耐熱中性纖維素酶Cel6C及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了耐熱中性纖維素酶Cel6C及其編碼基因和應用。本發明從特異腐質霉中分離得到耐熱中性纖維素酶編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID No.3所示，所編碼的氨基酸序列為SEQ ID No.4所示；本發明進一步提供了成熟耐熱中性纖維素酶，其氨基酸序列為SEQ ID No.2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。本發明還公開了含有所述編碼基因的重組表達載體和重組宿主細胞。本發明耐熱中性纖維素酶熱穩定性優良，在中性和堿性范圍內具有較高酶活力，可高效降解纖維素、半纖維素、地衣多糖、羧甲基纖維素鈉、大分子多糖、蛋白質或脂類等物質，能夠應用于釀酒、紡織、能源工業等領域。
【專利說明】耐熱中性纖維素酶Cel6C及其編碼基因和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及纖維素酶，尤其涉及從特異腐質霉（Humicola insolens)中分離的耐 熱中性纖維素酶Cel6C，本發明還涉及該酶的編碼基因及其應用，屬于纖維素酶的分離及應 用【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 纖維素是由葡萄糖以β_1，4糖苷鍵連接而成的線性大分子聚合物，為目前分 布最廣的天然碳水化合物，也是自然界中最豐富的可再生資源。纖維素酶是指能水解纖 維素 β_1，4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱。它是由內 切型β -1，4-葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 4,簡稱EG、CX酶、CMC酶）、外切型β -1，4-葡聚糖酶 (EC3. 2. I. 91，EC3. 2. 1. 176,簡稱 CBH、C1 酶、纖維二糖水解酶）及纖維二糖酶（EC3. 2. 1. 21， 簡稱CB、β-葡萄糖苷酶）3個主要成分組成的起協同作用的復合酶系（Juturu V and mi J C 2014. Renew Sust Energ Rev 33, 188-203)。
[0003] 內切型β -1，4-葡聚糖酶（EGs)以隨機的形式對纖維素聚合物內部的非結晶區進 行切割，產生不同長度的寡糖和新鏈末端。內切型β-1，4-葡聚糖酶是一類重要的工業酶 種，可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、洗漆等眾多領域（Phitsuwan P et al. 2013. Folia Microbiol 58, 163-176)。其中，高溫中性內切葡聚糖酶具有作用條件溫和，耐高溫的特點， 對于應用領域尤為重要，可廣泛用于生物質能源、紡織、食品、飼料和制藥行業等眾多領域。 在紡織工業中，中性纖維素酶在牛仔布生物石洗加工中具有重要的應用價值。在中性pH值 范圍內，纖維素酶對織物的作用非常柔和，不會破壞織物的硬度，表面活性劑在這個PH值 范圍也是最有效的，從而節約了牛仔布加工過程中的表面活性劑成本。另外，在中性纖維素 酶的作用條件下，還可以有效防止織物返染（Chen J et al. 2007. Enzyme and Microbial Technology 40,1651-1655)。在啤酒加工業中，β-葡聚糖酶能高效地將麥芽中的β-葡 聚糖水解為葡萄糖和低聚糖，摧毀細胞壁，使細胞內容物大量地釋放出來，提高麥汁得率， 降低醪液粘度從而縮短糖化醪過濾時間，所獲麥汁清亮，使制得的啤酒色澤淺，泡沫均勻持 久。因此，將β-葡聚糖酶用于啤酒糖化和發酵過程，可節約用糧，降低成本，提高糖化過 濾設備的效能，有利于啤酒的質量提高及穩定（宮春波，謝麗源.2002.廣州食品工業科 技）。但是，啤酒糖化階段，β -葡聚糖的溶出隨著溫度的升高而增多，造成低溫過程溶出的 β -葡聚糖比例較低，高溫過程溶出的比例較高，耐高溫的內切型β -葡聚糖酶是解決這一 問題的關鍵。
[0004] 因此，獲得新型具有中性、熱穩定性好等優良特性的纖維素酶的研究仍具有重大 意義。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種從特異腐質霉（Humicola insolens)中分 離的耐熱中性纖維素酶Cel6C，該酶熱穩定性優良并在中性和堿性范圍內具有較高酶活力。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：
[0007] 本發明首先公開了從特異腐質霉（Humicola insolens)中分離的耐熱中性纖維素 酶Cel6C的編碼基因，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、⑷或（e)所示：
[0008] (a)、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或
[0009] (b)、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或
[0010] (C)、與SEQ ID No. 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Ceiec的功能；或
[0011] (d)、與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且該 多核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；優選的，其與SEQ ID No. 1 所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有 耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；最優選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有98% 或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的 功能；或
[0012] (e)、在SEQ ID No. 1所示的多核苷酸的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代 或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有耐熱中性纖維素酶Ceiec 的功能。
[0013] 本發明還公開了所述編碼基因編碼的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其氨基酸序列為 (a)或（b)所示：
[0014] (a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；
[0015] (b)、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C功能的蛋白變體。
[0016] 本發明進一步公開了從特異腐質霉（Humicola insolens)中分離的耐熱中性纖維 素酶Cel6C的編碼基因，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、⑷或（e)所示：
[0017] (a)、SEQ ID No. 3所示的多核苷酸；或
[0018] (b)、編碼SEQ ID No. 4所示氨基酸的多核苷酸；或
[0019] (c)、與SEQ ID No. 3的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Ceiec的功能；或
[0020] (d)、與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且該 多核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；優選的，其與SEQ ID No. 3 所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有 耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；最優選的，其與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有98% 或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的 功能；或
[0021] (e)、在SEQ ID No. 3所示的多核苷酸的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代 或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有耐熱中性纖維素酶Ceiec 的功能。
[0022] 所述編碼基因編碼的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其氨基酸序列為（a)或（b)所示：
[0023] (a)、SEQ ID No. 4 所示的氨基酸；
[0024] (b)、將SEQ ID No. 4所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C功能的蛋白變體。
[0025] 本發明所述的蛋白變體可由遺傳多態性或人為操作產生，這些操作方法通常為本 領域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備耐熱中性纖維素酶Cel6C的氨基酸序列變體或 片段，其中用于誘變或改變多核苷酸的方法為本領域所習知。其中，保守的取代是將一種氨 基酸殘基替換成具有相似性質的另一種氨基酸。本發明所述的耐熱中性纖維素酶Cel6C及 其編碼基因包括天然存在的序列和變體兩種形式。"變體"意指基本相似的序列，對于多核 苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個或多個位點處一個或多個核苷酸的缺失、插入或/和 替換。對于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡并性而不改變編碼的氨基酸序列 的那些變體。諸如此類天然存在的變體可通過現有的分子生物學技術來鑒定。變體多核苷 酸還包括合成來源的多核苷酸，例如采用定點誘變所得到的仍編碼SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示的氨基酸的多核苷酸變體，或者是通過重組的方法（例如DNA改組）。
[0026] 本發明通過PCR的方法分離克隆了耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基因，DNA全序 列分析結果表明，含有信號肽序列的耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列全長1149bp，編碼 382個氨基酸和一個終止密碼子，其核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示，其所編碼的氨基酸序 列為SEQ ID No. 4所示；其N端18個氨基酸為其預測的信號肽序列，其氨基酸序列為SEQ ID No. 6所不，信號肽的編碼序列為SEQ ID No. 5所不。不含有信號肽的成熟的耐熱中性纖 維素酶Cel6C，其氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQ ID No. 1所 示。因此,成熟的耐熱中性纖維素酶Cel6C的理論分子量為40. OkDa。
[0027] 將耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列（SEQ ID No. 1所示）及推導出的氨基酸 序列（SEQ ID No. 2所不）在GenBank中進行BLAST比對，該基因與來源于Chaetomium atrobrunneum 的 glycoside hydrolase family 6protein 氨基酸序列一致性為 83%。說 明本發明分離的耐熱中性纖維素酶Cel6C是一種新的纖維素酶。
[0028] 本發明還公開了含有所述耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基因的重組表達載體， 所述重組表達載體優選為pPIC_cel6C。
[0029] 將本發明的耐熱中性纖維素酶Cel6C編碼基因插入到表達載體合適的限制性酶 切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選 的實施方案，優選為將本發明的耐熱中性纖維素酶編碼基因插入到質粒PPIC9上的EcoR I 和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調控，得到 重組酵母表達質粒pPIC_cel6C。
[0030] 另外，本領域技術人員可以將SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3所示的多核苷酸進行 優化以增強在重組宿主細胞或重組菌株中的表達效率。例如，可采用目標宿主細胞的偏愛 密碼子進行優化來合成多核苷酸以增強在目標宿主細胞中的表達效率。
[0031] 本發明還公開了含有所述重組表達載體的重組宿主細胞或重組菌株。
[0032] 其中，所述重組宿主細胞可為原核細胞或真核細胞；優選的，所述重組宿主細胞為 畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞中的任意一種，最優選為畢赤酵母細胞； [0033] 所述重組菌株選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬或甲基營養型酵母 菌株中的任意一種；其中，所述甲基營養型酵母菌株優選為畢赤氏酵母屬菌株。
[0034] 將所述多核苷酸或多肽引入重組宿主細胞的合適方法包括：電轉化法、原生質體 法、化學轉化法等，這些操作方法通常為本領域所了解。
[0035] 本發明還公開了一種制備所述耐熱中性纖維素酶Cel6C的方法，包括以下步驟：
[0036] (1)用含有所述耐熱中性纖維素酶Cel6C編碼基因的重組表達載體轉化宿主細 胞，獲得重組菌株；
[0037] (2)培養重組菌株，誘導耐熱中性纖維素酶Cel6C表達；
[0038] (3)回收并純化所表達的耐熱中性纖維素酶Cel6C。
[0039] 本發明構建獲得含有成熟耐熱中性纖維素酶編碼基因的重組質粒pPIC_cel6C并 轉化畢赤酵母GS115,獲得重組畢赤酵母菌株GS115/cel6C。耐熱中性纖維素酶Cel6C在畢 赤酵母中得到了分泌表達，表達量為37. 5U/mL。耐熱中性纖維素酶Cel6C的比活為378U/ mg 〇
[0040] 耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH和pH穩定性的測定結果表明，耐熱中性纖維 素酶Cel6C的最適pH為6. 5,在pH5. 0?9. 0有60%以上的相對酶活性。耐熱中性纖維素 酶Cel6C在pH 5. 0-11. 0之間均很穩定，在此pH范圍內處理60min后剩余酶活性在80%左 右，這說明此酶在中性和堿性范圍內具有較好的PH穩定性。耐熱中性纖維素酶Cel6C的最 適溫度及熱穩定性測定結果表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適溫度為70°C，有良好的 熱穩定性，在60°C下溫育lh，酶活力仍保留90%以上。
[0041] 經測定，以大麥葡聚糖為底物時耐熱中性纖維素酶Cel6C的Km值為I. 285mg/mL， 最大反應速度Vmax為752 μ mol/min · mg。
[0042] 不同金屬離子化學試劑對耐熱中性纖維素酶Cel6C酶活的影響測定結果表明，大 多數離子和化學試劑在濃度為ImM或者IOmM時耐熱中性纖維素酶Cel6C的活力沒有明顯 變化。但是Mn 2+、CTAB強烈抑制其活力；SDS可部分抑制其活性；Cu2+、Fe3+、Pb 2+在ImM時對 耐熱中性纖維素酶Cel6C的酶活力影響不明顯，而在濃度為IOmM時可部分抑制其活力。
[0043] 本發明分離的耐熱中性纖維素酶Cel6C除可作用于葡聚糖外，對于地衣多糖，羧 甲基纖維素鈉也有一定的降解作用。其對地衣多糖的降解能力相對于大麥葡聚糖的為 60. 5%，其對羧甲基纖維素鈉的降解能力相對于大麥葡聚糖的為13.6%。
[0044] 添加耐熱中性纖維素酶Cel6C對大麥麥芽汁黏度和過濾速度的影響測定結果表 明，添加100U的耐熱中性纖維素酶Cel6C酶液處理，其與對照比較，過濾速度提高19. 5%， 黏度降低7. 69%。
[0045] 本發明所述耐熱中性纖維素酶Cel6C具有良好的熱穩定性，在中性和堿性范圍內 依然保持較高酶活，能夠降解纖維素、半纖維素、地衣多糖、羧甲基纖維素鈉、大分子多糖、 蛋白質或脂類等物質；耐熱中性纖維素酶Cel6C或其編碼基因可應用于釀酒、紡織、能源工 業，纖維物質轉化為可發酵糖的過程。
[0046] 例如在紡織工業中，本發明耐熱中性纖維素酶Cel6C可用來處理棉、麻、粘膠等纖 維素織物，切斷毛茸、使織物表而光潔、色澤鮮艷，可提高抗起球性，也可進行柔軟整理，風 格特殊化整理等。
[0047] 在啤酒加工業中，耐熱中性纖維素酶Cel6C能高效地將麥芽中的β-葡聚糖水解 為葡萄糖和低聚糖，摧毀細胞壁，使細胞內容物大量地釋放出來，提高麥汁得率，降低醪液 粘度從而縮短糖化醪過濾時間，所獲麥汁清亮，使制得的啤酒色澤淺，泡沫均勻持久。
[0048] 在飼料工業，制備低纖維飼料時，本發明耐熱中性纖維素酶Cel6C能轉化粗飼料 如麥秸、殘木、麥糠、稻草、玉米芯等，把其中一部分粗纖維素轉化為單體糖、小分子蛋白、低 脂肪等，降低飼料中粗纖維含量，把大分子降解為更易消化的小分子物質。
[0049] 在造紙業方面，用本發明耐熱中性纖維素酶Cel6C處理熱紙漿，進行毛邊處理，可 提商紙的品質。
[0050] 本發明耐熱中性纖維素酶Cel6C其他很多方面的應用還有很多，不再一一列舉。
[0051] 本發明技術方案與現有技術相比具有以下有益效果：
[0052] 本發明的耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH為6. 5,在pH5. 0?9. 0有60%以上 的相對酶活性；在pH 5. 0-11. 0之間均很穩定，在此pH范圍內處理60min后剩余酶活性在 80%左右，說明此酶在中性和堿性范圍內具有較好的pH穩定性。耐熱中性纖維素酶Cel6C 的最適溫度為70°C，有良好的熱穩定性，在60°C下溫育lh，酶活力仍保留90%以上。本發 明的耐熱中性纖維素酶Cel6C能夠降解纖維素、半纖維素、地衣多糖、羧甲基纖維素鈉、大 分子多糖、蛋白質或脂類等物質，可應用于釀酒、紡織或能源工業等。
[0053] 本發明所渉及到的術語定義
[0054] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0055] 術語"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生 的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其 包括PNA(肽核酸）、在反義技術中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除 非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡 并密碼子取代）和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個 以上所選（或所有）密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡 并密碼子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))。
[0056] 術語"嚴謹雜交條件"意指在所屬領域中已知的低離子強度和高溫的條件。通常， 在嚴謹條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更高 (例如超過本底至少2倍）。嚴謹雜交條件是序列依賴性的，在不同的環境條件下將會不同， 較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴謹性或洗滌條件可鑒定與探針 100%互補的祀序列。對于核酸雜交的詳盡指導可參考有關文獻（Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, ^Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)〇 更具體的，所述嚴謹條件通常被選擇為低于特異序列在規定離子強度pH下的熱熔點（Tm) 約5-10°C。Tm為在平衡狀態下50%與目標互補的探針雜交到目標序列時所處的溫度（在指 定離子強度、PH和核酸濃度下）（因為目標序列過量存在，所以在Tm下在平衡狀態下50% 的探針被占據）。嚴謹條件可為以下條件：其中在PH 7. 0到8. 3下鹽濃度低于約I. OM鈉離 子濃度，通常為約〇· 01到I. OM鈉離子濃度（或其它鹽），并且溫度對于短探針（包括（但 不限于）10到50個核苷酸）而言為至少約30°C，而對于長探針（包括（但不限于）大于50 個核苷酸）而言為至少約60°C。嚴謹條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩定劑來實現。對 于選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。 例示性嚴謹雜交條件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培養；或5XSSC， 1% SDS，在65°C下培養，在0. 2XSSC中洗滌和在65°C下于0. 1% SDS中洗滌。所述洗滌可 進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。
[0057] 術語"重組宿主細胞株"或"宿主細胞"意指包含本發明多核苷酸的細胞，而不管 使用何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組 中。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。
[0058] 術語"啟動子"意指存在于目的基因編碼序列的上游，提供RNA聚合酶和正確轉錄 起始所必需的其它因子的識別位點，啟動或指導目的基因轉錄為mRNA。
[0059] 術語"可操作的連接"意指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作的連接的 元件可為鄰接或非鄰接的。
[0060] 術語"轉化"意指將異源性DNA序列引入到宿主細胞或有機體的方法。
[0061] 術語"表達"意指內源性基因或轉基因在細胞中的轉錄和/或翻譯。
[0062] 術語"比活力（性）"是酶純度的量度，意指單位重量的蛋白質中所具有酶的活力 單位數，一般用酶活力單位/mg蛋白質表示；一般來說，酶的比活力越高，酶越純。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0063] 圖1為重組畢赤酵母菌株GSl 15/cel6C發酵濕重及酶活測定；
[0064] 圖2為SDS-PAGE檢測純化的耐熱中性纖維素酶Cel6C ;其中，M為蛋白Marker ; Cel6C為耐熱中性纖維素酶Cel6C ;
[0065] 圖3為耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH ;
[0066] 圖4為耐熱中性纖維素酶Cel6C的pH穩定性；
[0067] 圖5為耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適溫度；
[0068] 圖6為耐熱中性纖維素酶Cel6C的熱穩定性。

【具體實施方式】
[0069] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0070] 1、試驗材料和試劑
[0071] 1.1菌株及載體
[0072] 特異腐質霉（Humicola insolens Y1CGMCC 4573)從中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心分發，其保藏號為：CGMCC No. 4573。畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株 GS115 購自于 Invitrogen 公司。
[0073] 1. 2酶類及其它生化試劑
[0074] 內切酶購自Fermentas公司，連接酶購自NEB公司。大麥葡聚糖購自Sigma公司， 其它都為國產試劑（均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0075] I. 3培養基
[0076] (I)Humicola insolens產孢培養基為馬鈴薯培養基：IOOOmL 200g 土豆煮汁，IOg 葡萄糖，25g瓊脂，ρΗ5· 0。
[0077] (2)Humicola insolens纖維素酶誘導培養基：30g/L麥麩、30g/L玉米芯粉、5g/ L (NH4) S04、lg/L ΚΗ2Ρ04、0· 5g/L MgSO4 · 7Η20、0· Olg/L FeSO4 · 7Η20、0· 2g/L CaCl2。
[0078] (3)大腸桿菌培養基1^:1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%似(：1，？!17.0。
[0079] (4)畢赤酵母發酵培養基：
[0080] PTM 微量鹽：0· 6 % CuSO4,0· 008 % NaI2,0· 3 % MnSO4,0· 02 % Na2MoO4,0· 002 % Η3Β03,0· 05% CoC12,2% ZnCl2,6. 5% FeS04,0. 5%硫酸（v/v)。
[0081] 酵母發酵基礎鹽培養基（FBSM) :0· 5% KH2PO4, 5% NH4H2PO4,1. 485% MgSO4,1. 82% K2SO4,0· 093% CaSO4,0· 15% K0H，0. 00011% Biotin，0· 44% PTM 微量鹽，2%葡萄糖。
[0082] 酵母發酵基礎鹽誘導培養基（FBM) :0· 5% KH2PO4, 5 % NH4H2PO4,1. 485% MgSO4, 1. 82% K2SO4,0· 093% CaSO4,0· 15% Κ0Η，0· 00011 % Biotin，0· 44% PTM微量鹽，0· 5% 甲醇。
[0083] Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（0· lmol/L ρΗ5· 2) :0· 2mol/L 磷酸氫二鈉 536ml，0· Imol/ L檸檬酸464ml，混勻后調pH至5. 2。
[0084] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書 進行。
[0085] 實施例1特異腐質霉（Humicola insolens)纖維素酶編碼基因 cel6C cDNA的克 隆
[0086] 提取特異腐質霉在纖維素酶誘導培養基上生長2d時的菌體的總RNA，將其反轉錄 得到 cDNA 后，以此為模板，利用特異性引物 cel6CF(5'-GGGAATTCGCTCCCAGCCCCAAGAGC-3'） 和 cel6CR(5' -GCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCAGAACTTGAAGATGG-3'），經 PCR 擴增得 到去除天然信號肽的耐熱中性纖維素酶基因 cel6C的cDNA片段，并克隆至pEASY-Blunt載 體，測序驗證。
[0087] DNA全序列分析結果表明，含有信號肽序列的耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列 全長1149bp，編碼382個氨基酸和一個終止密碼子，其核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示，其 所編碼的氨基酸序列為SEQ ID No. 4所示；其N端18個氨基酸為其預測的信號肽序列，其 氨基酸序列為SEQ ID No. 6所示，信號肽的編碼序列為SEQ ID No. 5所示。不含有信號肽 的成熟的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示，其編碼的核苷酸序 列為SEQ ID No. 1所示。因此，成熟的耐熱中性纖維素酶Cel6C的理論分子量為40. OkDa。
[0088] 將耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列（SEQ ID No. 1所示）及推導出的氨基酸 序列（SEQ ID No. 2所不）在GenBank中進行BLAST比對，該基因與來源于Chaetomium atrobrunneum 的 glycoside hydrolase family 6protein 氨基酸序列一致性為 83%。說 明耐熱中性纖維素酶Cel6C是一種新的纖維素酶。
[0089] 實施例2耐熱中性纖維素酶Cel6C的制備
[0090] 將實施例1克隆的不含有信號肽序列的耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列（SEQ ID No. 1所示）插入到畢赤酵母表達載體pPIC9上，使之位于α -因子信號肽下游，構建重 組表達質粒pPIC_cel6C。
[0091] 將表達載體PPIC9進行雙酶切（EcoR I+Not I)，同時將連接有不含信號肽序列的 耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列的克隆載體雙酶切（EcoR I+Not I)，切出目的片段與表 達載體PPIC9連接，獲得重組質粒pPIC-cel6C并轉化畢赤酵母GSl 15,獲得重組畢赤酵母菌 株 GS115/cel6C。
[0092] 取含有重組質粒的GSl 15菌株，先經FBSM培養基培養使其快速生長48h后，再經 FB頂培養基誘導培養108h。發酵過程中取樣測定菌體濕重及纖維素酶的活力，結果見圖1。 耐熱中性纖維素酶Cel6C的表達量為37. 5U/mL。發酵上清用0. 1 μ m濾膜過濾雜質，然后用 賽托利斯IOkD濾膜濃縮，濃縮液直接過Akta的His-Trap柱，收集酶活峰。SDS-PAGE結果 表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C在畢赤酵母中得到了分泌表達（圖2)。
[0093] 采用DNS法進行耐熱中性纖維素酶Cel6C的活性分析：在pH6. 0,60°C條件下， ImL的反應體系包括100 μ L適當的稀釋酶液（實施例2制備的耐熱中性纖維素酶Cel6C)， 900 μ L大麥葡聚糖底物（1 % )，反應lOmin，加入I. 5mL DNS終止反應，沸水煮5min。冷卻 后540nm測定OD值。1個酶活單位（U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出1 μ mol還原 糖的酶量。實驗結果表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C的比活為378U/mg。
[0094] 實施例3耐熱中性纖維素酶Cel6C的性質測定
[0095] 以實施例2純化的耐熱中性纖維素酶Cel6C為研究對象，對該酶的相關性質進行 測定。
[0096] 1、耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH和pH穩定性的測定
[0097] 將實施例2純化的耐熱中性纖維素酶Cel6C在不同的pH下進行酶促反應以測定 其最適pH。底物大麥葡聚糖，在不同pH的0. 2mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中70°C下 進行纖維素酶活力測定。結果（圖3)表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH為6.5,在 pH5. 0?9. 0有60%以上的相對酶活性。纖維素酶于上述各種不同pH的緩沖液中37°C處 理60min，再在pH6. 5緩沖液體系中70°C下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。結果（圖4) 表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C在pH 5. 0-11. 0之間均很穩定，在此pH范圍內處理60min 后剩余酶活性在80%左右，這說明此酶在中性和堿性范圍內具有較好的pH穩定性。
[0098] 2、耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適溫度及熱穩定性測定
[0099] 纖維素酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH6. 5)緩沖液體系 及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為纖維素酶在不同溫度（60°C、65°C和70°C )下 處理不同時間，再在70°C下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果（圖5)表明，耐熱 中性纖維素酶Cel6C的最適溫度為70°C。酶的熱穩定性實驗結果表明（圖6)，耐熱中性纖 維素酶Cel6C有良好的熱穩定性，在60°C下溫育lh，酶活力仍保留90%以上。
[0100] 3、耐熱中性纖維素酶Cel6C的Kni值的測定
[0101]用不同濃度的葡聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（PH6. 5)緩沖液體系 中，70°C下測定酶活性，計算出其Km值。
[0102] 經測定，以大麥葡聚糖為底物時的Km值為1.285mg/mL，最大反應速度V max為 752 μ mol/min · mg〇
[0103] 4、不同金屬離子化學試劑對耐熱中性纖維素酶Cel6C酶活的影響測定
[0104] 在酶促反應體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性 的影響，各種物質終濃度為ImM或者1〇禮。在70°C、pH6. 5條件下測定酶活性。
[0105] 結果表明（表I)，大多數離子和化學試劑在濃度為ImM或者IOmM時耐熱中性纖 維素酶Cel6C的活力沒有明顯變化。但是Mn 2+XTAB強烈抑制其活力；SDS可部分抑制其活 性；Cu2+、Fe3+、Pb 2+在ImM時對耐熱中性纖維素酶Cel6C的酶活力影響不明顯，而在濃度為 IOmM時可部分抑制其活力。
[0106] 表1不同金屬離子化學試劑對耐熱中性纖維素酶Cel6C酶活的影響

【權利要求】
1. 從特異腐質霉（Humicola insolens)中分離的耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基 因，其特征在于，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或 (b) 、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、與SEQ ID No. 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；或 (d) 、與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且該多核 苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；優選的，其與SEQ ID No. 1所示 的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱 中性纖維素酶Cel6C的功能；最優選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有98%或 以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功 能；或 (e) 、在SEQ ID No. 1所示的多核苷酸的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插 入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功 能。
2. 權利要求1所述編碼基因編碼的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其特征在于，其氨基酸序 列為（a)或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 2所示的氨基酸； (b) 、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C功能的蛋白變體。
3. 從特異腐質霉（Humicola insolens)中分離的耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基 因，其特征在于，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 3所示的多核苷酸；或 (b) 、編碼SEQ ID No. 4所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、與SEQ ID No. 3的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；或 (d) 、與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且該多核 苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；優選的，其與SEQ ID No. 3所示 的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱 中性纖維素酶Cel6C的功能；最優選的，其與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有98%或 以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功 能；或 (e) 、在SEQ ID No. 3所示的多核苷酸的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插 入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功 能。
4. 權利要求3所述編碼基因編碼的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其特征在于，其氨基酸序 列為（a)或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 4所示的氨基酸； (b) 、將SEQ ID No. 4所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C功能的蛋白變體。
5. 含有權利要求1或3所述編碼基因的重組表達載體。
6. 按照權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體優選為 pPIC-cel6C。
7. 含有權利要求5或6所述的重組表達載體的重組宿主細胞或重組菌株。
8. 按照權利要求7所述的重組宿主細胞或重組菌株，其特征在于：所述重組宿主細胞 為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞中的任意一種，優選為畢赤酵母細胞； 所述重組菌株選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬或甲基營養型酵母菌株 中的任意一種；其中，所述甲基營養型酵母菌株優選為畢赤氏酵母屬菌株。
9. 一種制備權利要求2或4所述耐熱中性纖維素酶Cel6C的方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 、用權利要求5或6所述的重組表達載體轉化宿主細胞，獲得重組菌株； (2) 、培養重組菌株，誘導耐熱中性纖維素酶Cel6C表達； (3) 、回收并純化所表達的耐熱中性纖維素酶Cel6C。
10. 權利要求1或3所述耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基因或者權利要求2或4所 述耐熱中性纖維素酶Cel6C在降解纖維素、半纖維素、地衣多糖、羧甲基纖維素鈉、大分子 多糖、蛋白質或脂類物質中的應用。
【文檔編號】C12N9/42GK104293812SQ201410528596
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月9日 優先權日:2014年10月9日
【發明者】張偉, 徐欣欣, 李金陽, 劉波, 張宇宏 申請人:中國農業科學院生物技術研究所