專利名稱：絲素載藥微球及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種載藥微球及其制備方法，特別涉及一種用蠶絲絲素制造 絲素載藥微球及其制備方法，屬于生物醫學技術領域，也屬于髙分子化學領 域。
背景技術：
將藥物以微粒、微囊、脂質體、白蛋白載體等形式引入體內，可以延長 藥物的半衰期，使之緩慢釋放或定時靶向釋放，提髙藥物的功效。載藥微球 的研究始于20世紀70年代中期，它是以天然的或合成的髙分子材料為載體 包裹或吸附藥物而制成的球形微粒，微球很小， 一般為1 500 Um，微 球的大小直接影響微球中藥物的利用度、微球的載藥量以及體內分布的耙向 性。載藥微球應用領域涉及農藥、紡織、化妝品、造紙、食品和生物醫學等。微球的制備根據載體材料和藥物的性質不同可以采用不同的微球制備方 法，有噴霧干燥法、相分離法等。其中噴霧干燥法，由于干燥溫度較髙，所 以其應用受到一定的限制，如蛋白類藥物、生長因長等。微球的制備中相分 離法應用較多，微球的載體材料有人工合成髙分子材料和天然生物髙分子材 料。人工合成的髙分子材料有聚酯、聚乳酸(PLA),聚乳酸-羥乙酸共聚物 (PLGA),聚丙烯酸樹脂(ACA)、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)及聚酰胺類 等；常用的天然生物髙分子材料有白蛋白、明膠、海藻酸鈉、殼聚糖等。人工合成髙分子材料雖然可通過精確調節組成比，使產品的重復性和力 學性以及其它雜質的殘留問題在生物安全日益嚴格的今天越來越被關注。近 年來，天然生物髙分子材料由于其獨特的生物相容性而頗受人們的關注，特 別是殼聚糖、海藻酸鈉都已部分進入臨床試驗研究。雖然殼聚糖的應用較為 廣泛，但殼聚糖溶液的制備必需要在酸性介質中進行，而其在酸性介質中易 溶解，對藥物的緩釋能力差，其次殼聚糖是甲殼素脫乙酰化的產物，它的一 些性能與脫乙酰度有關，使用不同的催化劑及不同的溶劑，可得到脫乙酰度 不同的殼聚糖，脫乙酰度不同其性能差異較大；殼聚糖載藥微球制備方法中采用的乳化一化學交聯法時，要使用化學交聯劑。海藻酸鈉一般做成海藻酸 鈉凝膠微球，但其載藥量不甚理想，而且我國對天然海藻酸缺乏純化和組成 鑒定技術。白蛋白載藥微球的制備主要采用乳化固化法，用加熱或化學交聯 的方法使液滴固化，由于溫度較髙使承載藥物受到限制，再因白蛋白的獲取 不易，這些因素均較大地制約了這些天然髙分子材料在生物醫藥載體材料方 面的應用。
由家蠶絲腺分泌的絲素蛋白是一種天然髙分子材料。由于這種蛋白對人 體無毒、無害、無免疫原性，許多研究已表明它可用作固定化酶載體材料、 生物傳感器、手術縫合線、生物酶防護劑、功能性細胞培養基質、抗血凝物 質、人工器官等。近年來，以絲素進行人工皮膚、化妝品和營養食品的原料 或作為固定化酶載體，或與其它天然生物材料構成藥物的復合載體等方面的 開發利用受到關注，特別是以絲素蛋白為藥物載體的研究在近年來尤為活躍， 用絲素蛋白作為藥物載體主要為膜、凝膠、粉末的形式，已有許多實驗充分 證實絲素蛋白是一種優良的生物載體材料。以絲素蛋白作為藥物載體具有其 他髙分子材料所沒有的優點，絲素蛋白來源廣泛，制備方便。公開號CN 1834240A公開了一種固定化酶的絲素納米顆粒及其制備方法，由于采用髙速 離心的方法將酶固定于絲素中，因此，固定的酶量很少，不適合普通藥物所 需的承載量。公開號CN1293952A的中國發明專利中，公開了殼聚糖與絲心蛋 白共混微球及其用途和制備方法，使用復合載體和交聯劑戊二醛，利用戊二 醛與殼聚糖和絲心蛋白交聯制得包藥微球，而戊二醛的交聯作用，對細胞的 繁殖和生物大分子的完整性有副作用。

發明內容
為了克服上述缺陷，本發明提供一種具有良好的生物相容性、載藥量高、 生產工藝簡單的及其制備方法。
實現本發明目的所采取的技術方案是提供一種絲素載藥微球，它以絲素 蛋白為載體，水溶性藥物為藥物模型；藥物被包埋在絲素微球的表層，載藥 量為2.5 8.5%，平均粒徑為5.84 86.27U m，不溶于水。
上述絲素載藥微球的制備方法，具體步驟如下(1) 將水溶性藥物均勻地溶于濃度為2.5 12% /wt的絲素溶液中；
(2) 將上述絲素溶液和藥物的混合液加入到以Span或卵磷脂為乳化劑 的油相中，油相為液體石蠟或植物油，乳化劑占乳液的比例為0.5 5%/wt， 以350 800 rpm速度攪拌乳化；
(3) 加入水溶性有機溶劑，按體積比有機溶劑為絲素溶液的1 6倍， 攪拌速度在100 rpm以上，處理時間為30 60分鐘，得到絲素載藥微球混合 液或懸浮液；
(4) 經離心除去上層液，獲得絲素載藥微球，再加入有機溶劑處理12 小時以上；
(5) 去除有機溶劑和殘留油相，離心洗滌、冷凍干燥或真空干燥后，得 到絲素載藥微球。
上述技術方案中，所述的有機溶劑為異丙醇、乙醇和丙酮。 本發明所提出的制備絲素載藥微球的方法，是一種油相分離、絲素蛋白 自組裝的方法。具體以再生絲素蛋白溶液為原料，先用含有一定量乳化劑的 油相通過攪拌將絲素分散成小液滴，形成乳白色乳液，再將一定量的有機溶 劑加入乳液中，誘導絲素蛋白質變性，形成結晶絲素顆粒，在絲素顆粒形成 過程中藥物被包埋在微粒的表層；對乳液進行離心分離，除去上層液，獲得 絲素微球，再加入有機溶劑對絲素微球進行處理，讓絲素蛋白進一步結晶， 使更多的藥物被包埋在微粒中；再離心分離并收集微球，加入有機溶劑離心 洗滌，反復2—3次，最后用去離子水離心洗滌，獲得濕態的絲素載藥微球， 經冷凍干燥或真空干燥，即得絲素載藥微球。微球的平均粒徑為5.84 86.27 ii m。
絲素蛋白是纖維蛋白，所以再生絲素直接在較高速度下攪拌易纖維化、 起泡。這種情形下即使加入有機溶劑雖然能誘導絲素蛋白結晶，但不能形成 均勾的絲素顆粒和藥物的包埋。本發明先在一定的攪拌速度和乳化劑的作用 下，油相將絲素藥液分散成微小的均勻的液滴，形成水/油型乳液；再在該乳 液中加入有機溶劑，促使絲素蛋白變性，水溶性絲素由無規巻曲和ci-螺旋結
構轉變成e-折疊結構，在形成結晶性絲素顆粒的同時，藥物逐漸被包埋，形
成水/油/水型復乳，通過離心分離獲得微米級絲素載藥微球，此時的微球載藥量低、因此必須再用有機溶劑對微球進行處理，才能獲得載藥量較髙的、 性能穩定的、不溶于水的絲素載藥微球。 本發明具有以下優點-
1. 利用乳化劑和攪拌作用，油相將絲素和藥物混合液分散成均勻的微小 液滴，利用有機溶劑與絲素溶液混合，使可溶性絲素蛋白從無規巻曲和a-螺 旋結構轉化為折疊結構。在形成結晶性絲素顆粒的過程中，藥物逐漸被包 埋，不使用交聯劑，但此時的載藥量低。為了獲得載藥量較高的絲素載藥微 球，又使用有機溶劑對初次獲得的微球進行處理，再進行洗滌分離獲得的微 球其載藥量髙達2. 5 8.5%，包埋率為41.46 99. 08%,電子顯微鏡觀察呈球 形、性能穩定，可長期在室溫下保存。
2. 由于在制備過程中不使用有毒的化學試劑，因此，得到的絲素載藥微 球對人體無毒、無害，且具有良好的生物相容性，是一種綠色環保產品。在 制備過程所用的有機溶劑在經過過濾或離心分離，其廢液可回收重蒸循環利 用。還由于產品的載體原料絲素，來源豐富，制取方便，制備產品的設備和 工藝簡單、可操作性強。因此，將具有廣闊的市場前景。


圖1是按本發明實例1方法得到的絲素載藥微球的電鏡照片圖。
具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發明作進一步的闡述。 實施例一
將種家蠶種繭繭殼120g加入到50倍量的0. 1%的碳酸鈉水溶液進行煮沸 30分鐘，取出用水洗滌干凈，重復以上操作1 2次，確保將絲膠全部脫除， 最后將脫膠后的絲素纖維用去離子水洗滌干凈后，在60C下烘干備用。
取上述脫膠的絲素纖維10g溶于100ml的氯化鈣/乙醇/水三元溶液(摩 爾比為1: 2: 8〉中，在70X:恒溫磁力攪拌溶解。將上述獲得的絲素溶液進 行透析、脫鹽、純化，得到濃度為2.5 3.5%的水溶性絲素溶液，濃縮成6% 水溶性絲素溶液。取占絲素總量9. 1%/wt的水溶性藥物地塞米松磷酸鈉加入上述濃度為 6%/wt的水溶性絲素溶液攪拌均勻后，加入到含有296(v/v)的Span-80的液 體石蠟中，在37"的環境條件下，600rmpr攪拌速度下攪拌20分鐘，形成水 /油型乳液，再加入2倍絲素體積的異丙醇后攪拌30分鐘，使絲素蛋白變性 生成結晶性絲素顆粒。經離心分離，除去上層液，再加入異丙醇對微球處理 24小時，使藥物進一步包埋絲素微粒的表層；再經離心分離，用異丙醇離心 洗滌，反復2 3次，最后用去離子水洗滌，將獲得的絲素載藥微球經真空干 燥或冷凍干燥，得到絲素載藥粉末。經檢測，載藥量為8.36%，包埋率99.08%，。
參見附圖2，圖為按本實例方法得到的絲素載藥微球的電鏡照片。由圖 2可知，絲素載藥微球的外形呈球形，平均粒徑為5.84 86.27ixm。
實施例二
將廢絲120g加入到50倍量的0. 1%的碳酸鈉水溶液進行煮沸30分鐘， 取出用水洗滌干凈，重復以上操作1 2次，確保將絲膠全部脫除，最后將脫 膠后的絲素纖維用去離子水洗滌干凈后，在60C下烘干備用。
取上述脫膠的絲素纖維20g溶于200ml的氯化鈣/乙醇/水三元溶液(摩 爾比為1: 2: 8)中，在72X:恒溫磁力攪拌溶解。將上述獲得的絲素溶液進 行透析、脫鹽、純化，得到濃度為2.5 3.5%的水溶性絲素溶液。
取占絲素總量16.7%/wt的水溶性藥物維生素C加入到上述濃度為2.5 3.5%/wt的水溶性絲素溶液中攪拌均勻后，再加到含有3% (v/v)的Span-80 的液體石蠟中，在37t:的環境條件下，在750rmpr攪拌速度下攪拌20分鐘， 形成水/油型乳液，再加入4倍絲素體積的異丙醇后攪拌30分鐘，使絲素蛋 白變性生成結晶性絲素顆粒。經離心分離，除去上層液，再加入異丙醇對微 球處理18小時，使藥物進一步包埋絲素微粒表層，再經離心分離，用異丙醇 離心洗滌，反復2 3次，最后用去離子水洗滌，將獲得的絲素載藥微球經真 空冷凍干燥，得到絲素載藥粉末。
經檢測，該絲素載藥微粒平均粒徑在5.84ii m，包埋率41.46%,載藥量 6.91%。。實施例三
將廢絲60g加入到50倍量的0. 1%的碳酸鈉水溶液進行煮沸30分鐘，取 出用水洗滌干凈，重復以上操作1 2次，確保將絲膠全部脫除。最后將脫膠 后的絲素纖維用去離子水洗滌干凈后，在60^C下烘干備用。
取脫膠的絲素纖維10g溶于100ml的9. Omol/L的BrLi溶液中，在70 C恒溫磁力攪拌溶解。將上述獲得的絲素溶液進行透析、脫鹽、純化，得到 濃度為2.5 3.5%的水溶性絲素溶液。
取占絲素總量9.0%/wt的水溶性激素類藥物加入上述濃度為2.5 3.596/wt水溶性絲素溶液攪拌均勻后，再加到含有0.8% (v/v)卵磷脂的橄欖 油中，在371C的環境條件下，在650rmpr攪拌速度下攪拌30分鐘，形成水/ 油型乳液，再加入4倍絲素體積的丙酮后攪拌30分鐘，使絲素蛋白變性生成 結晶性絲素顆粒。經離心分離，除去上層液，再加入丙酮對微球處理20小時， 使藥物進一步包埋絲素微粒表層，再經離心分離，用異丙醇離心洗滌，反復2 3次，最后用去離子水洗滌，將獲得的絲素載藥微球經真空冷凍干燥，得到絲 素載藥粉末。
經檢測，該絲素載藥微粒平均粒徑在9.96ii m，包埋率75.59%，載藥量 6. 87%。
實施例四
將繭衣50g加入到50倍量的0. 1%的碳酸氫鈉水溶液進行煮沸30分鐘， 取出用水洗滌干凈，重復以上操作1 2次，確保將絲膠全部脫除。最后將脫 膠后的絲素纖維用去離子水洗滌干凈后，在60"C下烘干備用。
取上述脫膠的絲素纖維10g溶于100ml的10.0mol/L的BrLi溶液中， 在75C恒溫磁力攪拌溶解。將上述獲得的絲素溶液進行透析、脫鹽、純化， 得到濃度為2.5~3.5%的水溶性絲素溶液。
取占絲素總量10%/wt的水溶性消炎類藥物加入上述濃度為2.5 3.5%/wt的水溶性絲素溶液攪拌均勻后，再加到含有1.0% (v/v)卵磷脂的橄 欖油中，在37C的環境條件下，在720r即r攪拌速度下攪拌20分鐘，形成 水/油型乳液，再加入4倍絲素體積的乙醇后攪拌30分鐘，使絲素蛋白變性生成結晶性絲素顆粒。經離心分離獲得濕絲素微粒，再加入乙醇對微球處理
22小時，使藥物進一步包埋絲素微粒表層，再經離心分離，用異丙醇離心洗 滌，反復2 3次，最后用去離子水離心洗滌1次，將獲得的絲素載藥微球經 真空冷凍干燥，得到絲素載藥粉末。
經檢測，這種絲素載藥微粒平均粒徑在5.86iim,包埋率86.46%,載藥 量7. 85%。
權利要求
1.一種絲素載藥微球，其特征在于它以絲素蛋白為載體，水溶性藥物為藥物模型；藥物被包埋在絲素微球的表層，載藥量為2.5～8.5％，平均粒徑為5.84～86.27μm，不溶于水。
2. —種制備絲素載藥微球的方法，其特征在于具體步驟如下(1) 將水溶性藥物均勻地溶于濃度為2.5 12% /wt的絲素溶液中；(2) 將上述絲素溶液和藥物的混合液加入到以Span或卵磷脂為乳化劑的 油相中，油相為液體石蠟或植物油，乳化劑占乳液的比例為0.5 5%/wt，以 350 800 rpm速度攪拌乳化；(3) 加入水溶性有機溶劑，按體積比有機溶劑為絲素溶液的1 6倍，攪 拌速度在100 rpm以上，處理時間為30 60分鐘，得到絲素載藥微球混合液 或懸浮液；(4) 經離心除去上層液，獲得絲素載藥微球，再加入有機溶劑處理12小 時以上； (5) 去除有機溶劑和殘留油相，離心洗滌、冷凍干燥或真空干燥后，得 到絲素載藥微球。
3. 根據權利要求2所述的一種制備絲素載藥微球的方法，其特征在于 所述的有機溶劑為異丙醇、乙醇和丙酮。
全文摘要
本發明公開了一種載藥微球及其制備方法，屬于生物醫學技術領域。它采用水/油/水型的復乳技術和蛋白質的自組裝技術，將水溶性藥物與再生絲素溶液充分混合后，加入到攪拌中含有一定量乳化劑的油相中乳化，再加入有機溶劑攪拌，使絲素變性和結構β化而形成乳白色結晶性絲素微粒的同時，藥物被包埋，經離心除去上層液再加入有機溶劑，讓絲素蛋白進一步結晶，藥物繼續被包埋，再離心除去溶劑和殘留油相并收集微球。這種絲素載藥微粒平均粒徑在5.84～86.27μm之間，包埋率為42～99％，載藥量為2.5～8.5％；可適合不同用途的要求，具有廣泛的應用前景。
文檔編號A61K47/42GK101244277SQ200810018509
公開日2008年8月20日 申請日期2008年2月14日 優先權日2008年2月14日
發明者吳海燕, 李明忠, 謝瑞娟 申請人:蘇州大學