一種用于擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物的制作方法
【專利摘要】一種用于擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物：5′-AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3′，與通用引物中5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′配對使用能夠從各類樣品DNA中直接擴增出長度大約為1078p的嗜冷桿菌目的片段。本發明解決了目前缺乏引物從混合DNA樣品中直接擴增出嗜冷桿菌靶標序列的問題。
【專利說明】—種用于擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物，可用于對樣品中嗜冷桿菌的分子檢測。

【背景技術】
[0002]嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)細菌，分類于莫拉氏菌科(Moraxellaceae),包括靜止嗜冷桿菌(P.1mmobilis)、幾嗜冷桿菌(P.faecalis)、居冷嗜冷桿菌(P.frigidicola)、冷棲嗜冷桿菌(P.glacincola)等共9種細菌。該屬的菌株為革蘭氏陰性需養桿菌或球菌，其大小為(0.9-1.3)umX (1.5-3.8)um無動力，需氧，能夠在5°C下生長，一般在35_37°C范圍內不能生長，氧化酶和接觸酶均為陽性，因在低溫下生長良好而得名。主要分布于常冷的環境如南北兩極地區、高山、冰川、冷庫、深海和土壤等低溫環境中，它能通過特殊的生理機制適應環境溫度的變化，在對污水中油烴類，氯酚類等物質的生物降解、催化低溫發酵、表達熱不穩定蛋白質以及生產抗凍保護劑等方面有著廣泛的應用。
[0003]嗜冷桿菌的分離主要是依賴選擇性培養基分離培養的經典生物學方法，然后通過細菌生理生化特性進行分類鑒定。但該法分離周期長，工作量大且不易獲得目的功能菌株和純菌株，這使得嗜冷桿菌的發現和分離具有偶然性和隨機性，大大降低了挖掘這一特定種屬菌株資源的幾率。隨著分子生物學的飛速發展，基于PCR的分子檢測技術已在環境微生物研究中應用越來越普遍。通過對菌株進行DNA提取，使用細菌16srDNA通用引物27F/1492R擴增目的片段，測序可得知其基因序列，但該法的特異性不強，特別是多種菌共存的混合DNA樣品，尚無法用現有的引物對從混合DNA樣品中直接擴增出具有嗜冷桿菌(Psychrobacter)遺傳特性的16srDNA V3可變區域部分序列,給土壤中嗜冷桿菌的檢測研究帶來了困難。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種用于擴增嗜冷桿菌的特異性引物，以改進公知技術中存在的缺陷。
[0005]為實現上述目的，本發明提供的用于擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物為:5' -AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3'。
[0006]所述的特異性引物中，5' -AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3 '為正向引物；5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'為反向引物。
[0007]本發明的用于擴增嗜冷桿菌的特異性引物可以解決目前缺乏引物從混合DNA樣品中直接擴增出具有嗜冷桿菌(Psychrobacter)遺傳特性的16srDNA V3可變區域部分序列的問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為實施例1中PsyF/1492R引物對6種屬細菌DNA擴增產物的凝膠電泳圖。
[0009]圖2為實施例2中PsyF/1492R引物對土壤樣品DNA擴增產物的凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0010]本發明以特異性引物Y -AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3'(命名為PsyF)作為正向引物，與5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(通用引物中的1492R)為反向引物配對使用，即可從各類樣品DNA中直接擴增出長度大約為1078bp的嗜冷桿菌目的片段。
[0011]以下結合實施例進行說明，但本發明的技術方案不局限于以下所列舉的實施例，還包括個具體實施例間的任意組合。
[0012]實施例一
[0013]分別以嗜冷桿菌(Psychrobacter),黃桿菌(Flavobacterium),腸桿菌(Enterobacter),節桿菌(Arthrobacter),芽抱桿菌(Bacillus)和假單胞菌(Pseudomoans) 6個屬細菌DNA為模板進行引物PsyF/1492R的特異性驗證試驗。
[0014]PCR擴增體系為:25 μ L由0.5 μ L DNA模板(約1ng)、2.5 μ L正向引物PsyF(1pM)、2.5μ L 反向引物 1492R(1pM)、2.5μ L 1XPCR buffer(含 Mg2+)、2.Ομ LdNTP s (2.5mmol/L)、0.I μ L Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L)，滅菌雙蒸水補足 25 μ L。PCR 擴增反應條件為:預變性950C，5min,變性94°C Imin,退火50°C 50s,延伸72°C Imin,共30個循環，72°C延伸10min，4°C保存。
[0015]將本實施例擴增出的序列進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖1所示，圖1中M泳道為標準DL2000，1-6號泳道分別為含有嗜冷桿菌(Psychrobacter)、黃桿菌(Flavobacterium)、腸桿菌(Enterobacter)、節桿菌(Arthrobacter)、芽抱桿菌(Bacillus)和假單胞菌(Pseudomoans)DNA的擴增結果，7號泳道為不含DNA空白對照的擴增結果。從圖1中可以看出本實施方式用于擴增嗜冷桿菌的特異性引物PsyF/1492R能夠準確的擴增出嗜冷桿菌的靶標序列片段，而未能從近緣細菌DNA和空白對照中擴增出核酸片段。將I號泳道對應的序列片段與T載體連接后轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞測序，測序結果為:序列長度為1078bp,并且經blast分析,為嗜冷桿菌(Psychrobacter)的特異序列(參見嗜冷桿菌測序結果)。
[0016]實施例二
[0017]應用引物PsyF/1492R對6份低溫土壤樣品(由東北農業大學環境微生物實驗室提供)DNA進行PCR擴增試驗。PCR擴增體系為:25 μ L由0.5 μ L DNA模板(約1ng)、2.5 μ L正向引物 PsyF(1pM)、2.5μ L 反向引物 1492R (1pM)、2.5μ L 1XPCR buffer (含 Mg2+)、
2.Ομ L dNTP s(2.5mmol/L)、0.I μ L Taq DNA 聚合酶(5U/μ L)，滅菌雙蒸水補足 25 μ L15PCR擴增反應條件為:預變性950C 5min，變性94°C lmin，退火50°C 50s，延伸72°C lmin，共30個循環，72°C延伸10min，4°C保存。
[0018]將本實施方式擴增出的序列進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示，圖2中M泳道為標準DL2000，1-6號泳道分別為低溫土壤樣品DNA的擴增結果，7號泳道為不含DNA空白對照的擴增結果。從圖2中可以看出本實施方式用于擴增嗜冷桿菌的特異性引物PsyF/1492R能夠準確的從所有低溫土壤樣品DNA中擴增出嗜冷桿菌的靶標序列片段。隨機挑選I號和6號泳道對應的序列片段分別與T載體連接后轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞測序，測序結果為:序列長度為1078bp,并且經blast分析,為嗜冷桿菌(Psychrobacter)的特異序列(參見嗜冷桿菌測序結果)。
[0019]嗜冷桿菌測序結果

【權利要求】
1.一種用于擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物，其中，所述擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物為:5' -AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3'。
2.根據權利要求1所述的特異性引物，其中: 5' -AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3'為正向引物； 5' -GGTTACCTTGTTACG ACTT-3'為反向引物。
【文檔編號】C12R1/01GK104164499SQ201410369525
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月30日 優先權日:2014年7月30日
【發明者】趙越, 王佰潔, 魏自民, 趙昕宇, 張旭, 魏雨泉, 王雪芹 申請人:東北農業大學