利用基因芯片檢測小檗堿誘導RMMVECs基因表達譜的方法
【專利摘要】本發明提供一種利用基因芯片檢測小檗堿誘導RMMVECs基因表達譜的方法，包括以下步驟：(1)制備并純化大鼠心肌膜微血管內皮細胞RMMVECs；(2)培養二代RMMVECs，將小檗堿溶解于維持培養基中，濃度為10μg/ml，在37℃、5％CO2的條件下，將RMMVECs繼續培養9h；等九步步驟；本發明成功培養了RMMVECs，并且利用基因芯片技術從基因表達水平充分驗證了，提高微血管舒縮活動振幅的中藥有效成分Ast和Ber能雙向調節RMMVECs相關細胞因子的表達，維持細胞因子分泌的平衡，維持MVECs的正常生理功能，從而阻斷了致病因子對微血管內皮細胞的傷害，發揮治療疾病的作用。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程【技術領域】，尤其是涉及一種利用基因芯片檢測小檗堿誘導 RMMVECs基因表達譜的方法。 利用基因芯片檢測小檗堿誘導RMMVECs基因表達譜的方法
【背景技術】
[0002] 基因芯片（gene chip)又稱為DNA陣列，為生物芯片的一種，是指將大量DNA或寡 核苷酸探針密集排列形成的探針陣列。基因芯片的技術原理是DNA的堿基配對和互補，基 礎是雜交測序（SBH)。基因芯片采用光導原位合成或微量點樣的方法，將寡核苷酸或cDNA 有序地固化于支持物的表面，與已標記的待測生物樣品的cDNA或cRNA雜交，通過激光共 聚焦掃描等特殊設備對雜交信號的強度進行檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數量。從 二十世紀八十年代初SBH概念的提出，到目前的商品化基因芯片在這十幾年時間里，芯片 的制作技術不斷完善、芯片的概念不斷延伸、芯片的應用范圍不斷拓展，使得生物芯片技術 對二十一世紀生命科學和醫學的發展產生無法估量的影響。芯片所帶來的巨大學術價值、 社會價值和經濟價值引起了多家大公司及多國政府機構的極大興趣，并投以可觀的財力， 這又使芯片技術得以迅速發展。
[0003] 目前基因芯片按功能可以分為表達譜基因芯片和DNA測序芯片兩大類；按探針的 長短可分為長探針芯片和短探針芯片。
[0004] 基因芯片是后基因組時代一項重要技術，它的出現為中醫藥學的現代化提供了一 個很好的切入點，其特點是可以在同一時刻對成千上萬個基因的表達情況進行分析，形成 完整的細胞基因表達譜，解決了傳統中藥藥理研究方法周期長、耗時多、產出少的問題。微 血管內皮細胞能夠通過其分泌功能發揮信息的傳導和調節功能，保證血液與組織液之間、 血液與淋巴液之間以及血液本身的有形成分與血漿之間復雜的生理、生化以及血流動力 學的內環境平衡，同時分泌多種細胞因子和局部激素，參與一系列生理和病理過程。但是 在現今的微血管內皮細胞的相關研究領域中，基因芯片技術的應用還不是很普遍。張斌 等應用基因芯片技術分別檢測正常濃度和高濃度D-葡萄糖培養基中培養后內皮細胞的 基因表達譜。結果表明高糖可能通過影響微血管內皮物質代謝、信號轉導、細胞膜結構和 細胞外基質等的表達而導致血管內皮功能素亂，為進一步研究1?糖對微血管內皮細胞基 因表達譜的影響提供資料。ΥμΕ Fei等采用基因芯片技術研究了堿性成纖維細胞生長因 子（basic fibroblast growth factor, bFGF)對小鼠腦微血管內皮細胞（microvascylar endothelial cell, MVEC)株bEnd. 3中血管新生相關基因表達譜的改變，結果提示：bFGF具 有上調促血管新生基因表達，下調抑制血管新生基因表達的作用，兩者協同作用，促進血管 新生。
【發明內容】
[0005] 本發明解決的一個技術問題就是通過對小檗堿誘導體外培養的RMMVECs產生的 差異性基因表達譜的分析，來探討提高微血管舒縮活動振幅的分子機制，從基因表達水平 充分驗證了，提高微血管舒縮活動振幅的中藥有效成分Ber能雙向調節RMMVECs相關細胞 因子的表達，維持細胞因子分泌的平衡，維持MVECs的正常生理功能，從而阻斷了致病因子 對微血管內皮細胞的傷害，發揮治療疾病的作用。
[0006] 為了解決上述問題，本發明提供一種利用基因芯片檢測小檗堿誘導RMMVECs基因 表達譜的方法，包括以下步驟：
[0007] (1)制備并純化大鼠心肌膜微血管內皮細胞RMMVECs ;
[0008] (2)培養二代RMMVECs，將小檗堿溶解于維持培養基中，濃度為10 μ g/ml，在37°C、 5% C02的條件下，將RMMVECs繼續培養9h ;
[0009] (3)將RMMVECs充分裂解，提取總RNA ;
[0010] (4)純化、定量總RNA ;
[0011] ⑶反轉錄合成 First-strand cDNA ;
[0012] (6)合成 Second-strand cDNA ;
[0013] (7)體外轉錄合成cRNA ;
[0014] (8)cRNA 反轉錄；
[0015] (9)熒光標記后進行基因芯片雜交，最后進行數據分析。
[0016] 所述方法，步驟（1)中采用差速貼壁法對所制備的RMMVECs進行純化。
[0017] 所述方法，步驟（3)中充分裂解的方法為：將RMMVECs用37°C預熱的PBS清洗3 遍，加入2ml Trizol溶液，靜置5min，用移液槍吹打，使RMMVECs充分裂解，轉入離心管， 于-80°C冰箱保存待用；
[0018] 提取總RNA的方法為：將于-80°c冰箱保存的溶于Trizol液中的細胞樣品解凍， UOOOrpnufC離心5min，棄沉淀，將上清轉入一新的離心管內；按Trizol :氯仿為5 :1的體 積量加入氯仿，劇烈振蕩混勻至粉牛奶狀，室溫靜置3min，12000rpm，4°C離心15min，取上 清至一新離心管，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置5min，12000rpm，4°C離心15min，可見 白色RNA沉淀；棄去上清，緩慢地沿管壁加入75%乙醇lml，使沉淀懸浮于乙醇中，7500rpm， 4°C離心15min ;棄去上清，再加入75%乙醇lml，重復上步；而后吸去所有上清，待殘余乙醇 揮發盡后加入50 μ 1 DEPC水溶解RNA沉淀，-20°C冷凍保存。
[0019] 所述方法，步驟（5)中反轉錄合成First-strand cDNA的方法步驟為：
[0020] E.取總RNA 500ng，調整體積到4μ L ;
[0021] F.加入基因表達譜外參1 μ 1 ;
[0022] G.配制反轉錄Master Mix，其中 First Strand Β μ ffer Mix4 μ L，First Strand Enzyme Mix 1 μ L，輕輕混勻，短暫離心置于冰上；取配好的5 μ L Master Mix分別轉移至含 有總RNA樣品的0. 2mL離心管中；
[0023] H.輕輕混勻溶液，瞬時離心后42°C反應2小時；將PCR儀的熱蓋溫度也設置成 42°C,避免溶液蒸到管壁上；反應完后冰浴5分鐘。
[0024] 5、根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（6)中合成Second-strand cDNA的方法步驟為：
[0025] D.配制 Second-strand Master Mix,其中 Ν μ clease-free Water 13 μ L, Second-strand Buffer Mix 5 μ L，Second-strand Enzyme Mix 2 μ L，輕輕混勻，短暫離心 后冰浴；取上步反應完畢的樣品管中加入配好的20 μ L Second Strand Master Mix ;
[0026] Ε·輕輕混勻，16°C反應 1 小時，65°C lOmin ;
[0027] F.反應結束后將反應物置于冰上繼續合成反應，或者迅速凍存于_20°C。
[0028] 6、根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（7)中體外轉錄合成cRNA 的方法步驟為：
[0029] E. cRNA 合成：配制體外轉錄 Master Mix，其中 Νμ clease-free Water4 μ L，T7 B μ ffer Mix 20 μ L，T7 Enzyme Mix 6L，輕輕混勻，短暫離心，往上一反應中準備好的樣品 管中加入 30 μ L Master Mix ;
[0030] R輕柔混勻，40°C反應16. 5小時；
[0031] G.反應完成后，準備純化cRNA ;
[0032] Η·純化、定量 cRNA。
[0033] 所述方法，步驟（8)中cRNA反轉錄的方法步驟為：
[0034] A.取cRNA純化產物5 μ g，調整體積到7. 5 μ 1，加入到0. 2ml無核酸酶離心管中， 加入4 μ 1隨機引物，混勻，65°C反應5分鐘，冰浴5分鐘；
[0035] B.配制反轉錄Master Mix，其中4XCbcScript II Βμ ffer 5μ L，0. 1M DTT 2μ L， CbcScriptll 1.5yL，輕輕混勻，短暫離心；往反應完的樣品管中加入8. 5μ1 Master Mix ；
[0036] C.輕輕混勻，25°C反應10分鐘，37°C反應1. 5小時；
[0037] D.反應結束后加入 Terminate Sol μ tion 5 μ 1，混勻；
[0038] Β. (5) 65 °C反應10分鐘，室溫5分鐘；
[0039] E.加入 Ne μ tralize Sol μ tion 1 μ 1，混勻，準備純化；
[0040] F.純化、定量反轉錄產物。
[0041] 所述方法，步驟（9)中熒光標記的方法步驟為：
[0042] Ε.將純化后反轉錄得到的cDNA真空濃縮到14μ L，60°C，5min，加入4μ L隨機引 物，混勻；95 °C反應3分鐘，冰浴5分鐘；
[0043] F.反應結束后加入1 μ L Cy3 ;
[0044] G.配制 Mix，其中 5 XKlenow Β μ ffer 5 μ L，Klenow Fragment 1· 2 μ L，向上述混 合液中加入6. 2 μ L Mix，混勻，瞬離，37°C反應1. 5小時，70°C反應5分鐘，冰浴5分鐘，準備 純化；
[0045] H.純化、定量標記產物；
[0046] 所述方法，步驟（9)中基因芯片雜交的方法步驟為：
[0047] A.芯片的準備：
[0048] a.水合：已選定的芯片于65°C水浴鍋上離水面10cm左右，蒸10-15秒；瞭干10-15 秒，再蒸10-15秒；
[0049] b.紫外交聯：設置250 ;
[0050] c.第一遍洗：0· 5% SDS，微波爐加熱至42-45°C，搖床lOmin,洗去cy3 ;
[0051] d.第二遍洗：純水42°C，漂洗去SDS，轉入下一個洗片槽；
[0052] e.第三遍洗：純水42°C，搖床l_2min，將SDS洗去，甩干；
[0053] B.樣品的準備：
[0054] a.將cy3/cy5分別濃縮至19. 2 μ L左右，在cy3 (cy5)中加雜交液41. 6 μ L，再將 cy5(cy3)吸至cy3(cy5)中，混勻，震蕩，瞬離；
[0055] b.其中雜交液配制：甲酰胺 20yL，20*SSC 12yL，10*SDS 1.6yL，50*Dehart 8 μ L ；
[0056] c. 95°C，3min，期間剪1 X4cm濾紙，放入芯片盒中，加100-180 μ L蒸饋水，準備洗 液 l:600mL，洗液 2:1L ;
[0057] cL取出PCR管，驟冷，放入架子上，準備上樣；
[0058] e.用吸耳球吹吹芯片，加樣時靠左點成1.5cm左右的直線，然后用槍頭輔助將蓋 玻片蓋上；
[0059] f.用槍頭調整一下蓋玻片的整齊程度，放入芯片盒，放入雜交儀，配平，放一水瓶 保濕；設置：42°C，23小時，6轉，開始Hyb雜交，雜交23小時；
[0060] C.雜交結束準備讀片：雜交后洗片，掃描儀預熱lOmin，選擇小塊區域：power-80， PMT-800,先掃紅通道，再掃綠通道，保證飽和點（白點數）小于千分之5,掃描完成后，保存。
[0061] 所述方法，步驟（9)中數據分析的方法步驟為：用Lμ xScan 3. 0軟件將掃描圖像 轉化為信號值；根據探針信號值的P值確定基因表達（P值< 〇. 05)、臨界表達（0. 05 < P 值< 0. 065)和不表達（P值> 0. 065);分別對6張芯片的信號值做歸一化處理后，將6組 分別與空白組比較，判別某一基因是否發生表達變化：當信號比值> 2時，視為基因表達上 調；當信號比值< 〇. 5時，視為基因表達下調；當比值介于兩者之間時，視為基因未發生有 生物學意義的表達變化；最后用Microsoft Excel、S μ Μ和C1 μ ster等軟件對各組數據進 行統計和聚類分析。
[0062] 1(^8/!^的六8七和861'分別作用冊1^〇8 911后基因芯片結果顯示，各組與空白對 照組相比，差異表達基因數量如下：Ast組共2231個，其中上調2166個，下調65個；Ber組 共576個，其中上調513個，下調63個。結合pathway分析結果表明，Ast和Ber組中大多 數通路上有功能相近、差異表達卻相反的成對基因，說明兩者能雙向調節RMMVECs相關細 胞因子的表達。Ast和Ber組共同發生差異性表達的基因共47個，參與22個信號通路，包 括肌動蛋白細胞骨架調節、鈣信號通路、Notch蛋白介導的信號通路、緊密連接、粘著連接等 信號通路，涉及血管容量調節、N0合酶生物合成的調節，內皮細胞分化，細胞生長和維持，平 滑肌細胞的調節，蛋白質代謝與修飾，糖代謝，DNA復制等功能。
[0063] 本發明成功培養了 RMMVECs，并且利用基因芯片技術從基因表達水平充分驗證了， 提高微血管舒縮活動振幅的中藥有效成分Ast和Ber能雙向調節RMMVECs相關細胞因子的 表達，維持細胞因子分泌的平衡，維持MVECs的正常生理功能，從而阻斷了致病因子對微血 管內皮細胞的傷害，發揮治療疾病的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0064] 圖1為RMMVECS正常形態A :倒置顯微鏡鏡下照片（10X4) ;B :爾F-Ag免疫細胞 化學鑒定陽性結果（10X20);
[0065] 圖2為甲醛變性電泳的生物質量鑒定，其中：（1-6:對照組RMMVECs, 7-9:Ast處理 組 RMMVECs ; 10-12: Ber 處理組 RMMVECs ;上為 28S,下為 18S);
[0066] 圖3RMMVECS的Ast組比對照組組的信號散點圖；
[0067] 圖4RMMVECS的Ber組比對照組的信號散點圖；
[0068] 圖5RMMVECs的Ast組比對照組3個生物學重復的聚類圖；
[0069] 圖6RMMVECS的Ber組比對照組的3個生物學重復的聚類圖。
【具體實施方式】
[0070] 下文中將結合附圖對本發明的實施例進行詳細說明。需要說明的是，在不沖突的 情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。
[0071] 1.1主要儀器設備
[0072]
【權利要求】
1. 利用基因芯片檢測小檗堿誘導RMMVECs基因表達譜的方法，其特征在于：包括以下 步驟： (1) 制備并純化大鼠心肌膜微血管內皮細胞RMMVECs ; (2) 培養二代RMMVECs，將小檗堿溶解于維持培養基中，濃度為10μ g/ml，在37°C、5% C02的條件下，將RMMVECs繼續培養9h ; (3) 將RMMVECs充分裂解，提取總RNA ; (4) 純化、定量總RNA ; (5) 反轉錄合成 First-strand cDNA; (6) 合成 Second-strand cDNA ; (7) 體外轉錄合成cRNA ; (8) cRNA反轉錄； (9) 熒光標記后進行基因芯片雜交，最后進行數據分析。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1)中采用差速貼壁法對所制 備的RMMVECs進行純化。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（3)中充分裂解的方法為：將 RMMVECs用37°C預熱的PBS清洗3遍，加入2ml Trizol溶液，靜置5min，用移液槍吹打，使 RMMVECs充分裂解，轉入離心管，于-80°C冰箱保存待用； 提取總RNA的方法為：將于-80 °C冰箱保存的溶于Trizol液中的細胞樣品解凍， UOOOrpnufC離心5min，棄沉淀，將上清轉入一新的離心管內；按Trizol :氯仿為5 :1的體 積量加入氯仿，劇烈振蕩混勻至粉牛奶狀，室溫靜置3min，12000rpm，4°C離心15min，取上 清至一新離心管，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置5min，12000rpm，4°C離心15min，可見 白色RNA沉淀；棄去上清，緩慢地沿管壁加入75%乙醇lml，使沉淀懸浮于乙醇中，7500rpm， 4°C離心15min ;棄去上清，再加入75%乙醇lml，重復上步；而后吸去所有上清，待殘余乙醇 揮發盡后加入50 μ 1 DEPC水溶解RNA沉淀，-20°C冷凍保存。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（5)中反轉錄合成 First-strand cDNA的方法步驟為： A.取總RNA500ng，調整體積到4 μ L ; Β.加入基因表達譜外參1 μ 1 ; C. 配制反轉錄 Master Mix，其中 First Strand Buffer Mix4 μ L，First Strand Enzyme Mix 1 μ L，輕輕混勻，短暫離心置于冰上；取配好的5yL Master Mix分別轉移至含 有總RNA樣品的0. 2mL離心管中； D. 輕輕混勻溶液，瞬時離心后42°C反應2小時；將PCR儀的熱蓋溫度也設置成42°C， 避免溶液蒸到管壁上；反應完后冰浴5分鐘。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（6)中合成Second-strand cDNA的方法步驟為： A. 配制 Second-strand Master Mix，其中 Νμclease-free Water 13 μ L， Second-strand Buffer Mix 5yL，Second_strand Enzyme Mix 2μ?，輕輕混勻，短暫離心 后冰浴；取上步反應完畢的樣品管中加入配好的20 μ L Second Strand Master Mix ; B. 輕輕混勻，16°C反應1小時，65°C lOmin ; C.反應結束后將反應物置于冰上繼續合成反應，或者迅速凍存于-20°c。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（7)中體外轉錄合成cRNA的方 法步驟為： A. cRNA合成：配制體外轉錄Master Mix，其中Nyclease-free Water4yL，T7 Buffer Mix 20 μ L，Τ7 Enzyme Mix 6L，輕輕混勻，短暫離心，往上一反應中準備好的樣品管中加入 30 μ L Master Mix ； B. 輕柔混勻，40°C反應16. 5小時； C. 反應完成后，準備純化cRNA ; D. 純化、定量cRNA。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（8)中cRNA反轉錄的方法步驟 為： A. 取cRNA純化產物5 μ g，調整體積到7. 5 μ 1，加入到0. 2ml無核酸酶離心管中，加入 4 μ 1隨機引物，混勻，65°C反應5分鐘，冰浴5分鐘； B. 配制反轉錄 Master Mix，其中 4XCbcScript II Β μ ffer 5 μ L，0· 1M DTT 2 μ L， CbcScriptll 1.5yL，輕輕混勻，短暫離心；往反應完的樣品管中加入8. 5μ1 Master Mix ； C. 輕輕混勻，25°C反應10分鐘，37°C反應1. 5小時； D. 反應結束后加入Terminate Solution 5 μ 1，混勻； A. (5) 65°C反應10分鐘，室溫5分鐘； E. 加入 Neutralize Solution 1 μ 1，混勻，準備純化； F. 純化、定量反轉錄產物。
8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（9)中熒光標記的方法步驟為： Α.將純化后反轉錄得到的cDNA真空濃縮到14 μ L，60°C，5min，加入4 μ L隨機引物，混 勻；95 °C反應3分鐘，冰浴5分鐘； B. 反應結束后加入1 μ L Cy3 ; C. 配制Mix，其中 5XKlenow Buffer 5uL，Klenow Fragment 1.2uL，向上述混合液 中加入6. 2 μ L Mix，混勻，瞬離，37°C反應1. 5小時，70°C反應5分鐘，冰浴5分鐘，準備純 化； D. 純化、定量標記產物。
9. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（9)中基因芯片雜交的方法步 驟為： A. 芯片的準備： a. 水合：已選定的芯片于65°C水浴鍋上離水面10cm左右，蒸10-15秒；瞭干10-15秒， 再蒸10-15秒； b. 紫外交聯：設置250; c. 第一遍洗：0. 5% SDS，微波爐加熱至42-45°C，搖床lOmin，洗去cy3 ; d. 第二遍洗：純水42°C，漂洗去SDS，轉入下一個洗片槽； e. 第三遍洗：純水42°C，搖床l_2min，將SDS洗去，甩干； B. 樣品的準備： a. 將cy3/cy5分別濃縮至19. 2yL左右，在cy3(cy5)中加雜交液41.6yL，再將 cy5(cy3)吸至cy3(cy5)中，混勻，震蕩，瞬離； b. 其中雜交液配制：甲酰胺 20yL，20*SSC 12yL，10*SDS L6yL，50*Dehart 8yL; c. 95°C，3min，期間剪lX4cm濾紙，放入芯片盒中，加100-180 μ L蒸餾水，準備洗液 1:60〇11^，洗液2:比； d. 取出PCR管，驟冷，放入架子上，準備上樣； e. 用吸耳球吹吹芯片，加樣時靠左點成1.5cm左右的直線，然后用槍頭輔助將蓋玻片 蓋上； f. 用槍頭調整一下蓋玻片的整齊程度，放入芯片盒，放入雜交儀，配平，放一水瓶保濕； 設置：42°C，23小時，6轉，開始Hyb雜交，雜交23小時； C.雜交結束準備讀片：雜交后洗片，掃描儀預熱lOmin，選擇小塊區域：power-80， PMT-800,先掃紅通道，再掃綠通道，保證飽和點（白點數）小于千分之5,掃描完成后，保存。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（9)中數據分析的方法步驟 為：用L μ xScan3. 0軟件將掃描圖像轉化為信號值；根據探針信號值的P值確定基因表達 (P值< 0. 05)、臨界表達（0. 05 < P值< 0. 065)和不表達（P值> 0. 065);分別對6張芯片 的信號值做歸一化處理后，將6組分別與空白組比較，判別某一基因是否發生表達變化：當 信號比值彡2時，視為基因表達上調；當信號比值< 0. 5時，視為基因表達下調；當比值介 于兩者之間時，視為基因未發生有生物學意義的表達變化；最后用Microsoft Excel、Sy Μ 和Cl μ ster等軟件對各組數據進行統計和聚類分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087681SQ201410369360
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月30日 優先權日:2014年4月23日
【發明者】董虹, 張濤, 姜代勛, 胡格, 段慧琴, 穆祥, 陳武 申請人:北京農學院