選和設計多重RT-PCR引物，旨在使選擇的引物可以適用于我國現有已確定的蘋果所有潛隱病毒與類病毒，可特異地獲得目標片段，且各目標片段可以用瓊脂糖凝膠電泳清晰、明確地區分開。由于類病毒基因組較小(僅約330nt)，ASSVd、ADFVd、AFCVd同屬Apscarviroid，且蘋果栽培生產中，僅一種類病毒存在即引起嚴重危害，實際生產中不允許任一種類病毒存在，因此根據蘋果銹果類病毒屬3種類病毒設計通用引物檢測3種類病毒。
[0009]本發明的蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測引物組合，所述引物組合包括:
[0010]用于特異性RT-PCR檢測蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spotvirus, ACLSV)的引物對 I:
[0011]ACLSV-F5; -GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3'
[0012]ACLSV-R5; -AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3;
[0013]其中，N為A或 G，M為A或C;
[0014]用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving vir us, ASGV)的引物對II:
[0015]ASGV-F 5' -TGGAAACCGAGGATGGACAG-3;
[0016]ASGV-R 5' -CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3'；
[0017]用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)的引物對III:
[0018]ASPV-F 5' -GAAGTAATCGCATCATTCAC-3'
[0019]ASPV-R 5' -GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3';以及
[0020]用于特異性RT-PCR檢測蘋果銹果類病毒屬(Apscarviroid) 3種類病毒:蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid)、蘋果凹果類病毒(Apple dimple fruit viroid)和蘋果皺果類病毒(AFCVd)的通用引物對IV:
[0021]apscarviroids-F 5' -AGACCCTTCGTCGACGACGA-3'
[0022]apscarviroids-R 5' -TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3'。
[0023]為了減少假陽性的產生，加入了更加特異的EF-1 α作為內標基因。因此，所述引物組合中還包括用于特異性RT-PCR檢測內參基因ER-1 α的引物對V:
[0024]ER-1a-F 5' -TCATCATGAACCACCCCG-3'
[0025]ER-1a-R 5' -CCTGTCC AGAACCCAATTC-3'。
[0026]本發明還提供含有上述引物組合的用于多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒的試劑盒。
[0027]所述試劑盒還包括反轉錄酶、RNase抑制劑、DNase 1、DEPC水、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液等中的至少一種。更優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0028]本發明還提供所述試劑盒在多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒中的應用。
[0029]本發明進一步提供蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法，包括以下步驟:
[0030]I)提取待測蘋果樣品中的總RNA，反轉錄獲得第一條cDNA鏈；
[0031]2)以步驟I)中獲得的cDNA為模板，利用上述引物組合進行特異性PCR擴增反應；
[0032]3)分析PCR產物。若794bp處有條帶表明ACLSV為陽性，若666bp處有條帶表明ASGV為陽性，若346bp處有條帶表明ASPV為陽性，若220bp處有條帶表明apscarviroids為陽性。
[0033]前述的方法，步驟I)具體為:提取待測蘋果樣品中的總RNA，向反應管中加入蘋果樣品 RNA3.5μ L、10yM 隨機引物 0.5 μ LUO μ M Oligo dT0.5 μ L,5XM-MLV 酶緩沖液
4.0 μ LUOmM dNTPsl.0 μ L、RNA 酶抑制劑 0.5 μ L、200U/μ L M-MLV 反轉錄酶 0.5 μ L，加DEPC ddH20至總體積20 μ L，于42°C反應lh，即得第一條cDNA鏈。
[0034]其中，所述隨機引物為5' -d(NNNNNN)，N*A、G、C*T。
[0035]步驟2)中進行PCR擴增使用的PCR反應體系以25 μ I計為:
[0036]

【權利要求】
1.蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測引物組合，其特征在于，所述引物組合包括: 用于特異性RT-PCR檢測蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus)的引物對1:
ACLSV-F 5' -GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3'
ACLSV-R 5' -AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3' 其中，N為A或G，M為A或C; 用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving vir us)的引物對II: ASGV-F 5' -TGGAAACCGAGGATGGACAG-3'
ASGV-R 5' -CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3'； 用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus)的引物對III: ASPV-F 5' -GAAGTAATCGCATCATTCAC-3' ASPV-R 5' -GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3';以及 用于特異性RT-PCR檢測蘋果銹果類病毒屬(Apscarvi1id) 3種類病毒:蘋果銹果類病毒(Apple scar skin vi roid)、蘋果凹果類病毒(A pple dimple fruit viroid)和蘋果皺果類病毒(AFCVd)的通用引物對IV:
apscarviroids-F 5' -AGACCCTTCGTCGACGACGA-3'
apscarviroids-R 5' -TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3'。
2.根據權利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述引物組合中還包括用于特異性RT-PCR檢測內參基因ER-1 α的引物對V:
ER-1a-F 5' -TCATCATGAACCACCCCG-3' ER-1a-R 5' -CCTGTCCAGAACCCAATTC-3'。
3.含有權利要求1或2所述引物組合的用于多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒的試劑盒。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反轉錄酶、RNase抑制劑、DNase 1、DEPC水、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的至少一種。
5.根據權利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
6.權利要求3-5任一項所述試劑盒在多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒中的應用。
7.蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取待測蘋果樣品中的總RNA，反轉錄獲得第一條cDNA鏈； 2)以步驟I)中獲得的cDNA為模板，利用權利要求2所述引物組合進行特異性PCR擴增反應； 3)分析PCR產物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟I)具體為:提取待測蘋果樣品中的總RNA，向反應管中加入蘋果樣品RNA3.5 μ L、10 μ M隨機引物0.5 μ L、10 μ M OligodT0.5 μ L、5 XM-MLV 酶緩沖液 4.0 μ L、1mM dNTPs 1.0 μ L、RNA 酶抑制劑 0.5 μ L、200U/ μ LM-MLV反轉錄酶0.5 μ L，加DEPC ddH20至總體積20 μ L，于42°C反應lh，即得第一條cDNA鏈。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)中進行PCR擴增使用的PCR反應體系以25 μ I計為:cDNA 模板2.0μ1 1mM dNTPs0.5μ1 20μΜ ACLS^FΙ.Ομ! 20μΜ ACLSV-RΙ,ΟμΙ 20μΜ ASGV^FΙ.ΟμΙ
20μΜ ASGV-R1.ΟμΙ
20μΜ ASPV-F0.4μΙ
20μΜ ASPV-R0.4μ1
20μΜ apscarviroids-F0.5μΙ 20μΜ apscarviroids-R0.5 μL 20μΜ ER-1tt-F0.5μΙ 20μΜ ER-1a-R0.5μΙ SU/μΙ Taq DNA聚合轉0,5μΙ 10 X PCR反應緩沖液5.0μ1ddH20補足至 25μ1?PCR反應條件為:94°C 3分鐘；94°C 30秒，53°C 45秒，68°C 2分鐘，共35個循環；72°C 10分鐘。
10.根據權利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，待測蘋果樣品來自于蘋果的葉片、枝條、花或果實。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164517SQ201410347974
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】周濤, 郝璐, 陳善義, 范在豐, 國立耘, 葉婷 申請人:中國農業大學