一種極端耐熱l-天冬酰胺酶的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種極端耐熱L-天冬酰胺酶的應用，屬于熱加工食品安全及酶工程【技術領域】。使用極端耐熱L-天冬酰胺酶與傳統熱燙相結合的方式預處理薯條以降低薯條中丙烯酰胺的含量，具體為將薯條經熱燙處理，在熱燙處理液中加入極端耐熱L-天冬酰胺酶，濃度為1000-20000U/L，熱燙溫度為80℃，熱燙處理時間為1-15min。本發明將傳統熱燙和用極端耐熱L-天冬酰胺酶處理薯條相結合，在較短的時間內達到很好的丙烯酰胺的抑制效果，隨著極端耐熱L-天冬酰胺酶酶處理時間的延長，丙烯酰胺的含量緩慢減低，與不用極端耐熱L-天冬酰胺酶處理相比，丙烯酰胺含量可降低70%-83%。
【專利說明】一種極端耐熱L-天冬酰胺酶的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種極端耐熱L-天冬酰胺酶的應用，具體涉及一種用基因工程菌株 來生產所需要的酶，并應用于熱加工食品中作為丙烯酰胺的抑制劑，屬于熱加工食品安全 及酶工程【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 2002年，人們在富含淀粉類的油炸焙烤食品中檢測到相對較高含量的丙烯酰胺。 在烘烤或煎炸含淀粉食物的時候，這類食物中天然存在的氨基酸L-天冬酰胺會與還原糖 發生美拉德反應，而該反應使得淀粉類食物變脆且呈現出獨特的色澤、氣味。然而，反應 同時還會產生對人類來說是一種"潛在致癌物"的丙烯酰胺（Nature, 2002，419(6906): 448-449; Nature, 2002，419(6906): 449-450)。因此食品中出現的這種物質引起了人們 關于通過膳食攝入丙烯酰胺這種潛在危害健康的物質的激烈討論。至今已建立了許多國際 研究機構來調查和評估食品中丙烯酰胺的危害。根據已有的研究結果，WH0/FA0食品添加 劑聯合專家委員會（Joint FA0/WH0 Expert Committee on Food Additives, JECFA)建議 食品生產商采取適當的方式來降低食品中丙烯酰胺的含量。
[0003] 人們對減少食品中丙烯酰胺的含量做了大量的研究，主要可以從以下幾個方面入 手來減少丙烯酰胺的含量（J Sci Food Agric, 2014，94(1): 9-20; J Agric Food Chem, 2008，56(15): 6154-6161; JAgric Food Chem, 2013，61 (43)，10209-10214)。首先從 食品加工的原料控制丙烯酰胺的形成，通過篩選含有丙烯酰胺形成的主要前體物質L-天 冬酰胺和還原糖含量少的原料，可降低或消除產品中丙烯酰胺的含量。第二個方面是從食 品加工工藝控制丙烯酰胺的形成，加工溫度和時間是影響丙烯酰胺形成的兩個重要因素。 當加熱到120°C以上時往往容易產生丙烯酰胺，而且隨著加工溫度的升高，丙烯酰胺產生量 增加，溫度在140_180°C時丙烯酰胺的生成量最大。在加工過程中使用檸檬酸、富馬酸、蘋果 酸、琥珀酸、山梨酸、己二酸、安息香酸等以降低馬鈴薯的pH值，可減少丙烯酰胺的含量。在 食品原料中加入化學抑制劑也可以顯著降低食品中的丙烯酰胺的生成。以上方法最主要的 缺點就是對食品的產品特性影響較大，如組織結構，口味風味，色澤外觀等。L-天冬酰胺是 合成丙烯酰胺最重要的前體物質之一，降低原料中的L-天冬酰胺對抑制丙烯酰胺具有非 常重要的意義。
[0004] 目前，有少數學者和研究機構開展了利用L-天冬酰胺酶來控制高溫熱加工食品 中丙烯酰胺形成的研究。Amrein 等（J Agric Food Chem, 2004,52(13): 4282-4288)研 究了 L-天冬酰胺酶對姜汁面包中丙烯酰胺形成的影響，結果表明，在面團中添加 L-天冬酰 胺酶可使丙烯酰胺的含量減少55%，L-天冬酰胺酸降解了 75%，該方法對姜汁面包的口味和 色澤沒有不利影響。Ciesarovdi 等（Mol Nutr Food Res, 2009，53(12): 1532 - 1539) 研究了 L-天冬酰胺酶對以馬鈴薯為主要原料的高熱加工食品中丙烯酰胺含量的影響，發 現在馬鈴薯干粉中加入L-天冬酰胺酶，可使丙烯酰胺的含量減少約90%-97%。Pedreschi 等（LWT-Food Sci Technol，2011，44(6): 1473-1476)采用熱燙和 L-天冬酰胺酶浸泡 的方式處理馬鈴薯條，發現油炸后的馬鈴薯條中丙烯酰胺含量比對照樣降低了 60%。Kumar 等（Food Bioprocess Technol, 2014，7:741 - 748)用來源于L-天冬 酰胺酶處理小麥基質面團，酶添加量在300 U時，面包芯和面包皮中丙烯酰胺的減少量分別 達到73%，97%。在國內于2009年已批準諾維信公司的L-天冬酰胺酶（Acrylaway)在中國 市場使用，通過在面團攪拌時添加 Acrylaway，使天冬酰胺轉化為天冬氨酸，從根源上抑制 丙烯酰胺的形成，而其它的氨基酸和糖則保持原有的活性，仍然參與美拉德反應。試驗表 明，增加 Acrylaway的用量和延長作用時間，能使低糖餅干中丙烯酰胺的含量明顯減少。當 酶用量為300mg/kg，作用時間為15分鐘時，丙烯酰胺含量減少85% ;延長作用時間為30分 鐘時，低糖餅干中丙烯酰胺含量減少高達93%。而Acrylaway的使用不會影響面團特性、烘 焙過程及成品的外觀和口感。通過采用頂空氣相色譜法對產品揮發性香氣成分進行分析， 對照樣和添加 Acrylaway的樣本所含香氣成分的濃度相同，表明該酶對產品的風味沒有改 變。
[0005] 采用生物技術法去除原料中的L-天冬酰胺是目前用于控制高熱加工食品中丙烯 酰胺含量最有效的方法之一。L-天冬酰胺在L-天冬酰胺酶的作用下可生成L-天冬氨酸和 氨，而L-天冬氨酸在美拉德反應中僅生成極微量的丙烯酰胺，因此可以達到抑制丙烯酰胺 生成的目的。生物酶法可以從根源上抑制丙烯酰胺的生成，而且操作簡單易行，丙烯酰胺降 低幅度大，對生產工藝，產品外觀，風味口味以及營養等方面沒有改變。因此生物酶法是一 種值得推廣的用于控制食品中丙烯酰胺含量的有效方法。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種極端耐熱L-天冬酰胺酶的應用，抑制薯條中丙烯酰胺 的形成。
[0007] 本發明的技術方案，一種極端耐熱L-天冬酰胺酶的應用，作為油炸薯條中丙烯酰 胺的抑制劑。使用極端耐熱L-天冬酰胺酶與傳統熱燙相結合的方式預處理薯條以降低薯 條中丙烯酰胺的含量。
[0008] 將薯條經熱燙處理，在熱燙處理液中加入極端耐熱L-天冬酰胺酶，濃度為 1000-20000U/L，熱燙溫度為80°C，熱燙處理時間為l_15min。
[0009] 極端耐熱L-天冬酰胺酶的最適溫度在80°C以上，可以把傳統熱燙和用極端耐 熱L-天冬酰胺酶處理薯條相結合的方法，在較短的時間內達到很好的丙烯酰胺的抑制效 果。用三種不同的處理方式對薯條進行預處理，研究其丙烯酰胺含量的變化。當熱燙溫度 為80°C，對薯條進行不同時間的熱燙處理，可以發現隨著熱燙時間的增加丙烯酰胺的含量 緩慢降低，與不熱燙相比，熱燙l-l〇min，丙烯酰胺含量可以降低17%-39 %。在用極端耐熱 L-天冬酰胺酶處理的同時進行熱燙處理，當熱燙溫度為80°C處理1 min時，對薯條用不同 濃度的極端耐熱L-天冬酰胺酶處理發現，隨著熱燙液中極端耐熱L-天冬酰胺酶酶濃度從 1000U/L增大到20000U/L時，丙烯酰胺含量迅速降低，與不用極端耐熱L-天冬酰胺酶酶處 理相比，丙烯酰胺含量可降低28%-73%。在用極端耐熱L-天冬酰胺酶處理的同時進行熱燙 處理，當熱燙溫度為80°C，極端耐熱L-天冬酰胺酶酶濃度為10000 U/L時，隨著極端耐熱 L-天冬酰胺酶酶處理時間的延長丙烯酰胺的含量緩慢減低，與不用極端耐熱L-天冬酰胺 酶處理相比，丙烯酰胺含量可降低70%-83 %。
[0010] 本發明的有益效果：本發明將傳統熱燙和用極端耐熱L-天冬酰胺酶處理薯條相 結合，在較短的時間內達到很好的丙烯酰胺的抑制效果，隨著極端耐熱L-天冬酰胺酶酶處 理時間的延長，丙烯酰胺的含量緩慢減低，與不用極端耐熱L-天冬酰胺酶處理相比，丙烯 酰胺含量可降低70%-83%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1溫度和pH對極端耐熱L-天冬酰胺酶酶活的影響示意圖。
[0012] 圖2溫度對極端耐熱L-天冬酰胺酶熱穩定性的影響示意圖。
[0013] 圖3不同的熱燙時間對薯條中丙烯酰胺含量的影響示意圖。
[0014] 圖4不同極端耐熱L-天冬酰胺酶酶濃度處理薯條對其丙烯酰胺含量的影響示意 圖。
[0015] 圖5極端耐熱L-天冬酰胺酶處理不同時間對薯條中丙烯酰胺含量的影響示意圖。

【具體實施方式】
[0016] 實施例1極端耐熱L-天冬酰胺酶基因的克隆及異源表達 ziBigii AN1 TziAN_l中編碼極端耐熱L-天冬酰胺酶的核苷酸序列 已經被解析并且公布在GenBank上，其登錄號為WP_010478656. 1。首先合成編碼極端耐熱 L-天冬酰胺酶的目的基因，將此目的基因克隆到表達載體pET-22b (+)上，并且在載體DNA 序列的C末端融合6個組氨酸標簽構成重組質粒。將此重組質粒轉化到 BL21 (DE3)表達宿主中進行表達。含有重組質粒的萬.cWi在含有5(^g/mL的氨芐青霉素 的LB培養基中發酵培養(搖床轉速200 rpm，溫度37°C)，待菌密度0D_達到0. 6時加入異 丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)在28°C時誘導目的蛋白表達，繼續發酵培養6小時 離心收菌。
[0017] 實施例2極端耐熱L-天冬酰胺酶的表達純化及性質鑒定 收獲后的菌體加入懸浮液（50 mM Tris，100 mM NaCl，pH 7. 5)懸浮，用超聲細胞破 碎儀破碎，破碎后10000 rpm，4°C離心30 min取上清液用鎳親和層析純化。先用Binding buffer (50 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7.5)平衡柱子，上樣后用 Wash buffer (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 50 mM 咪唑，pH 7.5)洗脫雜蛋白，之后用Elution buffer (50 mM Tris，500 mM NaCl, 500 mM咪唑，pH 7. 5)洗脫目的蛋白。洗脫下的目的蛋白用透析液 (50 mM Tris, pH 7. 5)透析過夜，即得極端耐熱L-天冬酰胺酶。
[0018] 對純化后的重組極端耐熱L-天冬酰胺酶進行酶活測定。酶活測定條件如下，在 40〇μ?反應體系中含有50 mM Tris (pH 8. 5)，20 mM L-天冬酰胺，10 μ?酶液。在90°C進 行酶反應，反應2. 5 min后加入100 μ? 1.5 Μ三氯乙酸（TCA)終止酶反應。反應完成后 10000 rpm離心5 min。取100 PL反應液，加入1.4 mL去離子水，再加入200 PL Nessler 試劑震蕩，室溫下靜置10 min后在450 nm處測量吸光度值。1個酶活單位定義為在標準條 件下每分鐘釋放1 Mmol的氨所需要的加酶量。
[0019] 極端耐熱L-天冬酰胺酶的酶學性質： 將酶液分別在40、50、60、70、80、85、90、95°C，pH 8. 5的條件下進行酶反應，測定酶活， 以最高酶活為100%，得到不同溫度下的相對酶活，確定了極端耐熱L-天冬酰胺酶的最適溫 度為90°C (圖1(A))。將酶液分別用不同pH的緩沖液調節至pH 4.0-10. 0,在90°C下進行 酶反應，測定酶活，以最適pH下的最高酶活為100%，確定極端耐熱L-天冬酰胺酶的最適pH 為8.5(圖1 (B))。將酶液分別在70、80、85、90、95°〇下保溫2 11，每間隔半小時取樣一次， 在最適條件下測定殘余酶活，不溫浴的為空白對照酶活力為100%。在70、80、85°C條件下保 溫2h，殘余酶活均在70 %以上，在90、95°C條件下保溫2h，殘余酶活也在20%(圖2)。
[0020] 實施例3極端耐熱L-天冬酰胺酶酶法控制薯條中丙烯酰胺 較大個馬鈴薯（荷蘭7號，水分含量：74g/100g)購買于當地大型超市。把馬鈴薯清洗， 去皮，切成8X8mm的長條，立即將此長條浸沒在去離子水中lmin以除去粘附在薯條表面的 淀粉。之后對薯條進行三種不同的處理方式。
[0021] (1)不同的熱燙時間對薯條中丙烯酰胺含量的影響：將薯條浸沒在80°C去離子水 中，分別熱燙1，2，4，10 min。
[0022] (2)不同的極端耐熱L-天冬酰胺酶酶濃度對薯條中丙烯酰胺含量的影響：將薯條 浸沒在80°C極端耐熱L-天冬酰胺酶酶液中熱燙lmin，酶濃度分別為1000，2000，5000， 10000, 20000 U/L〇
[0023] (3 )極端耐熱L-天冬酰胺酶酶濃度一定時，研究了極端耐熱L-天冬酰胺酶酶處理 時間對薯條中丙烯酰胺的影響。固定極端耐熱L-天冬酰胺酶酶濃度為10000 U/L，酶處理 時間分別為1，2，4，8，15 min。
[0024] 所有處理過的樣品在85°C下干燥lOmin以控制水分含量，然后在175°C電炸鍋中 油炸5min左右，出鍋后浙去表面多余油脂，冷卻到室溫，然后提取丙烯酰胺進行分析。隨著 熱燙時間的延長薯條中丙烯酰胺的含量緩慢下降（圖3)。當熱燙溫度為80°C，熱燙10 min 時，與不熱燙相比可以把丙烯酰胺的含量從1592 Pg/kg降低到967 Pg/kg。隨著極端耐熱 L-天冬酰胺酶酶濃度的增加，薯條中丙烯酰胺的含量降低的較快（圖4)。當熱燙溫度為 80°C，極端耐熱L-天冬酰胺酶酶濃度為20000 U/L，處理時間為1 min時，可以把丙烯酰胺 的含量從1323 Pg/kg降低到353 Pg/kg。隨著極端耐熱L-天冬酰胺酶酶處理時間的延長， 薯條中的丙烯酰胺含量減小趨勢很慢（圖5)。當熱燙溫度為80°C，極端耐熱L-天冬酰胺 酶酶濃度為10000 U/L，處理時間從1 min增加到15 min時，丙烯酰胺的含量從396 Pg/kg 降低到232 Pg/kg。
【權利要求】
1. 一種極端耐熱L-天冬酰胺酶的應用，其特征在于：作為油炸薯條中丙烯酰胺的抑制 劑。
2. 根據權利要求1所述極端耐熱L-天冬酰胺酶的應用，其特征在于：使用極端耐熱 L-天冬酰胺酶與傳統熱燙相結合的方式預處理薯條以降低薯條中丙烯酰胺的含量。
3. 根據權利要求2所述極端耐熱L-天冬酰胺酶的應用，其特征在于步驟為：將薯條經 熱燙處理，在熱燙處理液中加入極端耐熱L-天冬酰胺酶，濃度為1000 -20000U/L，熱燙溫 度為80°C，熱燙處理時間為l_15min。
【文檔編號】A23L1/217GK104146270SQ201410369610
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】沐萬孟, 江波, 左少華, 張濤 申請人:江南大學